楊曉玫, 馮 起, 呂丹彤, 姚 拓, 李 琦, 謝華山

(1.中國(guó)科學(xué)院西北生態(tài)環(huán)境資源研究院內(nèi)陸河流域生態(tài)水文重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070； 3.草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 甘肅 蘭州 730070； 4.中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

植物根際促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)特性，是指促生菌適宜的生長(zhǎng)環(huán)境以及突出的特性，能反映促生菌保藏前后的穩(wěn)定性[1]。植物根際促生菌的特性(如生長(zhǎng)速度、遺傳穩(wěn)定性、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值以及抗病性大小等)能直接決定菌株的利用價(jià)值和工業(yè)開(kāi)發(fā)。菌株生長(zhǎng)速率較快，容易培養(yǎng)和開(kāi)發(fā)，能提高工業(yè)化的生產(chǎn)效率；菌株遺傳穩(wěn)定性高，能增加工業(yè)化生產(chǎn)的穩(wěn)定性和可操作性；菌株?duì)I養(yǎng)價(jià)值較高，能降低培養(yǎng)成本，降低其產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)價(jià)值；菌株抗病性強(qiáng)，能有效抵御病原菌的入侵，阻止雜菌的污染[2]。PGPR具有促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，抑制植物病原菌繁殖，改善植物根際微生態(tài)，降低土壤污染物含量等作用，其常被制成生物菌肥(菌液)替代或部分替代化肥和農(nóng)藥的使用，能有效改良土壤及防止土壤退化[3-4]。對(duì)優(yōu)良根際促生菌的研究，需評(píng)價(jià)菌株穩(wěn)定性，不能針對(duì)單一突出特性片面研究。

植物根際促生菌的合理保藏是后期研究的基礎(chǔ)，其主要目的是使篩選得到的優(yōu)良菌株減少雜菌污染、變異、死亡，降低微生物菌株的新陳代謝，減緩促生菌的生長(zhǎng)，并使菌株保持良好的活性[5]。不同的保藏時(shí)間，菌株的生長(zhǎng)速率等生物學(xué)特性不同，保藏方法不恰當(dāng)及保藏時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，菌株的生長(zhǎng)速率會(huì)出現(xiàn)一定程度的降低[6-8]，故對(duì)促生菌株活性和穩(wěn)定性的檢測(cè)尤為重要。低溫冷凍斜面保藏通過(guò)控制菌株生長(zhǎng)的溫度、濕氣及氧氣等，抑制微生物的生長(zhǎng)代謝活動(dòng)，使菌株的生長(zhǎng)繁殖處于休眠狀態(tài)，其代謝處于最低水平，不易產(chǎn)生生產(chǎn)能力退化現(xiàn)象，并保持菌株自身的生物學(xué)特性[9]。針對(duì)不同的菌株類型有不同的保藏方法，保藏后菌株的生物學(xué)特性需進(jìn)行比較研究，變化趨勢(shì)低的方可進(jìn)行后期的研究和開(kāi)發(fā)利用[10-11]。

PGPR是一類優(yōu)良植物根際促生菌，因其突出的特性被大量開(kāi)發(fā)為微生物菌肥或微生物菌劑等，但促生菌特性可能會(huì)因?yàn)楸２貢r(shí)間過(guò)長(zhǎng)或菌株的穩(wěn)定性差等原因發(fā)生改變，直接影響菌株后續(xù)研究的正確性[12-14]。前期的研究已經(jīng)證實(shí)BacillusmycoidesGnyt1菌株有優(yōu)良的開(kāi)發(fā)潛力[15]，目前針對(duì)芽孢桿菌保藏前后生物學(xué)特性的基礎(chǔ)研究和芽孢桿菌的分子生物研究鮮有報(bào)道，因此，本文以保藏兩年后的BacillusmycoidesGnyt1菌株為研究材料，再次測(cè)定其菌株的特性，參照保藏前BacillusmycoidesGnyt1菌株的特性指標(biāo)，檢測(cè)BacillusmycoidesGnyt1菌株特性的穩(wěn)定性，以期為后續(xù)BacillusmycoidesGnyt1菌株比較基因組學(xué)和功能基因等方面的深入研究提供理論依據(jù)和可靠的保障。

1 材料與方法

1.1 材料

研究菌株BacillusmycoidesGnyt1是2014年分離自天祝高寒草地優(yōu)勢(shì)植物珠芽蓼(Polygonumviviparum)根際的一株優(yōu)良根際促生菌[12]，低溫冷凍斜面保藏于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院草地微生物多樣性實(shí)驗(yàn)室。2017年本課題組測(cè)定發(fā)現(xiàn)其生物特性表現(xiàn)突出穩(wěn)定性較高[15]，對(duì)照菌株Gm92，426，89，93等均為課題組前期研究中積累的優(yōu)良菌株材料，均為低溫冷凍斜面保藏，其特性見(jiàn)表1。菌株保藏2年后，對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行測(cè)定。

表1 對(duì)照菌株的功能特性Table 1 Features of the benchmark

1.2 方法

1.2.1菌株保藏 菌株保藏采用低溫冷凍斜面保藏法，試管中配制LB固體斜面培養(yǎng)基，待冷卻凝固后用無(wú)菌接種針接種已培養(yǎng)好的菌株，采用S型分別在試管LB固體斜面培養(yǎng)基上劃線，置于-20℃冷凍冰箱隔離保藏，間隔60天重復(fù)此方法活化并置冰箱保藏。

1.2.2菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定 分別使用兩步法活化菌株，即Luria-Bertani(LB)固體培養(yǎng)基(pH=7)第一次活化，次日轉(zhuǎn)入LB培養(yǎng)液(pH=7)28℃ 180 r·min-1培養(yǎng)24 h左右，至菌株的OD600相同。采用平板涂布法每隔4 h取樣1 mL培養(yǎng)液，等間隔取樣至72 h，測(cè)定不同時(shí)間及不同時(shí)期的菌株活菌的數(shù)量，分析數(shù)據(jù)并繪制菌株生長(zhǎng)曲線。

1.2.3菌株對(duì)pH的適應(yīng)能力測(cè)定 分別配置pH為4，5，6，7，8，9的LB液體培養(yǎng)基，不同菌株分別等量接種于不同pH培養(yǎng)液中，28℃條件培養(yǎng)48 h，測(cè)定菌株OD600值及有效活菌數(shù)，分別涂布于固體培養(yǎng)基計(jì)算有效活菌數(shù)，并對(duì)比分析不同pH對(duì)不同菌株生長(zhǎng)的影響。

1.2.4菌株對(duì)溫度耐受性的測(cè)定 分別使用兩步法活化菌株，即LB固體培養(yǎng)基(pH=7)第一次活化各菌株，次日轉(zhuǎn)入LB培養(yǎng)液28℃ 180 r·min-1培養(yǎng)24 h左右，至菌株的OD600相同進(jìn)行測(cè)定。取1 mL菌株培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基(pH=7)中，設(shè)置未轉(zhuǎn)接菌株培養(yǎng)液為空白對(duì)照，分別置于4℃，8℃，12℃，16℃，20℃，24℃，28℃，32℃，36℃，40℃恒溫培養(yǎng)32 h，32 h后取樣測(cè)定菌株OD600及有效活菌數(shù)，分析不同溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。

1.2.5菌株溶磷特性的測(cè)定 菌株溶磷特性的測(cè)定采用鉬藍(lán)比色法，配制150 mL蒙金娜液體培養(yǎng)基和PKO液體培養(yǎng)基，使用無(wú)菌接種針?lè)謩e依次將菌株接種至液體培養(yǎng)基中，28℃180 r·min-1培養(yǎng)14 d，取出5 mL上清液，4℃ 10 000 r·min-1離心10 min，加至45 mL 0.5 mol·L-1NaHCO3中，繼續(xù)加入1 g無(wú)磷活性碳粉，震蕩后過(guò)濾，分別取相同的過(guò)濾液，加入顯色液，測(cè)定其吸光值并依據(jù)公式計(jì)算菌株磷含量[2]

公式如下：

在上式中，ρ代表溶液中的磷含量，單位為μg·mL-1；V代表待測(cè)液的體積，單位為mL；Ts代表分取的倍數(shù)；V0代表所取的待測(cè)菌株培養(yǎng)液的體積，單位為mL。

1.2.6菌株固氮特性的測(cè)定 菌株固氮特性的測(cè)定采用乙炔還原法，均以固氮酶活性表示，以nmol(C2H4)·h-1·mL-1為單位，具體試驗(yàn)方法如下：配制NFM半固體培養(yǎng)基，放入滅菌西林瓶中，培養(yǎng)基中分別接入待測(cè)菌株，塞入純棉透氣塞封口，28℃恒溫培養(yǎng)48 h后將純棉透氣塞換為橡膠密封塞，培養(yǎng)數(shù)分鐘，使用無(wú)菌針管抽出1 mL空氣，繼續(xù)注入等體積乙炔，密封置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h，最后用氣相色譜法分別測(cè)定培養(yǎng)后瓶?jī)?nèi)混合氣體中乙炔的濃度大小，根據(jù)公式計(jì)算出各菌株的固氮酶活性[2]：

公式中，N表示待測(cè)菌株的固氮酶活性，單位為nmol(C2H4)·h-1·mL-1；Hx代表測(cè)出的乙炔的峰面積；C為最后培養(yǎng)后混合氣體中乙炔的濃度，單位為nmol·mL-1；V代表所選用的西林瓶的容積，單位為mL；Hs代表標(biāo)樣乙炔的GC峰面積；t代表待測(cè)菌株培養(yǎng)的時(shí)間，單位為h；24.9表示標(biāo)準(zhǔn)C2H4氣體在測(cè)試時(shí)的體積(mL)[1]。

1.2.7菌株分泌植物激素(吲哚乙酸(Indole acetic acid，IAA))特性的測(cè)定 菌株分泌植物激素(IAA)特性采用HPLC法測(cè)定。具體試驗(yàn)方法如下：配置LB液體培養(yǎng)基，分別接入待測(cè)菌株，28℃恒溫條件180 r·min-1暗培養(yǎng)72 h，隨后分別將培養(yǎng)液低溫10 000 r·min-1離心15 min，無(wú)菌離心管中收集離心所得的上清液，加入至活化好的SPE柱內(nèi)，10%甲醇淋洗，80%甲醇洗脫，采用氮?dú)獯蹈煞饪s洗脫液，參考劉婷等[12]的色譜條件，使用HPLC法依次檢測(cè)。

1.2.8數(shù)據(jù)處理與分析 采用Excel 2010整理數(shù)據(jù)，軟件SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析，多重比較采用新復(fù)極差法(Duncan)，顯著性水平設(shè)為0.05，數(shù)據(jù)表示為“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，采用Sigmaplot 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)的測(cè)定

菌株的生長(zhǎng)曲線反映了菌株在培養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)程中繁殖和衰退的規(guī)律，菌株在適宜的條件下培養(yǎng)，會(huì)有延滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰退期4個(gè)時(shí)期。圖1為研究菌株BacillusmycoidesGnyt1和4株對(duì)照菌株的生長(zhǎng)曲線。所有菌株從各自培養(yǎng)基接至新配好的培養(yǎng)液中均有適應(yīng)期，主要表現(xiàn)為菌株生長(zhǎng)比較緩慢，以適應(yīng)不同的新環(huán)境，不同菌株的適應(yīng)期很接近。在接種第12 h以后，菌株均能迅速繁殖，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，各菌株的菌體迅速增長(zhǎng)。但菌株的類型不同，進(jìn)入對(duì)數(shù)期的生長(zhǎng)速率不相同，表現(xiàn)為不同菌株24 h菌株生長(zhǎng)量不相同，研究菌株BacillusmycoidesGnyt1在24 h對(duì)數(shù)期的生長(zhǎng)速率最高，證明其增殖速率最快。所有菌株培養(yǎng)至36 h～48 h，均緩慢進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，所有菌株在60 h之后慢慢進(jìn)入衰亡期。菌株類型不同則生長(zhǎng)速率不相同，本研究中菌株BacillusmycoidesGnyt1和對(duì)照菌株Ensifermeliloti93的生長(zhǎng)速率高于其余三株菌。

2.2 菌株最適pH的測(cè)定

不同的pH值變化會(huì)直接影響菌株的生長(zhǎng)速率。由圖2可知，在生長(zhǎng)環(huán)境pH低于4時(shí)，菌株均不生長(zhǎng)。在生長(zhǎng)環(huán)境pH高于4時(shí)菌株開(kāi)始慢慢生長(zhǎng)，菌株活性較低，研究菌株和對(duì)照菌株之間的差異不明顯。在生長(zhǎng)環(huán)境pH達(dá)到5時(shí)，所有菌株開(kāi)始生長(zhǎng)，不同的菌株有一定的差異，菌株Ensifermeliloti93生長(zhǎng)最緩慢，Ensifermeliloti426和Bacillussubtilis89菌株次之，研究菌株BacillusmycoidesGnyt1和Pseudomonassp. Gm92生長(zhǎng)狀況最佳。在菌株生長(zhǎng)環(huán)境pH為6～7時(shí)，對(duì)照菌株P(guān)seudomonassp. Gm92，Bacillussubtilis89和研究菌株BacillusmycoidesGnyt1的生長(zhǎng)速率達(dá)到最高值，而菌株Ensifermeliloti426和菌株Ensifermeliloti93達(dá)到最大生長(zhǎng)率的環(huán)境pH值為8。在菌株生長(zhǎng)環(huán)境pH超過(guò)9時(shí)，研究菌株BacillusmycoidesGnyt1和對(duì)照菌株P(guān)seudomonassp. Gm92生長(zhǎng)速率逐漸下降，其他菌株的生長(zhǎng)速率下降，菌株生長(zhǎng)環(huán)境pH繼續(xù)增加時(shí)，所有菌株停止生長(zhǎng)。綜上所述，本文的研究菌株BacillusmycoidesGnyt1 pH耐受性高，pH 4～9均能生長(zhǎng)，最適的生長(zhǎng)pH在6～7之間。

2.3 菌株最適溫度的測(cè)定

菌株適宜的生長(zhǎng)環(huán)境溫度是決定菌株正常生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素之一。由圖3可知，在生長(zhǎng)溫度為4℃時(shí)各菌株均未生長(zhǎng)，在生長(zhǎng)溫度為16℃時(shí)各菌株生長(zhǎng)緩慢且生長(zhǎng)速率不同，其中研究菌株BacillusmycoidesGnyt1生長(zhǎng)速率最高。生長(zhǎng)溫度至28℃時(shí)，各菌株生長(zhǎng)速率均增長(zhǎng)，其中以研究菌株BacillusmycoidesGnyt1生長(zhǎng)最好。在生長(zhǎng)溫度為34℃～40℃時(shí)，除研究菌株BacillusmycoidesGnyt1和對(duì)照菌株P(guān)seudomonassp. Gm 92以外的菌株生長(zhǎng)速率隨溫度的增高而降低，說(shuō)明研究菌株BacillusmycoidesGnyt1具有很強(qiáng)的溫度耐受性。在溫度到達(dá)40℃以上，所有菌株的生長(zhǎng)明顯受到抑制。綜上所述，研究菌株BacillusmycoidesGnyt1具有很強(qiáng)的溫度耐受性，8℃～40℃均能正常生長(zhǎng)，但研究菌株BacillusmycoidesGnyt1的最適生長(zhǎng)溫度為28℃～34℃。

圖3 菌株生長(zhǎng)溫度曲線Fig.3 Strain growth temperature

2.4 菌株的溶磷能力

溶解無(wú)機(jī)磷的菌株，會(huì)伴隨生長(zhǎng)不斷產(chǎn)酸，酸性環(huán)境下菌株能將無(wú)機(jī)磷溶解為有效磷。如圖4所示，五株菌株均具有溶磷能力，不同的菌株溶解無(wú)機(jī)磷的能力不同，菌株有效磷含量越高說(shuō)明菌株的溶磷能力越高。其中菌株Bacillussubtilis89和研究菌株BacillusmycoidesGnyt1溶磷能力最好，有效磷含量分別為324.49 μg·mL-1和285.17 μg·mL-1，顯著高于菌株P(guān)seudomonassp. Gm92和菌株Ensifermeliloti426 (P<0.05)，菌株Ensifermeliloti426的溶磷能力最低，有效磷含量為55.42 μg·mL-1。結(jié)果表明研究菌株BacillusmycoidesGnyt1溶磷能力較高，可繼續(xù)作為研究菌株深入研究溶磷機(jī)理和溶磷功能基因。

圖4 菌株的溶磷能力Fig.4 Phosphate dissolving ability of the strain注：不同小寫字母表示同一指標(biāo)不同菌株表達(dá)量差異顯著(P<0.05)。下同Note:Different lowercase letters indicate that the expression levels of different strains of the same index are significantly different (P<0.05). The same as below

2.5 菌株的分泌植物激素能力

菌株BacillusmycoidesGnyt1和四株對(duì)照菌株Ensifermeliloti93,Pseudomonassp. Gm92,Ensifermeliloti426和Bacillussubtilis89保藏后的分泌植物激素的能力如圖5所示，五株菌株均有分泌植物激素IAA的能力，其中菌株Ensifermeliloti426、菌株Ensifermeliloti93和研究菌株BacillusmycoidesGnyt1分泌植物激素IAA能力較高，顯著高于菌株P(guān)seudomonassp. Gm92和菌株Bacillussubtilis89 (P<0.05)，對(duì)照菌株Bacillussubtilis89的分泌植物激素IAA能力最低。結(jié)果表明研究菌株BacillusmycoidesGnyt1分泌植物激素IAA能力較高，能繼續(xù)作為研究菌株進(jìn)行后續(xù)的深入研究。

圖5 菌株的分泌植物激素能力Fig.5 Strain producing ability of the strain

2.6 菌株的固氮能力

研究菌株BacillusmycoidesGnyt1和四株對(duì)照菌株保藏后的固氮酶活性如圖6所示，其中，研究菌株BacillusmycoidesGnyt1固氮酶活性最高，顯著高于其他四株對(duì)照菌株(P<0.05)，對(duì)照菌株Bacillussubtilis89次之，菌株Ensifermeliloti426固氮能力最低。結(jié)果表明研究菌株BacillusmycoidesGnyt1固氮能力最強(qiáng)，可繼續(xù)作為研究菌株深入研究固氮機(jī)理和固氮功能基因。

圖6 菌株固氮酶活性Fig.6 Strain nitrogenase activity

3 討論

生長(zhǎng)速率高、培養(yǎng)溫度適中、培養(yǎng)條件便于調(diào)控、pH適中及生物安全性高、穩(wěn)定性高的菌株可進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用[17-18]。保藏前菌株BacillusmycoidesGnyt1最適生長(zhǎng)溫度為28℃～36℃，最適pH為7～8，增殖速度快，其溶磷能力、分泌植物激素能力及固氮能力相比課題組前期研究積累的優(yōu)良菌株更為突出[15,19]。本研究表明，與菌株BacillusmycoidesGnyt1保藏前的特性以及和課題組積累的優(yōu)良對(duì)照菌株相比，菌株BacillusmycoidesGnyt1保藏后生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)、最適pH及最適溫度均無(wú)明顯變化，研究菌株能高效的溶解無(wú)機(jī)磷，固氮能力最高且分泌植物激素(IAA)的能力較強(qiáng)，特性穩(wěn)定性高，綜合評(píng)價(jià)表明菌株BacillusmycoidesGnyt1仍為優(yōu)良促生菌株，可以進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用和深入研究。研究菌株BacillusmycoidesGnyt1的高穩(wěn)定性，可能與菌株宿主植物生長(zhǎng)在高寒環(huán)境有關(guān)，能抵抗環(huán)境的變化[20]。適宜的菌株保藏可以促進(jìn)優(yōu)良菌株資源庫(kù)的發(fā)展，且特性突出的菌株遺傳穩(wěn)定性較高，傳代培養(yǎng)或保藏后退化不明顯，不影響菌株的開(kāi)發(fā)利用，這一結(jié)果與胡江春研究中的結(jié)果相似[21]。對(duì)植物促生菌的功能進(jìn)行研究，必須要對(duì)比測(cè)定特性的變化，保證后期研究材料的正確性和有效性。因此，植物促生菌的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)、pH值、溫度以及突出特性的研究對(duì)選育菌株和保藏菌株均有重要的評(píng)價(jià)作用。

優(yōu)良植物根際促生菌通常具有溶磷、固氮或分泌植物激素的一種或多種突出生物功能[24]，溶磷菌不代表只能溶磷，可能也有固氮功能[22]，其中測(cè)定菌株固氮酶活性的高低是確認(rèn)菌株固氮能力的傳統(tǒng)方法，能直接反映菌株固氮能力強(qiáng)弱[23]，菌株傳代保藏使菌株固氮能力產(chǎn)生些許退化屬于正?，F(xiàn)象。因此，選育良好的多功能菌株，必須要全方面衡量菌株，合理的保藏菌株對(duì)后期研究頗為重要，能評(píng)價(jià)菌株的后續(xù)可利用性及保藏方法的可行性[25-26]。本研究菌株BacillusmycoidesGnyt1使用低溫冷凍斜面保藏方法，保藏后菌株BacillusmycoidesGnyt1的溶磷能力、固氮能力和分泌植物激素能力均較高，說(shuō)明低溫冷凍斜面保藏的方法可行，但此方法不適合長(zhǎng)期保藏。菌株保藏的方式多種，而適合細(xì)菌科學(xué)有效的保存方法有低溫冷凍斜面保藏和甘油冷凍保藏，甘油冷凍保藏適合多年及以上的長(zhǎng)期細(xì)菌菌株的保藏，短期及菌株的活化多用低溫冷凍斜面保藏方法[27-30]。

植物根際促生菌因其優(yōu)良的生物學(xué)特性，成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)[31-32]。菌株的溶磷能力、分泌植物激素能力和固氮能力會(huì)隨菌株的生長(zhǎng)時(shí)間而發(fā)生一定程度的降低，降低程度的大小根據(jù)菌株的類型、生長(zhǎng)時(shí)間和保藏方法的差異而不同[33]。菌株的長(zhǎng)期有效利用需對(duì)比其他優(yōu)良促生菌的生物學(xué)特性，通過(guò)比較確定菌株的優(yōu)勢(shì)[34]，決定是否有后期利用的潛力。本研究選取菌株BacillusmycoidesGnyt1保藏前測(cè)定生物性能的對(duì)照菌株及同類型的優(yōu)良菌株作為對(duì)照菌株，綜合比較研究菌株和對(duì)照菌株的生物性能，其中研究菌株BacillusmycoidesGnyt1的溶磷能力、分泌植物激素能力及固氮能力均顯著高于4株對(duì)照菌株，其功能豐富、特性優(yōu)良，仍為優(yōu)良菌株，這與菌株BacillusmycoidesGnyt1保藏前相比對(duì)照菌株測(cè)定生物性能的結(jié)果一致[15]，保證了后期研究選擇該菌株的可靠性和合理性。比較保藏前后的菌株BacillusmycoidesGnyt1的生物學(xué)特性，除菌株生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)、最適pH及最適溫度無(wú)變化外，菌株BacillusmycoidesGnyt1的溶磷能力、分泌植物激素能力及固氮能力降低均不顯著，符合菌株保藏的降低范圍，這與秦婷婷等[35]的微生物保藏研究結(jié)論一致，合理適宜的菌株保藏方法能避免不良因素的影響，能使優(yōu)良菌株的特性穩(wěn)定保存，可提供優(yōu)良穩(wěn)定的菌株供后期分子生物學(xué)等研究的研究材料。

4 結(jié)論

本研究將保藏兩年后的菌株BacillusmycoidesGnyt1與四株優(yōu)良植物促生菌進(jìn)行比較，結(jié)果表明研究菌株BacillusmycoidesGnyt1特性穩(wěn)定性較高，增殖速度最快，活菌濃度最高，對(duì)環(huán)境pH有很強(qiáng)耐受性，最適pH值在6～7之間，對(duì)環(huán)境溫度耐受性高，最適生長(zhǎng)溫度為28℃～34℃。其溶磷能力、固氮能力及分泌生長(zhǎng)激素的能力均較強(qiáng)，保藏兩年后仍可繼續(xù)作為研究菌株深入研究其功能機(jī)理和功能基因。