黎乃維+姜齊永

【摘 要】實(shí)驗(yàn)以市場上的微生物肥料為研究目標(biāo)，從樣品中分離菌株，并通過菌落形態(tài)、革蘭氏染色、生化等實(shí)驗(yàn)鑒定出3株菌株，結(jié)果菌株A為褐球固氮菌，菌株B為球形芽孢桿菌，菌株M為藤黃微球菌。

【關(guān)鍵詞】微生物肥料；菌株；分離與鑒定

【Abstract】In this study， microbial fertilizer was bought from market as the research object. And 3 strains separated from it. The representative strains of them were marked as A， B， M. Pure bacterial culture and identification showed that the strain A attributed to Azotobacter chroococcum， the strain B was Bacillus spaericus， the strain M was Micrococcus luteus.

【Key words】Microbial fertilizer； Bacterial strain； Separate and identify

近百年來，農(nóng)藥和化肥的施用對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)作出了巨大的貢獻(xiàn)，但長期過分的對化學(xué)肥料和農(nóng)藥的依賴，造成大量不可再生能源的浪費(fèi)，如農(nóng)田有機(jī)質(zhì)不足，土壤板結(jié)、結(jié)塊，肥力下降，農(nóng)作物品質(zhì)降低。隨著生態(tài)農(nóng)業(yè)和綠色食品生產(chǎn)的興起和發(fā)展，微生物肥料逐步引起了人們的重視[1]。由于微生物肥料具有培肥地力、改良土壤、抗旱、促早熟的功效，可以消減因大量使用化學(xué)肥料而引起的環(huán)境質(zhì)量等優(yōu)勢，得到了很大的發(fā)展空間，并成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[2-3]。微生物肥料是活菌制劑，其肥效與活菌數(shù)量、強(qiáng)度及周圍環(huán)境條件都密切相關(guān)，包括溫度、水分、酸堿度、營養(yǎng)條件及微生物之間的相互作用都有一定影響。為此，對復(fù)合微生物肥料中主要細(xì)菌進(jìn)行研究鑒定，以期人們更好地認(rèn)識(shí)和應(yīng)用有良好前景的微生物肥料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試樣品

本實(shí)驗(yàn)樣品為某液態(tài)復(fù)合微生物肥料，試驗(yàn)中分離、鑒定等試驗(yàn)的細(xì)菌均來源于此樣品。

1.1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基配方和濃度按照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》[4]、《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[5]及《一般細(xì)菌常用鑒定方法》[6]配制。

1.1.3 培養(yǎng)條件

除了特別說明外，培養(yǎng)條件為 30℃、200r/min，培養(yǎng)時(shí)間為2d。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的處理

將購置的某復(fù)合微生物肥料（液體）迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，放入冰箱低溫4℃保存。移取搖勻后的樣品10mL到裝有90mL的無菌生理鹽水的錐形瓶中，搖勻，制成菌懸液，得到10-1的稀釋液。移取1 mL稀釋液到9 mL無菌水中，搖勻，得到10-2稀釋液。反復(fù)稀釋可以得到10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8等細(xì)菌稀釋梯度。

1.2.2 細(xì)菌的分離

選取三個(gè)稀釋度（10-3、10-4、10-5）的菌懸液0.1mL涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)2-3d。通過觀察菌落的形態(tài)特征，將平板培養(yǎng)基上生長良好的菌落，按照菌落大小、形態(tài)、顏色、光澤度、透明度、質(zhì)地、隆起形狀、邊緣特征及遷移性等特征，用酒精燈燒過滅菌的冷接種針分別挑取不同種類的菌落至新鮮的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)1-2d。經(jīng)過2-3次平板劃線純化菌種，將細(xì)菌轉(zhuǎn)種到斜面培養(yǎng)基上，置冰箱4℃下保存。

1.2.3 細(xì)菌的鑒定

根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[5]第八版及《一般細(xì)菌常用鑒定方法》[6]對分離細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色、鞭毛染色、芽抱染色和對糖、酶的生理生化反應(yīng)測定等實(shí)驗(yàn)，鑒定分屬。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的分離與鑒定結(jié)果

觀察各培養(yǎng)皿中的菌落形態(tài)、大小、顏色等特征，挑取幼培養(yǎng)物的菌落進(jìn)行革蘭氏染色和莢膜染色，鏡檢，觀察各細(xì)菌的形態(tài)特征，挑取較老的菌落進(jìn)行芽孢染色，從中鑒定出3株菌株，并對3株菌株進(jìn)行解磷、解鉀、固氮試驗(yàn)，表1是試驗(yàn)結(jié)果。

表2是三種菌株與相似菌株生理生化特征比較結(jié)果。菌株A是大的橢圓形細(xì)胞，直徑2.5 um，細(xì)胞單個(gè)，革蘭氏陽性，不形成芽孢，產(chǎn)生莢膜粘液，能夠固氮，這些特征與褐球固氮菌（Azotobacter chroococcum）的特征吻合。從表2可以看出，菌株A的生理生化特征試驗(yàn)結(jié)果與其相似菌株褐球固氮菌的特征一致，可將菌株A定為褐球固氮菌。褐球固氮菌為固氮菌屬，能進(jìn)行生物固氮是該屬的主要特征。它在土壤中廣泛存在，增加土壤肥力，可以促進(jìn)作物生長。

菌株B是短桿狀得細(xì)胞，呈鏈狀排列，革蘭氏陽性，有芽孢，這些特征與芽孢桿菌屬的特征吻合。從表2可以看出，菌株B的生理生化特征試驗(yàn)結(jié)果與其相似菌株球形芽孢桿菌（Bacillus spaericus）的特征一致，鑒定為球形芽孢桿菌。球形芽孢桿菌是一種在自然界中廣泛分布、形成亞末端膨大孢子囊和球形芽孢的好氣芽孢桿菌。球形芽孢桿菌的殺蚊譜較窄，其中對庫蚊屬幼蟲的毒性最強(qiáng)，在污水中的藥效維持時(shí)間較長，特別適用于污水中孳生的庫蚊屬幼蟲（淡色庫蚊和致倦庫蚊）的控制。

菌株M細(xì)胞是微球狀、堆形，菌落致密光滑，泛黃，這些特征都與藤黃微球菌相符合。從表2可以看出，菌株M的生理生化特征試驗(yàn)的結(jié)果與其相似菌株藤黃微球菌（Micrococcus luteus）的生理生化特征一致，將它鑒定為藤黃微球菌。 藤黃微球菌多見于土壤和水中，也見于人和動(dòng)物的皮膚上，為非致病菌。

3 結(jié)論

論文通過一系列試驗(yàn)對樣品復(fù)合微生物肥料中菌株進(jìn)行分離，得到3株菌株，并定性分析了它們的解鉀、解磷、固氮能力，通過對3株菌株的生理生化試驗(yàn)及與相似菌株的特征比較，鑒定出菌株A為褐球固氮菌，菌株B為球形芽孢桿菌，菌株M則為藤黃微球菌，查閱文獻(xiàn)分析了3株菌株的生活習(xí)性和作用。

【參考文獻(xiàn)】

[1]葛誠.微生物肥料生產(chǎn)應(yīng)用基礎(chǔ)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科技出版社，2000：13-14.

[2]葛誠.微生物肥料研究、生產(chǎn)和應(yīng)用的幾個(gè)問題[J].微生物學(xué)通報(bào)，1995（6）：27-32.

[3]吳薇，葛誠.我國微生物肥料生產(chǎn)和應(yīng)用現(xiàn)狀的調(diào)查研究[J].微生物學(xué)通報(bào)，1995（2）：25-29.

[4]沈萍.微生物實(shí)驗(yàn)，第4版[M].北京：高等教育出版社，2013.

[5]R.E.布壩南，N.E.吉本斯.伯杰氏鑒定手冊，第8版[M].北京： 科學(xué)出版社，1984.

[6]中國科學(xué)院微生物研究所細(xì)菌分類組編著.一般細(xì)菌常用鑒定方法[M].北京：科學(xué)出版社，1978.

[責(zé)任編輯：朱麗娜]endprint