超氧陰離子調(diào)節(jié)水稻幼苗不定根形成的分子機(jī)制

劉濤+鄭欣+劉夏囡+高華健+車軒+周士釗+崔桂彩+趙鳳云

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.13.014

摘要：用DR5-GUS轉(zhuǎn)基因水稻分析O-2[KG-*2]· [KG-*3]對(duì)水稻幼苗葉鞘節(jié)處不定根原基形成、生長(zhǎng)素分布及生長(zhǎng)素和細(xì)胞周期基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，DDC（SOD抑制劑）處理加快了水稻幼苗葉鞘節(jié)處不定根原基的形成、生長(zhǎng)和生長(zhǎng)素在不定根根尖的積累，相反，Tiron（ O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除劑）處理則延緩了這一過(guò)程。DDC、Tiron處理?xiàng)l件下，水稻幼苗葉鞘節(jié)處分別有15個(gè)生長(zhǎng)素基因（如[WTBX][STBX]OsYUCCA5、OsPIN9、OsARF2和OsIAA17[WTBZ][STBZ]等）和13個(gè)細(xì)胞周期基因（如[WTBX][STBX]Oryza；CycD4；1、Oryza；CycT1；3、Oryza；CDKC；3和Oryza；CDKF；1[WTBZ][STBZ]等）的表達(dá)存在明顯差異，揭示 O-2[KG-*2]· [KG-*3]可能通過(guò)影響這些基因的表達(dá)而調(diào)控水稻不定根的形成和生長(zhǎng)。結(jié)果說(shuō)明， O-2[KG-*2]· [KG-*3]對(duì)水稻不定根形成的調(diào)節(jié)與其影響某些生長(zhǎng)素和細(xì)胞周期基因的表達(dá)有密切關(guān)系。

關(guān)鍵詞：不定根；超氧陰離子；水稻幼苗；葉鞘節(jié)

中圖分類號(hào)： S511.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A[HK]

文章編號(hào)：1002-1302（2017）13-0054-03[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2016-03-15

基金項(xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金（編號(hào)：ZR2014DM010、ZR2015CL009）；山東省淄博市科技發(fā)展計(jì)劃（編號(hào)：111089、113106）。

作者簡(jiǎn)介：劉濤（1969—），男，山東淄博人，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事植物學(xué)研究。E-mail：liutao@sdut.edu.cn。

通信作者：趙鳳云，博士，教授，主要從事分子生物學(xué)研究。E-mail：zfy1226@126.com。

[ZK）]

不定根是水稻根系的主要組成部分，對(duì)水稻的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量有決定性的作用。種子根（初生根）和不定根具有不同的發(fā)育機(jī)制。在水稻不定根形成過(guò)程中生長(zhǎng)素有重要的調(diào)節(jié)作用。生長(zhǎng)素信號(hào)途徑上關(guān)鍵基因如OsYUCs（生長(zhǎng)素合成）、OsPINs（生長(zhǎng)素運(yùn)輸）、OsAux/IAAs和OsARFs（生長(zhǎng)素應(yīng)答）[1-4]與水稻不定根的生長(zhǎng)發(fā)育有密切關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)突變體不定根形成異常，如[WTBX][STBX]crown rootless1/ adventitious rootless1[WTBZ][STBZ]突變體不定根顯著減少[5-6]。水稻[WTBX][STBX]OsRPK1[WTBZ][STBZ]基因負(fù)調(diào)控生長(zhǎng)素的運(yùn)輸進(jìn)而影響不定根的生長(zhǎng)[7]。Liu等研究發(fā)現(xiàn)，OsGNOM1通過(guò)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素運(yùn)輸基因如[WTBX][STBX]OsPIN2、OsPIN5b、OsPIN9[WTBZ][STBZ]的表達(dá)影響水稻不定根的形成[8]。細(xì)胞分裂是影響植物根系生長(zhǎng)發(fā)育的重要過(guò)程。細(xì)胞周期調(diào)控受植物激素和多種信號(hào)分子的調(diào)節(jié)[9-14]。Lorbiecke等報(bào)道細(xì)胞周期調(diào)節(jié)水稻不定根的形成[15]。 O-2[KG-*2]· [KG-*3]是一種重要的信號(hào)分子，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、激素應(yīng)答、基因表達(dá)調(diào)控等眾多過(guò)程。筆者的前期研究結(jié)果表明，Cd處理?xiàng)l件下， O-2[KG-*2]· [KG-*3]影響水稻根系的生長(zhǎng)、生長(zhǎng)素的分布和某些生長(zhǎng)素和細(xì)胞周期基因的表達(dá)[10]。本試驗(yàn)進(jìn)一步研究 O-2[KG-*2]· [KG-*3]調(diào)節(jié)水稻幼苗葉鞘節(jié)處不定根形成的分子機(jī)制。

1材料與方法

[HTK]1.1試驗(yàn)材料與處理[HT]

將[WTBX][STBX]DR5-GUS[WTBZ][STBZ]轉(zhuǎn)基因水稻種子分別種植于含20 mmol/L Tiron（ O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除劑）和3 mmol/L DDC（SOD抑制劑）的固體MS培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)箱內(nèi)[光照度200 μmol/（m2·s）、14 h/d 光照、晝/夜溫度27 ℃/21 ℃、晝/夜相對(duì)濕度60%/80%]培養(yǎng)3～5 d，每種處理獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2根系GUS活性組織化學(xué)分析

將上述培養(yǎng)3～5 d的幼苗進(jìn)行GUS活性檢測(cè)[16]，每種處理至少用20株。

1.3不定根和葉鞘節(jié)橫切片不定根原基的統(tǒng)計(jì)

不定根數(shù)量在解剖鏡下統(tǒng)計(jì)，不定根原基在顯微鏡下觀察拍照并統(tǒng)計(jì)，每種處理取20個(gè)葉鞘節(jié)做冰凍橫切片（厚度35 μm），每個(gè)葉鞘節(jié)至少統(tǒng)計(jì)5張切片。數(shù)據(jù)用每株的平均值來(lái)表示。

1.4葉鞘節(jié)生長(zhǎng)素和細(xì)胞周期基因表達(dá)分析

上述幼苗處理4 d后取葉鞘節(jié)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄分析。使用Trizol試劑從每種處理的葉鞘節(jié)提取總RNA，取1 μg總RNA，用RNA PCR試劑盒（AMV）V3.0合成cDNA。每種處理用等量的cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，用25 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)PCR反應(yīng)在相同條件下獨(dú)立重復(fù)3次。用[WTBX][STBX]Osactin1[WTBZ][STBZ]基因作為內(nèi)標(biāo)，采用Gel-Pro Analyzer軟件對(duì)基因轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行半定量分析，將對(duì)照的轉(zhuǎn)錄水平設(shè)置為1，基因表達(dá)水平≥1.3為表達(dá)上調(diào)，≤0.7為表達(dá)下調(diào)。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每種處理數(shù)據(jù)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05 為差異顯著，用3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差來(lái)表示試驗(yàn)結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1 O-2[KG-*2]· [KG-*3]對(duì)水稻幼苗不定根及其原基總和的影響

在水稻幼苗處理3～5 d期間，DDC處理的不定根及其原基的總和較對(duì)照的多，相反，Tiron處理較對(duì)照的少（圖1）。[JP3]如處理4 d時(shí)，DDC處理不定根及其原基的總和比對(duì)照多75.7%（P<0.05），而Tiron處理比對(duì)照少29.8%（P<005）。[JP]endprint

[FK（W12][TPLT1.tif][FK）]

[HTK]2.2 O-2[KG-*2]· [KG-*3]對(duì)水稻幼苗不定根原基形成和生長(zhǎng)素積累的影響[HT]

DDC和Tiron處理3～5 d后不定根原基形成和生長(zhǎng)素積累的動(dòng)態(tài)變化存在明顯差異（圖2）。與對(duì)照相比，DDC加快不定根原基的形成和生長(zhǎng)素在根尖的積累，而Tiron延遲不定根原基的形成和生長(zhǎng)素在不定根的積累。

2.3 O-2[KG-*2]· [KG-*3]對(duì)水稻幼苗葉鞘節(jié)生長(zhǎng)素基因表達(dá)的影響

生長(zhǎng)素在不定根的形成和生長(zhǎng)過(guò)程中具有重要作用，為進(jìn)一步了解生長(zhǎng)素基因表達(dá)與不定根形成之間的關(guān)系，本試驗(yàn)進(jìn)一步分析了水稻幼苗處理4 d后葉鞘節(jié)處生長(zhǎng)素信號(hào)途徑上關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄活性。在所檢測(cè)的69個(gè)生長(zhǎng)素基因中有15個(gè)基因的表達(dá)水平在DDC、Tiron處理?xiàng)l件下存在明顯差異（圖3）。其中DDC處理時(shí)，有10個(gè)生長(zhǎng)素基因（[WTBX][STBX]OsYUCCA5、OsPIN1a、OsARF1、OsARF2、OsARF4、OsARF20、OsARF24、OsIAA7、OsIAA15、OsIAA17[WTBZ][STBZ]）的轉(zhuǎn)錄水平高于對(duì)照，有2個(gè)基因（[WTBX][STBX]OsYUCCA2和OsYUCCA6[WTBZ][STBZ]）的轉(zhuǎn)錄水平低于對(duì)照；Tiron處理時(shí)，[WTBX][STBX]OsYUCCA2、OsYUCCA6、OsPIN9、OsPIN10b[WTBZ][STBZ] 等4個(gè)生長(zhǎng)素基因的表達(dá)水平比對(duì)照高，而[WTBX][STBX]OsARF18[WTBZ][STBZ]轉(zhuǎn)錄水平比對(duì)照低。生長(zhǎng)素應(yīng)答是調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要過(guò)程，值得注意的是在這些差異表達(dá)的基因中DDC處理促進(jìn)了生長(zhǎng)素應(yīng)答基因（OsARFs/OsIAAs）的表達(dá)。該結(jié)果說(shuō)明， O-2[KG-*2]· [KG-*3]對(duì)水稻不定根原基形成的影響與其調(diào)節(jié)部分生長(zhǎng)素基因的表達(dá)有關(guān)。

2.4 O-2[KG-*2]· [KG-*3]對(duì)水稻幼苗葉鞘節(jié)細(xì)胞周期基因表達(dá)的影響

細(xì)胞分裂是不定根形成所必需的過(guò)程，試驗(yàn)進(jìn)一步分析了水稻幼苗處理4 d后葉鞘節(jié)處細(xì)胞周期核心基因表達(dá)的變化。在所分析的52個(gè)細(xì)胞周期基因中有13個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄活性在DDC、Tiron處理?xiàng)l件下存在明顯差異（圖4）。與對(duì)照相比，DDC處理激活了8個(gè)細(xì)胞周期基因（[WTBX][STBX]Oryza；CycD7；1、Oryza；CycT1；3、Oryza；CDKC；3、Oryza；CDKE；1、Oryza；CDKF；1、Oryza；CDKF；3、Oryza；CDKF；4和Oryza；CDKG；1[WTBZ][STBZ]）的轉(zhuǎn)錄，抑制了1個(gè)基因（[WTBX][STBX]Orysa；CycD5；1[WTBZ][STBZ]）的轉(zhuǎn)錄（圖4）；Tiron處理提高了5個(gè)基因（[WTBX][STBX]Oryza；CycB1；2、Oryza；CycD2；1、Oryza；CycD4；1、Orysa；CycD5；1和Oryza；CDKC；1[WTBZ][STBZ]）的表達(dá)水平。細(xì)胞周期蛋白激酶（CDKs）是促進(jìn)細(xì)胞分裂進(jìn)程的關(guān)鍵酶。值得注意的是DDC處理激活了細(xì)胞周期蛋白激酶基因（Oryza；CDKs）的轉(zhuǎn)錄。該結(jié)果說(shuō)明， O-2[KG-*2]· [KG-*3]通過(guò)影響這些細(xì)胞周期基因的表達(dá)對(duì)水稻不定根原基的形成進(jìn)行了調(diào)節(jié)。

[FK（W14][TPLT4.tif][FK）]

3討論

O-2[KG-*2]· [KG-*3]是調(diào)節(jié)根系生長(zhǎng)發(fā)育的重要信號(hào)分子[10]。本研究中DDC處理加快了水稻幼苗葉鞘節(jié)處不定根原基的形成、生長(zhǎng)和生長(zhǎng)素在不定根根尖的積累，相反，Tiron處理則延緩了這一過(guò)程（圖1、圖2），說(shuō)明 O-2[KG-*2]· [KG-*3]在調(diào)節(jié)水稻不定根生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中有重要的作用。生長(zhǎng)素和細(xì)胞周期是調(diào)控水稻不定根形成的關(guān)鍵因素[5-8，15]。生長(zhǎng)素應(yīng)答基因（OsARFs/OsIAAs）是生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的組成部分，與眾多植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程有關(guān)。細(xì)胞周期蛋白激酶（CDKs）是控制細(xì)胞分裂進(jìn)程的核心酶之一。本試驗(yàn)中DDC、Tiron處理?xiàng)l件下，水稻幼苗葉鞘節(jié)處某些生長(zhǎng)素基因特別是生長(zhǎng)素應(yīng)答基因（OsARFs/OsIAAs）和細(xì)胞周期基因尤其是細(xì)胞周期蛋白激酶基因（Oryza；CDKs）的表達(dá)有明顯差異（圖3、圖4），DDC明顯促進(jìn)了這些基因的表達(dá)，揭示 O-2[KG-*2]· [KG-*3]可能通過(guò)影響這些基因的表達(dá)而調(diào)控水稻不定根的形成和生長(zhǎng)。綜合本試驗(yàn)結(jié)果， O-2[KG-*2]· [KG-*3]調(diào)節(jié)不定根形成的分子機(jī)制概括如圖5所示：（1） O-2[KG-*2]· [KG-*3]通過(guò)直接影響某些生長(zhǎng)素、細(xì)胞周期基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控不定根的形成；（2） O-2[KG-*2]· [KG-*3]通過(guò)生長(zhǎng)素信號(hào)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期基因的表達(dá)進(jìn)而影響不定根的形成。當(dāng)然，不能排除 O-2[KG-*2]· [KG-*3]通過(guò)其他途徑影響生長(zhǎng)素、細(xì)胞周期基因的表達(dá)，由此調(diào)控不定根的形成。關(guān)于 O-2[KG-*2]· [KG-*3]調(diào)節(jié)水稻不定根形成的其他途徑有待于進(jìn)一步研究。

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