何孟杭，潘丹婷，梁敏，黃何何，戴明

（1. 福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院 國(guó)家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，福建 福州 350002；2. 中國(guó)人民解放軍第180醫(yī)院，福建 泉州 362000）

高效液相色譜-柱后衍生法測(cè)定保健品中維生素B1的含量*

何孟杭1，潘丹婷2，梁敏1，黃何何1，戴明1

（1. 福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院 國(guó)家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，福建 福州 350002；2. 中國(guó)人民解放軍第180醫(yī)院，福建 泉州 362000）

文章建立了測(cè)定保健品中維生素B1含量的高效液相色譜-柱后衍生法。方法采用色譜柱：UltimateXB-C18（4.6mm×150mm，5μm）；流動(dòng)相：（0.01%辛烷磺酸鈉+1.5 %乙酸+5%甲醇+0.12%三乙胺）-甲醇（65∶35）；流速：1.0 mL /min；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：Ex= 375nm，Em= 435nm。研究發(fā)現(xiàn)該柱后衍生法測(cè)定同一樣品中維生素B1含量得到的峰面積是柱前衍生法測(cè)定結(jié)果的1.6-18.8倍，維生素B1含量在0.01-32μg/mL范圍內(nèi)線性良好，R2=0.999，檢出限為1 ng/mL。該方法靈敏、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可用于保健品中維生素B1含量的測(cè)定。

維生素B1；高效液相色譜；柱后衍生法

維生素B1，又稱硫胺素或抗神經(jīng)炎素，在體內(nèi)以輔酶形式參與糖的分解代謝，有保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)的作用；還能促進(jìn)腸胃蠕動(dòng)，增加食欲，是一種常見的輔助藥物[1]。如果人體長(zhǎng)期缺乏維生素B1會(huì)引起糖代謝障礙和多發(fā)性神經(jīng)炎及腳氣病[2]。在中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)規(guī)定中，維生素B1的檢測(cè)方法主要有紫外-可見分光光度法[3]、熒光分光光度法[4-6]、化學(xué)分析法[7-9]、高效液相色譜法[4,10]等。目前，維生素B1的檢測(cè)多采用柱前衍生-液相色譜-熒光檢測(cè)法。但由于柱前衍生法存在一些缺點(diǎn)：1.形成的副產(chǎn)物可能對(duì)色譜分離造成較大困難；2.在衍生化過程中，容易引入雜質(zhì)或干擾峰，或使樣品損失；3.檢測(cè)樣品中很可能含有維生素C等還原性的物質(zhì)，該類物質(zhì)可與鐵氰化鉀發(fā)生氧化還原反應(yīng)，從而干擾硫色素反應(yīng)，使衍生反應(yīng)不完全，進(jìn)而影響維生素B1的定量。因此，文章采用將維生素B1在柱后衍生為熒光產(chǎn)物，避免了樣品中還原性物質(zhì)（如維生素C）與衍生劑中的鐵氰化鉀發(fā)生氧化還原反應(yīng)，運(yùn)用高效液相色譜-柱后衍生-熒光檢測(cè)法對(duì)維生素B1進(jìn)行定性、定量，同時(shí)與高效液相色譜-柱前衍生法的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。

1 c儀器與試劑

Waters 2695高效液相色譜儀；Waters 2475熒光檢測(cè)器；Waters柱后反應(yīng)器；電熱手提高壓蒸汽消毒器（上海醫(yī)用核子儀器廠）；臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；pH試紙（杭州特種紙業(yè)有限公司）；維生素B1對(duì)照品（上海安普科學(xué)儀器有限公司）；甲醇、辛烷磺酸鈉為色譜純；水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品柱前衍生分析

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Ultimate XB-C18（4.6mm×150mm，5μm）；流動(dòng)相：0.05 mol/L醋酸鈉（pH=4.5）的磷酸鹽溶液；流速：1.0mL/min；柱溫：35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：Ex= 375nm，Em=435nm；進(jìn)樣量：10μL。

2.1.2 樣品提取

稱取一定量樣品于錐形瓶中，加45ml蒸餾水溶解，再加入5ml濃度為 2mol/L的HCl溶液，錫箔紙封口，置于電熱手提高壓蒸汽消毒器中，在125℃條件下消解30 min后取出，迅速冷卻；用15%的KOH溶液調(diào)節(jié)pH至5，轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，定容，過濾。

2.1.3 提取液柱前衍生化

取上述濾液1.00mL于10mL具塞比色管中，加入1mL堿性鐵氰化鉀溶液，充分混勻后，加5.00mL正丁醇，強(qiáng)烈振蕩后靜置約10min，充分分層，吸取正丁醇相（上層）于4000～6000r/min離心5min，取上清液經(jīng)有機(jī)微孔濾膜（0.45μm）過濾，供進(jìn)樣用。另取1.00mL，濃度為4.12μg/mL的維生素B1對(duì)照品溶液，與試液同步進(jìn)行衍生化。

2.2 樣品柱后衍生分析

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Ultimate XB-C18（4.6mm×150mm，5μm）；流動(dòng)相：（0.01 %辛烷磺酸鈉+1.5 %乙酸+5%甲醇+0.12 %三乙胺）-甲醇（65∶35）；流速：1.0mL/min；柱溫：35℃；以堿性鐵氰化鉀溶液作衍生劑，流速：0.45mL/min；進(jìn)樣量：10μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：Ex=375nm，Em= 435nm；進(jìn)樣量：10μL。

2.2.2 供試品提取

供試品提取步驟同2.1.2處理后，再取濾液經(jīng)有機(jī)微孔濾膜（0.45μm）過濾，供進(jìn)樣用。

2.3 方法的線性范圍及檢出限實(shí)驗(yàn)

在優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)不同濃度的維生素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，以維生素B1的濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），由實(shí)驗(yàn)得出維生素B1在0.01～32μg/mL濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，回歸方程為：Y=1.175×108X-8.09×106，R2=0.999。以3倍信噪比（S/N）計(jì)算方法檢出限為1 ng/mL。

圖1 維生素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與峰面積的關(guān)系圖

2.4 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

回收率實(shí)驗(yàn)以不含維生素B1的某品牌保健品為空白基質(zhì)，進(jìn)行0.05、0.5、5μg /g 3個(gè)濃度水平的添加回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度水平重復(fù)5次，得到維生素B1的回收率和精密度列于表1。

表1 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=5）

2.5 柱前衍生法和柱后衍生法測(cè)定樣品中維生素B1含量的結(jié)果比較

2.5.1 對(duì)照品溶液的測(cè)定結(jié)果比較

實(shí)驗(yàn)中我們考察了柱前衍生-HPLC和柱后衍生-HPLC對(duì)同一維生素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定情況，圖2為這2種方法測(cè)定維生素B1的色譜圖，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，柱前衍生法（圖2(1)）中維生素B1的保留時(shí)間短，峰面積為9664842，柱后衍生法（圖2(2)）中維生素B1的保留時(shí)間長(zhǎng)，且峰面積為90353315。

圖2 柱前衍生-HPLC（1）與柱后衍生-HPLC（2）測(cè)定維生素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜

2.5.2 供試品溶液的測(cè)定結(jié)果比較

實(shí)驗(yàn)還考察了3種供試品采用柱前衍生-HPLC和柱后衍生-HPLC對(duì)維生素B1含量的測(cè)定，2種方法測(cè)定每種供試品的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表2和表3。數(shù)據(jù)結(jié)果可以得出，柱后衍生法測(cè)定同一供試品中維生素B1得到的峰面積是柱前衍生法測(cè)定結(jié)果的1.6-18.8倍，說明柱后衍生法降低了柱前衍生存在的負(fù)影響，提高了檢測(cè)方法的靈敏度，該方法用于保健品中維生素B1含量的測(cè)定是可行的。

表2： 柱前衍生法測(cè)定3種供試品溶液實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

表3：柱后衍生法測(cè)定3種供試品溶液實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

3 討論

3.1 提取條件的優(yōu)化

由于維生素B1為白色結(jié)晶體，易溶于水，在酸性溶液中很穩(wěn)定，在堿性溶液中不穩(wěn)定，易被氧化，受熱易被破壞，所以溶劑均以HCl為調(diào)節(jié)劑[1]。維生素B1在pH=2的HCl溶液中以分子狀態(tài)存在，穩(wěn)定性良好，但pH＞5時(shí)，將會(huì)分解[11]。因此，樣品經(jīng)酸水解后，選擇用15%的KOH溶液調(diào)節(jié)pH至5，以確保試驗(yàn)在酸性環(huán)境中進(jìn)行，便于結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.2 分離模式的優(yōu)化

維生素B1是由氨基嘧啶環(huán)和噻唑環(huán)通過亞甲基連接而成的季銨類化合物，噻唑環(huán)上的季銨及嘧啶環(huán)上的氨基為兩個(gè)堿性基團(tuán)，可與酸成鹽?？紤]到維生素B1在一定條件下可以以離子形式存在，因此采用離子對(duì)模式進(jìn)行分離。而離子對(duì)色譜法中，分析堿性物質(zhì)常用的離子對(duì)試劑為烷基磺酸鹽，如辛烷磺酸鈉可與堿性樣品形成很強(qiáng)的離子對(duì)。同時(shí)，離子對(duì)色譜法常采用C18柱，在一定的pH范圍內(nèi)進(jìn)行分離。因此，文章以辛烷磺酸鈉為離子對(duì)試劑，用C18柱以反向離子對(duì)模式進(jìn)行分離。

3.3 流動(dòng)相的優(yōu)化

方法在文獻(xiàn)[12]的基礎(chǔ)上，選擇了辛烷磺酸鈉作為離子對(duì)試劑來(lái)分離測(cè)定水溶性維生素。實(shí)際操作中發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相中不加三乙胺，維生素B1的峰形嚴(yán)重拖尾；加入三乙胺后，各峰的峰形和分離度均顯著改善，保留時(shí)間也大大減少。通過反復(fù)試驗(yàn)，優(yōu)化出最佳流動(dòng)相條件為（0.01%辛烷磺酸鈉+1.5%乙酸+5%甲醇+0.12%三乙胺）-甲醇（65∶35）。采用該流動(dòng)相，分離效果好，且容量因子適中，結(jié)果滿意。

4 結(jié)論

結(jié)果表明，方法較好地解決了樣品維生素B1的提取、凈化與雜質(zhì)分離等問題。該方法具有專屬性強(qiáng)、線性范圍廣、靈敏度高、樣品處理簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)還可避免還原性物質(zhì)等對(duì)化學(xué)衍生反應(yīng)的干擾，是保健品中維生素B1含量測(cè)定較理想的方法。

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[4] 全國(guó)飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì).飼料中維生素B1的測(cè)定：GB/T 14700-2002[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003：3.

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[8] 全國(guó)飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì).飼料添加劑 維生素B1（硝酸硫胺）：GB/T 7296-2008[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008：6.

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10.3969/j.issn.1007-550X.2017.03.002

O657.7+2

A

1007-550X（2017）03-0036-04

福建省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局科技項(xiàng)目（FJQI2014037）

2017-01-10

何孟杭（1985- ），男，福建寧德人，工程師，碩士研究生，主要從事食品加工技術(shù)研究。