席秀利+黃海波+樓步青+詹若挺+王浩涵

摘要：為提取優(yōu)化廣陳皮基因組DNA，同時(shí)利用簡單重復(fù)序列間擴(kuò)增（ISSR）分子鑒定技術(shù)快速、準(zhǔn)確地鑒別茶枝柑及其近緣種。對比4種提取方法后擇優(yōu)提取廣陳皮DNA；采用正交優(yōu)化茶枝柑ISSR-PCR反應(yīng)體系，篩選100條ISSR通用引物及其退火溫度，從而對茶枝柑及近緣種進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過對比cCTAB法提取陳皮組基因DNA產(chǎn)率較試劑盒法提高了10倍，且電泳檢測條帶清晰明亮，可為后續(xù)分子研究提供基礎(chǔ)；通過篩選100條ISSR通用引物，最終篩選出10條適合茶枝柑及近緣種的引物，對其進(jìn)行多態(tài)性分析并獲得13種植物聚類分析圖。因此可知，cCTAB法適合陳皮基因組DNA的提取，并可為其他果皮類植物基因組DNA提取提供參考；ISSR適合茶枝柑及近緣種的遺傳多態(tài)性分析，可作為其有效分子鑒別手段。

關(guān)鍵詞：DNA提??；ISSR；茶枝柑；近緣種；遺傳多態(tài)性

中圖分類號： S666.101文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A[HK]

文章編號：1002-1302（2017）13-0027-05[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2017-01-03

基金項(xiàng)目：國家公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（編號：201407002）；廣東省教育廳高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室滾動(dòng)支持項(xiàng)目（編號：2013CXZDA011）。

作者簡介：席秀利（1991—），女，湖南衡陽人，碩士，主要從事分子生物學(xué)研究。E-mail：840564430@qq.com。

通信作者：黃海波，博士，副教授，主要從事中藥品質(zhì)鑒定與質(zhì)量評價(jià)研究。E-mail：2865055919@qq.com。

[ZK）]

蕓香科（Rutacae）柑橘屬（Citrus）植物茶枝柑（Citrus reticulata cv. chachiensis）的成熟果皮可入藥。茶枝柑的果皮制干即為中藥陳皮，陳皮具有理氣健脾、燥濕化痰之功效，用于胸脘脹滿、食少吐瀉、咳嗽痰多等疾病[1]。商業(yè)上用于制作中成藥、中藥飲片、陳皮茶、飲料、添加劑和香料等，具有很高的食用兼藥用價(jià)值[2]。因其需求量巨大，同時(shí)由于環(huán)境、地域的差異，陳皮藥材來源混雜、混偽品較多，造成了藥材質(zhì)量不穩(wěn)定，難以保證臨床用藥的安全和有效，因此建立科學(xué)的鑒定方法是保證陳皮質(zhì)量亟需解決的問題。

1994年，加拿大蒙特利爾大學(xué)的Zietkiewicz等提出分子標(biāo)記采用簡單重復(fù)序列間擴(kuò)增（inter simple sequence repeat，簡稱ISSR）[3]。ISSR技術(shù)簡易、快捷，引物設(shè)計(jì)無須預(yù)知基因組序列，只要是目標(biāo)區(qū)域的長度在可擴(kuò)增范圍內(nèi)，就能擴(kuò)增出微衛(wèi)星重復(fù)序列間的DNA片段[4]。ISSR綜合了其他分子標(biāo)記高多態(tài)性、可重復(fù)性、低成本易操作以及無須知道基因組序列的優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于種質(zhì)收集、品種鑒定、遺傳多樣性以及SSR引物開發(fā)等研究[5]。

本研究通過經(jīng)典十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法[6]、mCTAB法[7]以及2種植物基因組提取試劑盒法對廣陳皮藥材基因組DNA提取進(jìn)行探究，優(yōu)化適合廣陳皮DNA的提取方法，以期為今后廣陳皮的分子研究提供保障。同時(shí)，利用ISSR標(biāo)記對茶枝柑及近緣種進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析，得到相關(guān)物種的ISSR聚類分析圖，從而為茶枝柑及其近緣種植物鑒別提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)材料的收集包括廣陳皮（Citrus aurantium L.）以及茶枝柑同屬近緣13種，其中茶枝柑、福橘（Citrus reticulata Blanco cv.Tangerina）采自廣東省、福建省等地，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)黃海波副教授鑒定，憑證標(biāo)本保存于廣州中醫(yī)藥大學(xué)。采集植物新鮮幼嫩葉片，用75%乙醇水溶液清潔葉表面后迅速置于硅膠密封袋中，快速干燥后保存于-20 ℃冰箱備用，試驗(yàn)材料詳細(xì)信息見表1。

1.2儀器和試劑

OSE-Y20電動(dòng)研磨儀[天根生化科技（北京）有限公司]，Arktik PCR儀（Thermo），T960 PCR儀（杭州晶格科學(xué)儀[HJ1.55mm]器有限公司），Power Pac Basic電泳儀（Bio-Rad），離心機(jī)（Eppendorf），Nano Drop 2000超微量紫外分光光度計(jì)[JP4]（Thermo），Tanon-2500[JP3]凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。[JP]

dNTPs、ExTaqDNA聚合酶、Mg2+、10×ExTaq Buffer、DL5000Maker、瓊脂糖（TaKaRa）；聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、CTAB、 β-巰基乙醇（Sigma公司）； 植物基因組提取試劑盒、RNase、loading buffer[天根生化科技（北京）有限公司]；其余為國產(chǎn)分析純試劑；參考哥倫比亞大學(xué)提供的100條ISSR引物序列，由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.3方法

1.3.1廣陳皮DNA的提取

試驗(yàn)對比植物基因組提取試劑盒DP305、DP320，經(jīng)典CTAB法以及改良CTAB法4種方法后，選擇優(yōu)化改良CTAB法（cCTAB）作為最終提取陳皮基因組DNA的提取方法。

1.3.1.1緩沖液配制

細(xì)胞核分離液含0.10 mmol/L Tris-HCl（pH值8.0）、0.25 mol/L NaCl（5.00 mol/L）、5 mmol/L EDTA（pH值8.0）、2% PVP，加水定容至100 mL；2% CTAB緩沖液配方含0.10 mol/L Tris-HCl（pH值8.0）、1.40 mol/L NaCl、20.00 mol/L EDTA（pH值8.0）、2% CTAB、2% PVP、2% β-巰基乙醇，加水定容至100 mL。endprint

1.3.1.2提取方法

稱取50 mg干果皮，加20 mg PVP和 10 mg 抗壞血酸以及適量液氮于研缽中迅速研磨成粉末，將粉末迅速轉(zhuǎn)入2.0 mL離心管中；將粉末彈至試管側(cè)壁，加入1.0 mL預(yù)冷的核分離液，振蕩混勻，12 000 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)洗滌共3次；加入0.8 mL預(yù)熱的2% CTAB緩沖液配方，混勻后65 ℃水浴60 min，其間每隔10 min搖動(dòng)1次；取出離心管冷卻到室溫，加入等體積的苯酚 ∶[KG-*3]三氯甲烷 ∶[KG-*3]異戊醇（25 ∶[KG-*3]24 ∶[KG-*3]1）顛倒混勻5 min；12 000 r/min離心5 min，吸上清液并置于新的2.0 mL離心管中；加入等體積三氯甲烷 ∶[KG-*3]異戊醇溶液（24 ∶[KG-*3]1），顛倒混勻5 min；12 000 r/min離心5 min，吸上清液并置于新的1.5 mL離心管中；加入1/10體積的3 mol/L NaAc和等體積的預(yù)冷無水乙醇，輕輕混勻至出現(xiàn)絲狀沉淀為止；10 000 r/min離心2 min，棄上清；加入 0.8 mL 預(yù)冷70%乙醇，輕輕彈起沉淀，靜置懸浮5 min，10 000 r/min 離心1 min，棄上清；重復(fù)上一步驟；超凈臺上風(fēng)干乙醇；加入100 μL TE和6 μL 10 mol/L RNase，37 ℃水浴30 min；放置于4 ℃冰箱過夜溶解后于-20 ℃長期保存。

1.3.1.3DNA產(chǎn)率和質(zhì)量檢測（1）瓊脂糖凝膠電泳檢測。

用瓊脂糖凝膠電泳檢測4種提取方法提取的DNA片段大小、降解情況。取5 μL DNA原液，加1 μL loading buffer，混勻后點(diǎn)入0.8%瓊脂糖凝膠，150 V電泳15 min，在紫外凝膠成像儀上觀察并拍照。

（2）微量分光光度計(jì)檢測。

取2 μL DNA原液，用Nano Drop 2000超微量分光光度計(jì)測定DNA的濃度及吸光度。

（3）PCR檢測。

將cCTAB提取的DNA原液稀釋到 50 ng/μL，用植物DNA條形碼候選片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所用引物為trnH/psbA[8]，PCR擴(kuò)增采用10 μL反應(yīng)體系，其中包括1×PCR buffer（含MgCl2），0.2 mmol/L dNTPs，各 0.5 μmol/L 上下游引物，0.5 U Taq DNA聚合酶，50 ng模板DNA。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外凝膠成像儀觀察并拍照。

1.3.2ISSR分子標(biāo)記[HT]

1.3.2.1正交優(yōu)化PCR反應(yīng)體系

選擇UBC 809為引物，以植物基因組提取試劑盒DP305提取的茶枝柑葉片基因組DNA為模板，針對PCR反應(yīng)的Mg2+、dNTPs、ExTaq聚合酶、Primer和DNA模板的濃度共5個(gè)因素在4個(gè)水平上進(jìn)行正交設(shè)計(jì)（表2）。

正交試驗(yàn)共16組，重復(fù)3次，PCR反應(yīng)體系為20 μL，擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，電泳條件為100 V、40 min，結(jié)果經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。

1.3.2.2單因素內(nèi)優(yōu)化

參照正交試驗(yàn)體系優(yōu)化的結(jié)果，對DNA模板濃度、Mg2+濃度、引物濃度、dNTPs濃度和Taq DNA聚合酶濃度用ISSR 809號引物進(jìn)行交叉試驗(yàn)。反應(yīng)體系參數(shù)設(shè)置如下：Mg2+設(shè)置1.00、1.25、1.50、1.75、200 mol/L 5個(gè)濃度梯度；dNTPs設(shè)置0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mol/L 5個(gè)濃度梯度；ExTaq酶設(shè)置0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 U 5個(gè)濃度梯度；引物設(shè)置0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 μmol/L 5個(gè)濃度梯度；模板DNA設(shè)置20、30、40、50、60 ng 5個(gè)濃度梯度；1×PCR buffer，補(bǔ)充ddH2O至20 μL。

1.3.2.3[JP2]引物篩選以及退火溫度優(yōu)化

采用優(yōu)化后反應(yīng)體系對哥倫比亞大學(xué)公布的100條ISSR引物在其高于Tm值 2 ℃ 進(jìn)行篩選，選擇條帶數(shù)量多、[JP]間距合適、清晰的引物進(jìn)行退火溫度優(yōu)化。[JP]使用T960 PCR儀，以具體引物理論Tm為中心溫度，設(shè)定退火溫度梯度范圍（5 ℃），自動(dòng)形成12個(gè)梯度溫度（50.0、50.5、51.2、52.2、53.4、54.6、55.8、56.9、58.0、59.0、59.4、60.0 ℃）進(jìn)行篩選，從而確定引物適宜的退火溫度。[JP]

1.3.2.4多態(tài)性篩選

采用優(yōu)化后的反應(yīng)體系及退火溫度對茶枝柑、福橘、蜜橘3個(gè)不同地域的樣品進(jìn)行多態(tài)性篩選，選擇條帶清晰、間距明顯且多態(tài)性比例大的引物，最終確定適合茶枝柑及近緣種的多態(tài)性引物。

1.3.2.5數(shù)據(jù)分析

利用Tanon-2500凝膠成像GIS軟件對電泳圖譜同一位置ISSR條帶的有無進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，清晰地出現(xiàn)條帶記為“1”，無條帶記為“0”，條帶不清楚的不予統(tǒng)計(jì)，形成“0/1”矩陣。利用NTSYS-pc2.10e軟件計(jì)算遺傳距離，用UPGMA法進(jìn)行聚類分析，繪制ISSR樹狀圖。

2結(jié)果與分析

2.1陳皮DNA提取結(jié)果

2.1.1陳皮基因組DNA經(jīng)0.8%瓊脂糖電泳檢測結(jié)果如圖1所示，各個(gè)泳道均出現(xiàn)1條清晰的DNA條帶，無蛋白質(zhì)和RNA污染，無拖尾現(xiàn)象。endprint

[FK（W8][TPXXL1.tif][FK）]

2.1.2超微量紫外分光光度法檢測結(jié)果如表3所示，cCTAB法提取的DNA純度較高，質(zhì)量濃度較均勻，符合試驗(yàn)要求。

[FL（2K2]2.1.3PCR檢測cCTAB法提取陳皮基因組DNA如圖2所示，結(jié)果檢測能擴(kuò)增出均一明亮條帶，說明該方法提取DNA能為后續(xù)分子試驗(yàn)提供良好基礎(chǔ)。

[FK（W7][TPXXL2.tif][FK）]

[HTK]2.2ISSR-PCR結(jié)果[HT]

2.2.1PCR反應(yīng)體系正交優(yōu)化結(jié)果分析

使用引物809對反應(yīng)體系優(yōu)化的電泳結(jié)果如圖3所示，參考何正文等的直觀評價(jià)法[9]依次對16個(gè)試驗(yàn)組結(jié)果多態(tài)性進(jìn)行評分：條帶數(shù)量豐富、清晰的計(jì)16分；涂布或無條帶的計(jì)1分。1～16組的平均整數(shù)計(jì)分依次為8、12、2、1、1、14、6、11、1、12、13、16、1、1、9、10分，依照計(jì)分原則，以第12組反應(yīng)體系（1×PCR buffer，1.50 mmol/L Mg2+，0.25 mmol/L dNTPs，0.20 μmol/L引物，0.75 U Taq酶，40 ng模板DNA）為最佳，對正交優(yōu)化后的體系[CM（25]進(jìn)行單因素優(yōu)化后，得到最終反應(yīng)體系：1×PCR[KG*3]buffer，[CM）][FL）]

[FK（W10][TPXXL3.tif][FK）]

[FL（2K2]1.5 mmol/L Mg2+，0.3 mmol/L dNTPs，0.3 μmol/L引物，1.0 U Taq酶，40 ng模板DNA。

2.2.2引物篩選及退火溫度優(yōu)化

以最佳反應(yīng)體系對100條ISSR通用引物進(jìn)行篩選，重復(fù)3次初篩選30條引物，從中優(yōu)選15條清晰且背景亮度合適的引物進(jìn)行12個(gè)退火溫度梯度篩選，電泳圖經(jīng)Tanon-2500凝膠成像系統(tǒng)分析，根據(jù)信號強(qiáng)度判斷條帶，最終獲得在最適退火溫度下擴(kuò)增的13條引物，見圖4。[FL）]

[FK（W11][TPXXL4.tif][FK）]

[FL（2K2]2.2.3ISSR-PCR擴(kuò)增的多態(tài)性分析

以茶枝柑、福橘、蜜橘3個(gè)地域差異大的樣品進(jìn)行多態(tài)性篩選，最終獲得10條擴(kuò)增帶形完整、清晰、多態(tài)性豐畗的引物（表5）。利用這10條引物對13份材料進(jìn)行ISSR擴(kuò)增，共獲得總條帶914條，其中多態(tài)性條帶共823條，多態(tài)位點(diǎn)數(shù)共占90.04%，多態(tài)性比例較高，說明茶枝柑及近緣種遺傳多態(tài)性豐富。用表5中的826號引物對13份材料的多態(tài)性電泳結(jié)果見圖5。

2.2.4ISSR標(biāo)記的遺傳相似性及聚類分析

利用NTSYS軟件構(gòu)建全部材料基于ISSR數(shù)據(jù)的相似系數(shù)（表6）以及UPGMA樹狀圖（圖6）。13份材料兩兩之間的相似系數(shù)在 0.475 0～0.825 0，以相似系數(shù)0.57為閾值可將13份材料劃分為2組，體現(xiàn)了品種差異，茶枝柑、福橘、蜜橘、紅橘、沙糖橘、甌柑為第1分支，其中茶枝柑與福橘相似性最高。而在相似系數(shù)0.72處，茶枝柑則與福橘、蜜橘、紅橘聚為一類，說明四者相似度較高；第2組則以浙江省采樣為主，包括山下紅、本地早、由良、椪柑、宮川、紅美人與橘構(gòu)成第2分支，說明同一地域樣品相似度高；篩選的10條引物能在分子水平對茶枝柑及同屬13種近緣種進(jìn)行初步區(qū)分。

3討論

植物細(xì)胞內(nèi)含有大量次生代謝產(chǎn)物，如多糖、多酚等，這些物質(zhì)在提取DNA的過程中與DNA共沉淀，形成黏稠的膠狀物，難以溶解或產(chǎn)生褐變，嚴(yán)重影響DNA提取的產(chǎn)量與質(zhì)量，以及后續(xù)的PCR擴(kuò)增試驗(yàn)。本試驗(yàn)在對比2種試劑盒法和2種CTAB法后，選擇改良CTAB法進(jìn)一步優(yōu)化。PVP是酚和多糖的絡(luò)合物，能有效去除多酚和多糖[10]，抗壞血酸是抗氧化劑，可避免褐化[11]。本試驗(yàn)對比了在研磨時(shí)選擇加入PVP和抗壞血酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PVP和抗壞血酸以2 ∶[KG-*3]1的比例能有效防止樣品氧化和褐變；而加入CTAB free緩沖液（即“1.3.1.1”節(jié)的細(xì)胞核分離液）洗滌3次可有效去除大部分代謝產(chǎn)物且降低提取液黏稠度；無水乙醇析出DNA速度快且含量多、無需冷藏，大大地減少了試驗(yàn)時(shí)間；最后加入的RNase消化30 min能較快溶解DNA且有效提高了DNA純度，cCTAB法最終獲得的DNA濃度較試劑盒法提高了10倍多[CM（25]，經(jīng)濟(jì)可行。由于陳皮樣品較易于市場獲得，故本研究在陳皮的DNA提取方法上進(jìn)行了優(yōu)化，以期為今后市場流通的商品陳皮樣品的DNA分子鑒別提供參考依據(jù)。

ISSR分子標(biāo)記技術(shù)簡易、快捷、高多態(tài)性、引物通用[12-13]，但對反應(yīng)體系要求較高，體系內(nèi)細(xì)小變動(dòng)可能導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果及重復(fù)性較差。故本研究采用了正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化了茶枝柑的 ISSR-PCR 反應(yīng)體系，同時(shí)通過單因素內(nèi)優(yōu)化、12個(gè)退火溫度梯度優(yōu)化、多態(tài)性篩選，最終從100條ISSR通用引物里篩選出10條清晰、條帶豐富的作為茶枝柑及近緣種ISSR分子標(biāo)記的引物。引物擴(kuò)增多態(tài)位點(diǎn)比例90.04%，在分子水平證實(shí)了茶枝柑及近緣種間具有豐富的種內(nèi)遺傳多樣性。通過NTSYS軟件進(jìn)行相似系數(shù)和UPGMA聚類分析，在分子角度對茶枝柑及近緣種13種材料進(jìn)行初步區(qū)分，其中陳皮傳統(tǒng)入藥柑橘品種茶枝柑與福橘遺傳相似系數(shù)最高，表明中藥陳皮主要入藥柑橘品種間親緣關(guān)系較近。而聚類分析結(jié)果能夠直觀、科學(xué)地將茶枝柑與近緣種進(jìn)行劃分，為茶枝柑與其近緣種的科學(xué)篩選提供了分子生物學(xué)依據(jù)。

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