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      不同薄殼山核桃品種的根際土壤細菌菌群結構及多樣性研究

      2017-09-27 10:10:59生靜雅朱海軍劉廣勤
      關鍵詞:薄殼山核桃菌門

      生靜雅, 朱海軍, 劉廣勤, 萬 青①

      (1.江蘇省農業(yè)科學院休閑農業(yè)研究所, 江蘇 南京 210014; 2.江蘇省農業(yè)科學院果樹研究所, 江蘇 南京 210014)

      不同薄殼山核桃品種的根際土壤細菌菌群結構及多樣性研究

      生靜雅1, 朱海軍2, 劉廣勤2, 萬 青1①

      (1.江蘇省農業(yè)科學院休閑農業(yè)研究所, 江蘇 南京 210014; 2.江蘇省農業(yè)科學院果樹研究所, 江蘇 南京 210014)

      選擇江蘇薄殼山核桃主產區(qū)波尼(BN)、馬漢(MH)、威斯頓(WSD)和肖肖尼(XXN)這4個主要品種,利用Illumina Miseq高通量測序技術研究其根際土壤微生物多樣性及群落結構組成。結果顯示,4種薄殼山核桃品種間根際土壤細菌群落結構在門、屬水平上相似,α多樣性指數(shù)無顯著差異。變形菌門、擬桿菌門和芽單胞菌門均為優(yōu)勢門類,假單胞菌屬 (1%) 和Chitinophagaceae菌群(5%)在4個薄殼山核桃品種的根際土壤中豐度均較高。研究初步闡述了薄殼山核桃根際土壤微生物多樣性及群落結構組成,為進一步研究薄殼山核桃的根際效應提供了理論依據(jù)。

      薄殼山核桃; 根際細菌; 多樣性; 胡桃醌

      根際微生物的種群數(shù)量及多樣性是評價林地土壤肥力高低的重要生物學指標,而土壤肥力是土壤質量的重要組成部分,是林地生產力的基礎[1]。大量研究表明,根際微生物對土壤肥力、植株抗逆性、生長發(fā)育以及生產力有著極其重要的作用[2-3]。根瘤菌和弗蘭克氏菌等根際固氮菌能夠提高作物產量,增強植物對氮素的吸收[4]。假單胞菌屬、芽孢桿菌屬和農桿菌屬等能通過產生生長激素或信號分子、競爭生長位點、產生鐵載體等促生機制來促進植物生長,增強對病原菌的抗性和忍耐力[5-7]。與此同時,植物通過根際分泌物來調控和影響根際微生物的數(shù)量、種類及生態(tài)分布[8-9]。近年來,利用生物工程技術在分子水平上研究植物根際微生物多樣性的研究已有大量報道[10-11],但大部分研究主要針對農作物,林木根際土壤微生物多樣性研究鮮有報道。因此,開展林木根際土壤微生物多樣性研究,將有助于通過人工調節(jié)根際微環(huán)境的生物活性來改善林地的生態(tài)環(huán)境和質量,從而為解決林木連栽引起的地力衰退和林木根部土傳病害等問題以及增強林地的生產力提供技術支持。

      薄殼山核桃(Caryaillinoensis),又名美國山核桃和長山核桃,為胡桃科(Juglandaceae)山核桃屬 (Caryanutt)植物,是我國主要的干果經濟作物,也是最早發(fā)現(xiàn)的化感植物之一[12]。目前,對薄殼山核桃根際微生物多樣性的研究鮮有報道。鑒于此,筆者以江蘇主產區(qū)的薄殼山核桃為研究對象,利用高通量測序技術研究4個主要薄殼山核桃品種的根際土壤細菌區(qū)系組成和群落結構差異,為薄殼山核桃根際微生態(tài)研究提供基礎數(shù)據(jù),同時為進一步研究不同土壤環(huán)境以及營林方式對薄殼山核桃根際土壤微生物菌群結構的多樣性影響提供理論基礎。

      1 材料與方法

      1.1 研究區(qū)概況

      試驗地位于泗洪縣峰山鄉(xiāng)大紅山,地處蘇北平原西部,屬北亞熱帶和北暖溫帶季風氣候區(qū),四季分明,年均氣溫15 ℃,年均日照時數(shù)2 206.2 h,年均降水量960.4 mm,年均無霜期203 d。試驗地地形屬崗坡地,土壤為砂礓土,基本理化指標如下:pH值為6.74,有機碳含量為12.81 g·kg-1,有機質含量為22.83 g·kg-1,陽離子交換量為25.1 cmol·kg-1,黏粒(<0.002 mm)、粉粒(0.002~0.05 mm)、砂粒(>0.05 mm)體積分數(shù)分別為7.4%、32.5%和52.2%。

      供試材料為試驗園結實穩(wěn)定的4個品種:波尼(BN)、馬漢(MH)、威斯頓(WSD)和肖肖尼(XXN),樹齡為8年生,株行距為6 m×8 m,南北行向,樹勢較強。土壤采樣時間為2015年5月,是薄殼山核桃的果實灌漿期。

      1.2 研究方法

      1.2.1土壤取樣

      在上述4個品種薄殼山核桃種植區(qū)各選擇1個20 m×30 m的標準地,在每個標準地內選取3株樹齡相同的薄殼山核桃樹,在距樹干基部0.5 m處分別設置5個取樣點,用內徑10 cm的土鉆分層挖取0~20、>20~40和>40~60 cm深度土壤,采集各層直徑0.1~0.5 cm的細根,用抖落法獲取其上粘附的土壤作為根際土壤,將根際土壤分別混合裝入已消毒的密封塑料袋中,放入冰盒內帶回實驗室。在實驗室內將同一品種的根際土壤充分混合后,共形成4個根際土樣,一部分于-70 ℃條件下冷凍備用,用于分析根際土壤細菌群落結構;另一部分風干、過篩,用于測定土壤理化性質。

      1.2.2土壤微生物DNA的提取

      采用MOBIO Power Soil DNA Isolation kit試劑盒(MOBIO公司,美國)稱取0.5 g新鮮土壤,按照說明書的步驟進行提取。將提取得到的土壤微生物總DNA溶解于100 μL去離子水中,取5 μL DNA用φ=1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,分析DNA的完整性和相對濃度。

      1.2.316S rRNA 基因擴增及Miseq測序

      采用引物515F/806R (F5′-AYTGGGYDTAAAGNG-3′,R5′-AYTGGGYDTAAAGNG-3′)擴增16S rRNA的V4可變區(qū)片段[13]。PCR擴增程序如下:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,共25個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min結束。獲得的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳后,使用AXYGEN公司的AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒,切膠回收PCR產物。將每個樣品等比例混合后,依托Illumina公司Miseq PE300 平臺進行測序 (由上海生工生物技術有限公司提供)。

      1.2.4數(shù)據(jù)分析

      將Miseq雙端測序數(shù)據(jù),首先根據(jù)單端測序序列(PE reads)之間的重疊關系,用FLASH軟件(Version 1.2.3)進行拼接,然后依托Prinseq軟件(Version 0.20.4)對低復雜度的序列進行質量控制過濾。采用RDP classifier軟件對處理后序列進行物種分類,依次為域、門、綱、目、科和屬[14]。

      1.2.5微生物多樣性及聚類分析

      利用Monthur軟件(Version 1.35.1)計算樣品的α多樣性指數(shù),反映不同品種薄殼山核桃根際土壤細菌群落的豐度和多樣性,包括Chao指數(shù)、ACE指數(shù)、Coverage指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)[15]。

      β多樣性分析:基于物種分類分析,采用RDP classifier將序列進行物種分類,對不同樣本和每個物種單元分類進行序列豐度計算,構建代表性序列為節(jié)點的進化樹與物種豐度矩陣,分析比較不同薄殼山核桃品種根際細菌群落的同源性。

      2 結果與分析

      2.1 根際細菌的多樣性指數(shù)分析

      將4種不同薄殼山核桃根際土壤樣品的reads標準化后分析得到的OTU數(shù)量進行比較,發(fā)現(xiàn)并無顯著性差異。通過微生物多樣性指數(shù)比較不同品種薄殼山核桃根際土壤的α多樣性 (表1),由ANOVA分析可知,就不同薄殼山核桃品種的根際土壤微生物多樣性比較而言,除Chao指數(shù)有一定差異以外,其他指數(shù)并無顯著性差異 (P>0.05)。BN、MH、XXN和WSD的根際土壤微生物ACE指數(shù)分別為27 855、24 059、23 686 和22 175。從Shannon指數(shù)分析來看,BN(8.067)和MH (7.877)的根際土壤微生物物種豐富度較高,其次為XXN(7.631),WSD的根際土壤微生物物種豐富度最低(7.468)。就Chao指數(shù)而言,BN(19 848)、MH (18 008)和XXN(16 861)顯著高于WSD (14 886)??梢?以上3種多樣性指數(shù)的計算結果相似,均表明BN的根際土壤微生物多樣性最高,WSD的根際土壤微生物多樣性最低,MH和XXN的根際土壤微生物多樣性在兩者之間。

      表14種薄殼山核桃根際土壤細菌多樣性指數(shù)

      Table1DiversityindexofthesoilbacteriaintherhizosphereunderCaryaillinoensisrelativetovariety

      山核桃品種OTUAce指數(shù)Chao指數(shù)Shannon指數(shù)Simpson指數(shù)Coverage指數(shù)BN8862±827a27855±2518a19848±1814a8067±0221a0002a0858±0031aMH7737±789a24059±5212a18008±1513a7877±0495a0002a0868±0023aWSD6666±1125a22175±4621a14886±1635b7468±0681a0002a0896±0010aXXN7299±886a23686±3981a16861±1682a7631±0582a0002a0873±0274a

      同一列數(shù)據(jù)后英文小寫字母相同表示不同山核桃品種某指標差異不顯著(P>0.05)。

      2.2 根際細菌群落結構組成及多樣性

      BN、MH、XXN和WSD的根際土壤分別含有19、20、20和21個門類菌群。4個薄殼山核桃品種根際土壤菌群中豐度最高的10大主要門類相同,分別為變形菌門、類細菌門、芽單胞菌門、浮霉菌門、綠彎菌門、厚壁菌門、疣微菌門、硝化螺旋菌門、裝甲菌門和酸桿菌門。由門水平菌群聚類堆積圖(圖1)可以看出,BN和XXN根際細菌主要門水平相對豐度的同源性較高,而WSD則與其他品種薄殼山核桃土壤根際細菌的相對豐度分布差異最大。XXN和WSD土壤根際菌群結構更為相似,聚類于1簇。

      因顏色種類有限,豐度低于0.5%的細菌均用白色表示。

      從其他分類層級上看,4個薄殼山核桃品種的根際土壤微生物分布也較為相似,從屬水平上的菌群聚類堆積圖(圖1)可以看出,BN和XXN土壤根際細菌在屬水平的相對豐度同源性較高,而MH則與其他品種土壤根際細菌的相對豐度分布差異最大。

      主成分分析(PCA)結果(圖2)與聚類圖結果一致,XXN和BN聚類于1簇。未鑒定到屬的OTU以及豐度較低的微生物種群占50%左右,其他優(yōu)勢菌屬主要集中在50個種屬間,分別為亞硝化球菌屬(Nitrosococcus)、Azospira、Aquicella、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、Hallangium和鏈霉菌屬(Steptomyces)等,豐度均在1%以上。其中Chitinophagaceae科在4種薄殼山核桃根際土壤樣品中豐度均在5%以上,Chitinophagaceae科由Balneola、Filimonas、Flavisolibacter、Gracilimonas、Lacibacter、Niastella、Terrimonas和Chitinophaga共8個屬組成[16]。

      圖2 不同分類水平的根際細菌組成聚類主成分分析

      2.3 根際細菌群落結構差異分析

      將4種薄殼山核桃品種根際土壤樣品的OTU分布進行Venn圖分析,結果見圖3。4種薄殼山核桃的根際土壤樣品中均有分布的OTU數(shù)量為2 145,共有OTU數(shù)量最多的是BN和XXN(5 338),最少是BN和WSD(3 450);3種美國薄殼山核桃品種的根際土壤樣品共有最多的組合是BN、XXN和 MH(3 429),說明這3個品種根際土壤微生物群落組成的同源性較高,該結果與圖1一致;4種薄殼山核桃的根際土壤樣品中獨有OTU數(shù)從大到小依次為BN(2 634)、MH(2 378)、WSD(1 775)和XXN(1 009)。

      在門分類水平上對4種薄殼山核桃根際土壤樣品所含菌屬進行聚類,對聚類后的各樣品中不同OTU所含序列豐度進行Heatmap分析(圖4),該圖能夠反映門水平上各根際土壤樣品細菌群落結構的差異性。變形菌門在4種薄殼山核桃的根際土壤微生物菌群中豐度最高。MH根際土壤細菌群落中黏膠球形菌門豐度高于其他3種薄殼山核桃品種;XXN根際土壤細菌群落的衣原體門和裝甲菌門豐度高于其他3種薄殼山核桃品種;BN根際土壤細菌群落的藍藻門豐度高于其他3種薄殼山核桃品種。

      3 討論

      根際指受植物根部釋放物質而影響微生物活性的土壤區(qū)域,由于受植物種類、生長階段和土壤性質等影響,根際土壤微生物的數(shù)量和種類要多于根外的土壤微生物,它們在根上的繁殖和分布受根系生長發(fā)育的影響而表現(xiàn)出較為明顯的根際效應。由于根際土壤微生物在植物的物質循環(huán)和能量轉換中扮演著重要角色,一定程度上決定著植物生產力的高低[17]。因此,根際土壤微生物多樣性一直以來是根際效應研究的主體[18-19]。該研究基于高通量測序技術對4種薄殼山核桃的根際土壤細菌多樣性進行了初步研究,α多樣性指數(shù)顯示,4種薄殼山核桃的根際土壤細菌多樣性無顯著性差異;β多樣性分析結果表明,4種薄殼山核桃的根際土壤細菌群落結構在門、屬水平相似,但在低豐度的根際細菌群落結構方面存在一定特異性。變形菌門、類細菌門和芽單胞菌門在4種薄殼山核桃的根際土壤細菌中都屬于優(yōu)勢菌群。從屬水平和OUT多樣性分析結果來看,BN、XXN和MH的根際土壤微生物群落組成的同源性較高,但不同品種薄殼山核桃根際土壤的優(yōu)勢菌門存在差異性,這也說明薄殼山核桃根際土壤菌群結構存在一定的種間差異。有研究發(fā)現(xiàn),不同種的海棠根系代謝活力存在一定差異,導致其根系分泌物的物質數(shù)量和組成不同,進而直接或間接影響根際土壤微生物的數(shù)量和種群結構[20]。

      綠色、黃色、紅色、藍色分別代表波尼(BN)、馬漢(MH)、肖肖尼(XXN)和 威斯頓(WSD)這4個不同薄殼山核桃品種。圖中數(shù)據(jù)代表 不同品種山核桃根際土壤之間共有OTU數(shù)量。

      圖4 基于門分類水平的不同土壤樣品OTU分布的Heatmap 分析Fig.4 Heatmap tree based on OTU analysis of soil bacteria at the phylum level in soil samples from the rhizosphere of Carya illinoensis relative to variety

      化感植物通過根系分泌各種化感物質對根際微生物的種類、數(shù)量和分布產生影響,進一步對根際定殖的微生物分類群和功能群進行選擇[10]。水稻根際存在30多種特異微生物,其中7種被鑒定為黏細菌(myxobacteria),進一步研究發(fā)現(xiàn),黏細菌對水稻根系分泌物中的酚酸類物質具有明顯的趨化促進作用[11]。薄殼山核桃根系分泌的胡桃醌在土壤種性質極其穩(wěn)定,且不隨季節(jié)發(fā)生改變,是一種典型的化感植物[8]。有研究表明,假單胞菌屬能通過自身水解酶降解胡桃醌等化感物質而在核桃根際有效定植[9],筆者的研究結果與其一致。Chitinophagaceae菌群在4種薄殼山核桃根際土壤中豐度較高,而大量研究結果也發(fā)現(xiàn)該菌群廣泛存在于水稻[4]、小麥[5]、人參[6]和紫莖澤蘭[10]等產化感物質的植物根際土壤中。因此,推測薄殼山核桃根系的化感物質胡桃醌可能誘導假單胞菌屬和Chitinophagaceae菌群這類具有趨化性的細菌在其根際中大量定植。

      土壤理化因子、林木種類及不同營林方式是影響林木根際微生物群落結構的主要因素[21]?;兄参锿ㄟ^根系分泌各種化感物質對根際微生物的種類、數(shù)量和分布產生影響,進一步對根際定殖的微生物分類群和功能群進行選擇[22-23]。土壤溫度、pH值及有機質含量通過影響土壤微生物的數(shù)量與種類間接影響根際微生物的多樣性[24-25]。哪些環(huán)境因子影響著薄殼山核桃的根際細菌多樣性?不同營林方式對薄殼山核桃根際細菌多樣性的影響如何?這些問題還需通過進一步試驗開展深入研究。

      綜上所述,筆者通過Miseq高通量測序技術對4種薄殼山核桃根際土壤細菌多樣性及菌群結構進行了分析,發(fā)現(xiàn)薄殼山核桃根際土壤的細菌以變形菌門和類細菌門為主要優(yōu)勢門類,同時發(fā)現(xiàn)了薄殼山核桃根際土壤中含有的特有菌屬主要是假單胞菌屬和Chitinophagaceae菌群,關于這2類菌群對胡桃醌的趨化性研究仍需一步開展。

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      CommunityStructureandDiversityofSoilBacteriainRhizospheresUnderDifferentVarietiesofCaryaillinoensis.

      SHENGJing-ya1,ZHUHai-jun2,LIUGuang-qin2,WANQing1

      (1.Institute of Leisure Agriculture, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China; 2.Institute of Pomology, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China)

      The Miseq molecular technology was used to explore difference between 4 varieties ofCaryaillinoensis(“BN”、“MH”、“XXN” and “WSD”) in community structure and diversity of soil bacteria in rhizosphere. It was found that the 4 varieties did not vary much in community structure and diversity of soil bacteria in rhizosphere at the phylum and genus levels or in α-diversity index. Proteobacteria, Bacteroidetes and Gemmatimonadete were dominant phyla.Pseudomonas(1%) and Chitinophagaceae (5%) were quite high in mean abundance in the rhizosphere of all the four varieties of Carya illinoensis, which might be attributed to the chemotaxis of juglone. This study has tentatively elaborated community structure and diversity of the soil bacteria in rhizosphere of theCaryaillinoensistrees and may serve as theoretical basis for future studies on rhizosphere effect ofCaryaillinoensis.

      Caryaillinoensis; rhizosphere bacteria; diversity; juglone

      X825

      : A

      : 1673-4831(2017)09-0816-06

      10.11934/j.issn.1673-4831.2017.09.007

      生靜雅(1984—),女,江蘇南京人,助理研究員,碩士,研究方向為薄殼山核桃等干果育種栽培研究。E-mail: shengjingya1984@126.com

      (責任編輯: 許 素)

      2016-10-10

      2015年中央財政林業(yè)科技推廣項目([2015]TJS03)

      ① 通信作者E-mail: oneqq-17@163.com

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