張安世，張素敏，范定臣，劉 瑩

(1.焦作師范高等專科學校 理工學院，河南 焦作 454000； 2.焦作市園林養(yǎng)護所，河南 焦作 454000； 3.河南省林業(yè)科學研究院，河南 鄭州 450008)

皂莢種質資源SRAP遺傳多樣性分析及指紋圖譜的構建

張安世1，張素敏2，范定臣3，劉 瑩1

(1.焦作師范高等?？茖W校 理工學院，河南 焦作 454000； 2.焦作市園林養(yǎng)護所，河南 焦作 454000； 3.河南省林業(yè)科學研究院，河南 鄭州 450008)

利用SRAP標記技術對18份皂莢種質材料進行了遺傳多樣性分析。結果表明，從64對SRAP引物中篩選了17對引物進行PCR擴增，共擴增出222個條帶，其中多態(tài)性條帶213個，多態(tài)性比率為95.95%。各引物多態(tài)性信息含量(PIC)、觀測等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)和Shannon’s信息指數(shù)(I)的平均值分別為0.861 1、1.962 3、1.415 3、0.257 2和0.406 6，18份皂莢種質資源間遺傳相似系數(shù)(GS)為0.522 5～0.955 0。UPGMA聚類分析表明，在遺傳相似系數(shù)為0.66處可將18份皂莢種質資源分為3組，其中，野皂莢單獨為1組，山皂莢和皂莢-T聚為1組，其他皂莢材料聚為1組。利用4對引物擴增的9個多態(tài)性位點構建了18份皂莢種質資源的DNA指紋圖譜，可以將其區(qū)分并精準鑒定。該研究結果將為皂莢種質的鑒定、保存和新品種選育提供一定的理論依據(jù)。

皂莢；SRAP；DNA指紋圖譜；遺傳多樣性

皂莢(GleditsiasinensisLam.)屬豆科蘇木亞科皂莢屬(GleditsiaLinn.)植物，為中國特有種，廣泛分布于我國東北、華北、華東、華南等地，是經(jīng)濟林、用材林、防護林及園林綠化的理想樹種[1-2]，兼有多種優(yōu)良的生態(tài)、經(jīng)濟和社會性能。皂莢還是優(yōu)良的中藥材和工業(yè)原料[3]，皂莢、皂刺、皂根、皂葉均可入藥，具有很高的經(jīng)濟價值和藥用價值。目前國內外對皂莢的研究主要集中在皂莢果實與皂刺的活性成分[4-5]、引種栽培[6]、生態(tài)屬性[2]及遺傳學[7-9]等方面，分子標記技術也已開始在皂莢研究中應用。邢俊連等[10]利用已公布的皂莢轉錄組數(shù)據(jù)設計得到6 494條EST-SSR特異性引物，并對其中部分引物進行了PCR擴增實驗，結果證實這些引物在其近緣種間具有很高的通用性。李偉等[11]利用AFLP分子標記技術對10個南方皂莢群體進行了遺傳多樣性研究，具體分析了皂莢群體遺傳結構形成的原因，并提出了皂莢的保護策略。

SRAP即相關序列多態(tài)性擴增(Sequence-related amplification polymorphism)，是由Li等[12]開發(fā)的一種新型分子標記技術。該技術針對真核基因中外顯子、內含子及啟動子的序列差異，巧妙地設計出2套特異性引物，可有效地對開放閱讀框(open reading frames，ORF)進行PCR擴增。由于被擴增區(qū)域為真核基因的ORF，其本身可能是目的基因的一部分或與目的基因緊密連鎖，因而能對性狀進行有效跟蹤[13]。SRAP標記在操作上類似于隨機擴增多態(tài)性DNA標記(random amplified polymorphic DNA，RAPD)，但其穩(wěn)定性遠優(yōu)于RAPD技術，同時還克服了SSR技術(simple sequence repeats)標記引物開發(fā)的費時費力以及擴增片段長度多態(tài)性技術(amplified fragment length polymorphism，AFLP)復雜、成本昂貴等缺點[14]，它提供的信息比其他標記更接近于形態(tài)學性狀的差異[15]。目前，SRAP標記已廣泛應用于植物的遺傳多樣性分析、品種鑒定、遺傳圖譜繪制等研究中[16-18]。

本試驗所選用的材料除野皂莢、山皂莢和皂莢-T為實生苗外，其余的15份材料是以單株產(chǎn)量高、單刺(或單果)平均質量高的植株為接穗、野皂莢為砧木嫁接而獲得的無性系，其中部分品種已經(jīng)通過河南省林木品種審定委員會審定。另外皂莢-T是從土耳其引進種子的3年生實生苗，曾被當做皂莢品種，但其所表現(xiàn)出的形態(tài)特征與皂莢有較大差異，而與山皂莢極為相似。因此，本試驗采用SRAP標記對18份皂莢種質資源進行遺傳多樣性分析，并構建DNA指紋圖譜，以期為皂莢種質資源的鑒定、優(yōu)良品種的選育等提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

材料包括3個種共18份，具體見表1。其中野皂莢、山皂莢和皂莢-T為實生苗，其余均為嫁接苗。所有材料均隨機選取3株，每株采集2片健康、幼嫩葉片帶回實驗室置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 皂莢基因組DNA的提取

每個皂莢品種選3株，每株取1片幼嫩葉片等量混合，采用改良CTAB法[19]提取皂莢基因組DNA，并將模板DNA濃度稀釋至20 ng·μL-1，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SRAP-PCR分析

選用8個正向引物(Me1-Me8)和8個反向引物(em1-em8)組成64對SRAP引物組合對供試材料進行擴增。反應體積為10 μL，包括DNA 1.2 μL，上下游引物各0.6 μL，2×TaqMasterMix 5.0 μL，RNase-Free water 2.6 μL。SRAP-PCR擴增程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，35 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，5個循環(huán)；94 ℃ 1 min，51 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，35個循環(huán)；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠分離。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

根據(jù)電泳結果進行條帶的統(tǒng)計分析。電泳圖上在相同位置上若出現(xiàn)DNA條帶記為“1”，無則記為“0”，形成1、0矩陣，將此矩陣導入POPGENE1.32軟件進行多態(tài)性百分率(PPL)、觀測等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性(H)和Shannon’s多樣性指數(shù)(I)等遺傳多樣性參數(shù)分析，依據(jù)黃秀等[20]方法計算引物多態(tài)性信息含量(PIC)，通過NTSYS-pc 2.0軟件依據(jù)UPGMA法進行聚類分析，同時，參照云天海等[21]方法構建18份皂莢種質材料的DNA指紋圖譜。

表1供試材料

Table1Materials used in study

2 結果與分析

2.1 SRAP引物篩選與多態(tài)性分析

用64對SRAP引物對供試的18份皂莢材料進行了PCR擴增，最終篩選出了條帶清晰、多態(tài)性高的17對引物，所用引物序列及多態(tài)性統(tǒng)計結果見表2。17對引物共擴增出222個條帶，多態(tài)性條帶213個，多態(tài)性比率的平均值為95.95%。多態(tài)性信息含量(PIC)的變化范圍為0.799 6～0.919 8，平均值為0.861 1，說明所選引物在18個皂莢品種間具有很高的SRAP多態(tài)性，圖1為引物組合Me8-em7的擴增結果。各引物的觀測等位基因數(shù)(Na)的變化范圍為1.900 0～2.000 0，平均值為1.962 3；有效等位基因數(shù)(Ne)的變化范圍為1.276 4～1.578 1，平均值為1.415 3；Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)的變化范圍為0.193 4～0.329 7，平均值為0.257 2；Shannon’s信息指數(shù)(I)的變化范圍為0.325 7～0.493 5，平均值為0.406 6。上述結果表明，18個皂莢品種間存在較豐富的遺傳多樣性。同時，利用SPSS17.0軟件對3個主要遺傳多樣性參數(shù)有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)和Shannon’s 信息指數(shù)(I)進行非參數(shù)Kruskal Wallis Test獨立樣本檢驗，結果顯示18個皂莢品種間遺傳多樣性水平存在顯著性差異(χ2=44.308，P<0.001)。

2.2 遺傳相似性和聚類分析

利用NTSYS-pc軟件計算皂莢種質材料間的遺傳相似系數(shù)(GS)，結果表明，18份皂莢種質材料間的GS為0.522 5～0.955 0，平均值為0.727 7，變幅為0.432 5，說明供試材料間存在較大的遺傳差異。其中焦科4和焦科5的GS最大(0.955 0)，親緣關系最近，野皂莢和皂莢-H的GS最小(0.522 5)，親緣關系最遠。

利用NTSYS-pc軟件對18份皂莢種質材料進行聚類分析。結果(圖2)表明，在GS為0.66處可將18份皂莢種質材料分為3組。第1組為野皂莢；第2組為山皂莢和皂莢-T；第3組共有15份皂莢材料：密刺、嵩刺1、碩刺、皂莢-H、焦科1、焦科3、濟科、豫皂1、懷皂王2、博科、豫皂2、太行2、焦科2、焦科4和焦科5。該聚類結果與皂莢的傳統(tǒng)分類基本一致。

2.3 DNA指紋圖譜的構建

通過分析17對引物對18份皂莢種質材料的擴增結果，選取Me5-em8、Me6-em4、Me8-em7和Me8-em8共4對引物擴增的9個多態(tài)性位點構建了18份皂莢種質的DNA指紋圖譜(圖3)。

表2SRAP引物及多態(tài)性分析

Table2SRAP primers used for this study and their polymorphic

引物組合Primercombinations引物序列Sequenceforprimers(5'→3')TNPPL/%PICNaNeHIMe1-em1TGAGTCCAAACCGGATAGACTGCGTACGAATTAAT1515100.000.88332.00001.42840.27160.4292Me3-em3TGAGTCCAAACCGGAATGACTGCGTACGAATTGAC151493.330.89881.93331.38300.23910.3792Me3-em5TGAGTCCAAACCGGAATGACTGCGTACGAATTAAC151493.330.85491.93331.28250.19340.3257Me4-em1TGAGTCCAAACCGGACCGACTGCGTACGAATTAAT1010100.000.83662.00001.48500.30550.4727Me4-em2TGAGTCCAAACCGGACCGACTGCGTACGAATTTGC1212100.000.86342.00001.41080.28190.4505Me4-em5TGAGTCCAAACCGGACCGACTGCGTACGAATTAAC1212100.000.87022.00001.57810.32970.4935Me5-em3TGAGTCCAAACCGGAAGGACTGCGTACGAATTGAC181794.440.90871.94441.41650.26060.4108Me5-em7TGAGTCCAAACCGGAAGGACTGCGTACGAATTATG99100.000.80202.00001.43060.25920.4083Me5-em8TGAGTCCAAACCGGAAGGACTGCGTACGAATTAGC1010100.000.84332.00001.55470.31910.4817Me6-em2TGAGTCCAAACCGGTAGGACTGCGTACGAATTTGC1212100.000.83982.00001.37450.25360.4107Me6-em4TGAGTCCAAACCGGTAGGACTGCGTACGAATTTGA1111100.000.82922.00001.36420.24070.3908Me7-em3TGAGTCCAAACCGGTTGGACTGCGTACGAATTGAC171694.120.89151.94121.31740.21390.3529Me7-em6TGAGTCCAAACCGGTTGGACTGCGTACGAATTGCA131292.310.88231.92311.56750.32430.4842Me7-em8TGAGTCCAAACCGGTTGGACTGCGTACGAATTAGC121191.670.81831.91671.27640.19750.3323Me8-em5TGAGTCCAAACCGGTGTGACTGCGTACGAATTAAC131292.310.91981.92311.37100.23450.3738Me8-em7TGAGTCCAAACCGGTGTGACTGCGTACGAATTATG181794.440.89741.94441.38920.24450.3880Me8-em8TGAGTCCAAACCGGTGTGACTGCGTACGAATTAGC10990.000.79961.90001.43020.25550.3956總計Total222213平均Mean13.0695.950.86111.96231.41530.25720.4066

T，位點總數(shù)；N，多態(tài)性位點數(shù)；PPL，多態(tài)性位點百分率；PIC，多態(tài)性信息含量；Na，觀測等位基因數(shù)；Ne，有效等位基因數(shù)；H，Nei’s基因多樣性；I，Shannon信息指數(shù)。

T， Total number of loci;N， Number of polymorphic loci;PPL， Percentage of polymorphic loci;PIC， Polymorphism information content;Na， Observed number of alleles;Ne， Effective number of alleles;H， Nei’s gene diversity;I， Shannon information index.

M，標準分子量；1～18材料編號同表1M， DL 2 000 standard marker; No.1-18 were the same as table 1圖1 引物組合Me8-em7的SRAP擴增結果Fig.1 The SRAP amplification of primer combination of Me3-em5

每份材料都有唯一的指紋圖譜，可以將18份皂莢種質材料區(qū)分并準確鑒定。

1～18材料編號同表1No. 1-18 were the same as table 1圖2 十八份皂莢種質資源的聚類圖Fig.2 Dendrogram for 18 G. sinensis germplasm based on SRAP marker

1～18材料編號同表1No. 1-18 were the same as table 1圖3 十八份皂莢種質資源的DNA指紋圖譜Fig.3 DNA fingerprint of 18 G. sinensis germplasm based on SRAP marker

3 討論

3.1 皂莢種質資源的遺傳多樣性分析

SRAP作為一種新型目的基因分子標記(Gene targeted markers，GTMs)，可以對性狀進行跟蹤，被認為是在分子標記輔助育種中最可能被大規(guī)模應用的一種技術[22]。與傳統(tǒng)的種質資源遺傳多樣性研究方法相比，分子標記能直接反映基因組DNA的遺傳變異信息，直接體現(xiàn)該物種在特定環(huán)境中遺傳多樣性水平的高低。因此，利用SRAP標記技術分析皂莢種質資源的遺傳多樣性，了解皂莢種質之間的遺傳差異，對于皂莢種質資源的合理利用及新品種選育具有重要意義。在本研究中，利用SRAP標記就多個遺傳多樣性參數(shù)分析表明：多態(tài)性百分率(PPL)高達95.95%，多態(tài)性信息量(PIC)為0.861 1，處于高水平(高PIC> 0.5；0.25<適中PIC<0.5；低PIC<0.25)[23]，說明本試驗篩選的引物具有較高的多態(tài)性，可以有效地用于皂莢的遺傳多樣性分析。同樣，有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性(H)和Shannon信息指數(shù)(I)分別為1.415 3、0.257 2和0.406 6，也處于較高水平。另外，18個皂莢品種間的遺傳相似系數(shù)(GS)介于0.522 5～0.955 0，變幅達0.432 5，說明供試品種間存在較豐富的多樣性。對有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)和Shannon’s信息指數(shù)(I)進行的非參數(shù)Kruskal Wallis Test獨立樣本檢驗結果表明，18個皂莢品種間遺傳多樣性水平存在顯著差異，具有較為豐富的遺傳變異。

3.2 皂莢種質資源的聚類分析

本研究涉及野皂莢、山皂莢和皂莢3個種共18份材料。聚類結果表明，在GS為0.66處可將18份皂莢種質材料分為3組。其中，野皂莢單獨為1組，山皂莢和皂莢-T聚為1組，其余15份皂莢種質材料聚為1組。從整體結果來看，該聚類結果與皂莢的傳統(tǒng)分類基本吻合。在上述第3組的15份皂莢種質材料中，焦科4和焦科5是以皂莢莢果為目的選育的品種，其余均以皂刺為目的選育的品種。聚類結果顯示，焦科4和焦科5在所有供試材料中親緣關系最近，與預期相符。從聚類圖中還可以看出，部分品種具有一定的地理來源一致性特征。如采集于河南博愛的5份材料除太行2號外，其余4份材料豫皂1、豫皂2、懷皂王2和博科聚在一起；采集于河南新鄭的3份材料除皂莢-H外，山皂莢和皂莢-T聚在一起；采集于河南修武的5份材料聚為2個分支，焦科1和焦科3為1個分支，焦科2、焦科4和焦科5為另一分支。另外，從聚類結果還獲得了一個非常有價值的信息，即皂莢-T是從土耳其引進種子的3年生播種苗，起初曾被作為皂莢品種，但其3年生播種苗無論從葉的形態(tài)、皮孔大小、形狀還是嫩枝的顏色都與山皂莢極為相似，因此認為該種子在引進時可能鑒定有誤。本研究結果顯示，山皂莢和皂莢-T聚為1組，兩者具有很近的親緣關系，因此，應將皂莢-T歸為山皂莢而非皂莢品種，同時還要結合其他分子標記技術及生長過程中所表現(xiàn)出的其他形態(tài)學特征進行進一步的驗證。

3.3 皂莢品種鑒定與DNA指紋圖譜構建

應用DNA分子標記可直接反映植物品種間的遺傳差異，具有不受環(huán)境因子和時空條件影響、高效、快捷等優(yōu)點，逐漸取代了依據(jù)形態(tài)學特征的鑒別方法，已成為植物品種鑒定的最有效方法。如唐源江等[24]利用17對SRAP引物擴增的48條譜帶構建了139份國蘭樣本的DNA分子身份證，置信概率達99.99%，具有唯一性，可實現(xiàn)對供試國蘭品種的精準、快速鑒定。劉君等[25]利用2對SRAP引物構建的指紋圖譜，可以將9個狗牙根品種進行準確鑒別。徐宗大等[26]從100對引物中篩選出了可準確鑒別46個品種的3對SRAP核心引物Me1-Em8、Me2-Em7和Me8-Em9，構建了玫瑰品種的指紋圖譜，可對46個玫瑰品種和4份野生種質進行準確鑒定。本研究利用SRAP技術，選用4對引物擴增的9個多態(tài)性位點構建了18份皂莢種質材料的DNA指紋圖譜，為皂莢種質資源間的鑒別提供了重要的科學依據(jù)。

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(責任編輯侯春曉)

GeneticdiversityandfingerprintsofGleditsiasinensisgermplasmbasedonSRAP

ZHANG Anshi1， ZHANG Sumin2， FAN Dingchen3， LIU Ying1

(1.SchoolofScience，JiaozuoTeachersCollege，Jiaozuo454000，China; 2.GardenConservingInstitueofJiaozuo，Jiaozuo454000，China; 3.HenanAcademyofForestry，Zhengzhou450008，China)

Genetic diversity of 18Gleditsiasinensisgermplasms were analyzed by SRAP markers. The results showed that 17 primers pairs were screened from 64 primer pairs and 222 bands were obtained， including 213 polymorphic bands， with a polymorphism rate of 95.95%. The average polymorphism information content (PIC)， observed number of alleles (Na)， effective number of alleles (Ne)， Nei’s gene diversity (H) and Shannon’s information index (I) were 0.861 1， 1.962 3， 1.415 3，0.257 2 and 0.406 6， and the genetic similarity coefficients (GS) among the tested samples ranged from 0.522 5 to 0.955 0. UPGMA analysis showed that 18Gleditsiasinensiscould clustered into 3 groups with theGSof 0.66.Gleditsiaheterophyllaformed the first group，Gleditsiamelanacanthaand Zaojia-T were classified into the second group， and the others were classified into the third group. A total of 18Gleditsiasinensisgermplasm DNA fingerprints were constructed from 9 polymorphic loci amplified by 4 primer pairs， and these materials could be distinguished and identified accurately. All these results would provide the important theoretical basis for the identification， conservation and breeding of new cultivar forGleditsiasinensisgermplasms.

Gleditsiasinensis; SRAP; DNA fingerprint; genetic diversity

S718.46

：A

：1004-1524(2017)09-1524-07

張安世， 張素敏， 范定臣， 等. 皂莢種質資源SRAP遺傳多樣性分析及指紋圖譜的構建[J]. 浙江農業(yè)學報， 2017， 29(9): 1524-1530.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.09.14

2017-03-27

河南省科技攻關項目(14210221100850)；2015年河南省林業(yè)廳科技興林項目

張安世(1965—)，男，河南博愛人，碩士，教授，主要從事植物分子生物學研究。E-mail: aszhang1212@163.com