王中鐸+郭昱嵩+劉皓+劉麗+劉楚吾

【摘 要】以湖棲鰭蝦虎魚(yú)為實(shí)驗(yàn)材料，從受精、正常胚胎發(fā)育過(guò)程的觀察，環(huán)境因素對(duì)胚胎發(fā)育的影響，內(nèi)分泌干擾物的濃度梯度刺激對(duì)胚胎發(fā)育的形態(tài)學(xué)觀察及相關(guān)基因表達(dá)水平的檢測(cè)等一系列連續(xù)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)，可為生物科學(xué)專業(yè)發(fā)育生物學(xué)的綜合性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供參考，使學(xué)生掌握一系列發(fā)育生物學(xué)的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)，增強(qiáng)學(xué)生對(duì)知識(shí)的理解層次，培養(yǎng)學(xué)生的科研興趣。

【關(guān)鍵詞】發(fā)育生物學(xué)；綜合性實(shí)驗(yàn)；湖棲鰭蝦虎魚(yú)

發(fā)育生物學(xué)的產(chǎn)生是以胚胎學(xué)為基礎(chǔ)，并融入分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)和生物化學(xué)等學(xué)科的相關(guān)知識(shí)和技術(shù)，從20世紀(jì)70年代開(kāi)始形成一門(mén)獨(dú)立的學(xué)科，近年來(lái)取得了巨大進(jìn)展，成為解釋生物個(gè)體發(fā)育的基礎(chǔ)學(xué)科，也成為生命科學(xué)領(lǐng)域最活躍的學(xué)科之一。國(guó)內(nèi)外各高等院校紛紛開(kāi)設(shè)發(fā)育生物學(xué)作為本科生的專業(yè)基礎(chǔ)課程，并開(kāi)設(shè)實(shí)驗(yàn)教學(xué)課程以增加學(xué)生理解層次及培養(yǎng)學(xué)生科學(xué)思維和綜合素質(zhì)[1-3]。發(fā)育生物學(xué)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括生殖細(xì)胞的發(fā)生、受精、個(gè)體發(fā)育的過(guò)程、功能基因表達(dá)基因調(diào)控的機(jī)制和原理、發(fā)育與環(huán)境的關(guān)系、凋亡和再生、發(fā)育與進(jìn)化等等；同時(shí)吸納了分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、胚胎學(xué)等很多領(lǐng)域的研究手段。發(fā)育生物學(xué)發(fā)展速度快、但架構(gòu)不成熟。相比其他生物學(xué)分支學(xué)科，發(fā)育生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)還處于剛剛起步階段，統(tǒng)一的、可廣泛接受和采納的教學(xué)體系還沒(méi)有形成[4]。傳統(tǒng)的發(fā)育生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容中相當(dāng)比重來(lái)源于胚胎學(xué)實(shí)驗(yàn)，主要是作為理論教學(xué)的補(bǔ)充，以驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)為主，而綜合性、設(shè)計(jì)性的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容相對(duì)比較少，對(duì)學(xué)生綜合素質(zhì)、創(chuàng)新能力的培養(yǎng)沒(méi)有得到足夠重視[5]。通過(guò)綜合性的實(shí)驗(yàn)，能夠充分發(fā)揮實(shí)驗(yàn)教學(xué)作用，使學(xué)生從準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料、藥品試劑到具體實(shí)驗(yàn)操作的整個(gè)實(shí)驗(yàn)教學(xué)過(guò)程中都基本能獨(dú)立完成，掌握發(fā)育生物學(xué)的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)，并且能養(yǎng)成和增強(qiáng)學(xué)生良好的創(chuàng)新思維習(xí)慣，從而提高發(fā)現(xiàn)問(wèn)題、分析問(wèn)題和解決問(wèn)題的能力[6]。但是，至目前為止，由于受到專業(yè)領(lǐng)域和實(shí)驗(yàn)條件的限制，開(kāi)設(shè)發(fā)育生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程的高等院校還是比較少，難以實(shí)現(xiàn)和達(dá)到發(fā)育生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)和對(duì)理論課的輔助作用。廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院自2002年起對(duì)海洋生物學(xué)專業(yè)本科生開(kāi)設(shè)了發(fā)育生物學(xué)理論課及實(shí)驗(yàn)課，并且不斷改革進(jìn)行和完善發(fā)育生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)體系，于2009年開(kāi)設(shè)了以硬骨魚(yú)類（如金魚(yú)、胡子鯰）和兩棲類（如虎紋蛙等）為實(shí)驗(yàn)材料的適合于水產(chǎn)類的發(fā)育生物學(xué)綜合性實(shí)驗(yàn)，取得了較好的教學(xué)效果，但由于實(shí)驗(yàn)材料的可操控性不強(qiáng)，使得實(shí)驗(yàn)開(kāi)設(shè)的成功率和有效率降低[7]。

由于模式生物具有生理特征能夠代表生物界的某一大類群、容易獲得并易于在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)繁殖及容易進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操等優(yōu)點(diǎn)。為了不受限于實(shí)驗(yàn)材料，基于模式生物的《發(fā)育生物學(xué)》實(shí)踐教學(xué)改革勢(shì)在必行。至今廣泛使用的水產(chǎn)魚(yú)類模式主要有源自亞洲其他地區(qū)的斑馬魚(yú)、日本青鳉魚(yú)，北美洲的三棘刺魚(yú)等。以斑馬魚(yú)為例，該淡水魚(yú)類原分布于本魚(yú)分布于孟加拉，印度，巴基斯坦，緬甸，尼泊爾的溪流。上世紀(jì)50年代開(kāi)始被引進(jìn)美國(guó)、德國(guó)等實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行開(kāi)發(fā)應(yīng)用?，F(xiàn)已成為全世界廣泛接受的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?。綜合而言，一方面斑馬魚(yú)具有模式生物共有的特點(diǎn)： 1）作為觀賞魚(yú)類之一，容易獲得并易于在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)和繁殖；2）受精后3天即可發(fā)育出膜，7天開(kāi)口攝食，3個(gè)月既可完全成熟，世代短；3）3-5天可以產(chǎn)卵一次，每次可以產(chǎn)多達(dá)200顆成熟卵，因此子代多；4）其基因組已經(jīng)測(cè)定，且已經(jīng)建立許多純系，因而遺傳背景清楚；5）容易進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，特別是具有遺傳操作的手段和表型分析的方法。另一方面，斑馬魚(yú)具有自身獨(dú)有特色，有利于回答研究者關(guān)注的問(wèn)題：1）能夠很好代表生物界脊椎動(dòng)物最大的水生硬骨魚(yú)類中的淡水鯉科類群；2）不會(huì)像鼠類、靈長(zhǎng)類等導(dǎo)致人類的過(guò)敏等影響，對(duì)人體和環(huán)境無(wú)害；3）受精卵到出膜早期均透明，容易觀察和操作。

為了更好的與本土資源開(kāi)發(fā)和利用研究相結(jié)合，本文利用本地紅樹(shù)林海區(qū)的廣鹽性魚(yú)類湖棲鰭蝦虎魚(yú)作為潛在的模式生物開(kāi)發(fā)，輔助斑馬魚(yú)、青鳉為研究對(duì)象進(jìn)行發(fā)育生物學(xué)綜合性實(shí)驗(yàn)教學(xué)的改革探索。

湖棲鰭蝦虎魚(yú)（Gobiopterus lacustris）是本實(shí)驗(yàn)室對(duì)廣東省雷州半島主要紅樹(shù)林海區(qū)進(jìn)行魚(yú)類資源調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)的中國(guó)鰭蝦虎魚(yú)屬一新紀(jì)錄。于高橋鎮(zhèn)紅樹(shù)林保護(hù)區(qū)，東海島紅樹(shù)林海區(qū)，雷州市調(diào)風(fēng)鎮(zhèn)九龍山紅樹(shù)林國(guó)家濕地公園，附城鎮(zhèn)北家村，下六鎮(zhèn)紅蒔地村等附近的河流入?？诨驕\灘中均發(fā)現(xiàn)有湖棲鰭蝦虎魚(yú)的分布，并經(jīng)COI基因區(qū)段測(cè)序分析確認(rèn)[8]。成魚(yú)魚(yú)體半透明，無(wú)色或淡黃色，可以清晰地看見(jiàn)脊椎骨、肋骨、魚(yú)鰾、腸和性腺等腹部的器官。雌魚(yú)性腺中成熟的卵細(xì)胞清晰可見(jiàn)，也可看雄魚(yú)成熟性腺呈黃色。上、下頜圍有深色花斑，頭部分散著許多黑色花斑或斑點(diǎn)。背面上背鰭兩側(cè)各有一行斑點(diǎn)從頭部直通尾部。腹鰭、腹部和臀鰭兩側(cè)均有花斑。腹部向后，沿著髓棘和肋骨均分布有花斑。每一條鰭棘或鰭條上均分布有斑紋。可以通過(guò)生殖乳突、牙齒、性腺等形態(tài)學(xué)指標(biāo)區(qū)分雌雄成魚(yú)個(gè)體。

分布于雷州半島的湖棲鰭蝦虎魚(yú)數(shù)量多，且半島兩側(cè)均有分布，是這一地區(qū)的優(yōu)勢(shì)種[9]。由于湖棲鰭蝦虎魚(yú)生活在淡水與海水交匯的紅樹(shù)林海區(qū)，因此其適應(yīng)的鹽度較廣，其個(gè)體小易養(yǎng)殖，體色半透明，用肉眼或借助體式顯微鏡就能觀察到體內(nèi)變化情況，相比較于斑馬魚(yú)、青鳉等現(xiàn)有的模式生物，湖棲鰭蝦虎魚(yú)成體優(yōu)勢(shì)明顯，具有開(kāi)發(fā)為模式生物或環(huán)境指示物種的潛力。

湖棲鰭蝦虎魚(yú)易于人工養(yǎng)殖，已經(jīng)開(kāi)發(fā)完善了一套較為完備實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖規(guī)程。具體如下：養(yǎng)殖水體要經(jīng)尼龍、生物吸附劑、活性炭、生化過(guò)濾器及紫外殺菌系統(tǒng)處理， 溶解氧水平為4-8mg/L，水溫為26-30℃。養(yǎng)殖生長(zhǎng)期為0.2-0.5L/尾。在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)下成活率高，溫度鹽度耐受性廣。缺點(diǎn)在于截至目前，該魚(yú)尚無(wú)法完成實(shí)驗(yàn)室的全人工繁育過(guò)程，需要在野外采集成熟雌雄個(gè)體進(jìn)行自然產(chǎn)卵。將幾種模式魚(yú)類可以進(jìn)行優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行多角度分析。

與斑馬魚(yú)、青鳉魚(yú)相比，湖棲鰭蝦虎魚(yú)的優(yōu)勢(shì)在于從魚(yú)卵發(fā)育到成魚(yú)不用化學(xué)處理均呈現(xiàn)透明狀態(tài)，非常方便在體式鏡下觀察發(fā)育過(guò)程。湖棲鰭蝦虎魚(yú)作為實(shí)驗(yàn)材料的優(yōu)勢(shì)在于胚胎發(fā)育歷程遵循硬骨魚(yú)類發(fā)育的模式，經(jīng)歷受精激活期、胚盤(pán)期、囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期、器官形成期、出膜期這八個(gè)階段，各個(gè)時(shí)期都有明顯的特征，可以完整的跟蹤觀察胚胎到完全發(fā)育為仔魚(yú)的過(guò)程。尤其，基于湖棲鰭蝦虎魚(yú)的透明成體，可以方便我們進(jìn)行活體條件下成體性腺、肝臟等內(nèi)臟器官的形態(tài)追蹤觀察，對(duì)科研教學(xué)有很好的意義[9]。endprint

針對(duì)湖棲鰭蝦虎魚(yú)的這些特點(diǎn)，我們?cè)O(shè)計(jì)開(kāi)展發(fā)育生物學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)。首先，讓學(xué)生通過(guò)與斑馬魚(yú)沉性卵的比較，充分認(rèn)識(shí)湖棲鰭蝦虎魚(yú)的粘性卵特點(diǎn)，并思考和討論不同魚(yú)類受精卵的生態(tài)適應(yīng)和演化機(jī)制；其次，通過(guò)受精卵不同鹽度下的孵化速率和出膜率的比較，認(rèn)識(shí)廣鹽性魚(yú)類對(duì)于鹽度的適應(yīng)性發(fā)育能力；再次，比較不同模式魚(yú)類之間出膜時(shí)間周期，出膜后魚(yú)體的發(fā)育程度和仔魚(yú)的活動(dòng)能力；第四，充分利用湖棲鰭蝦虎魚(yú)成體透明的特點(diǎn)，觀察從仔稚魚(yú)到成體轉(zhuǎn)變過(guò)程中內(nèi)部器官的轉(zhuǎn)變過(guò)程，以及攝食等不同生活狀態(tài)下消化系統(tǒng)、血液循環(huán)系統(tǒng)的運(yùn)作；最后，觀察性成熟的雌雄個(gè)體性腺在不同發(fā)育分期下的形態(tài)轉(zhuǎn)變，為毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)打基礎(chǔ)。

我們還針對(duì)湖棲鰭蝦虎魚(yú)設(shè)計(jì)急性和慢性毒理實(shí)驗(yàn)。急性實(shí)驗(yàn)方面，使用較大濃度的壬基酚等典型的近岸常見(jiàn)污染物處理湖棲鰭蝦虎魚(yú)，然后觀察形態(tài)改變，行為異常并獲取半致死濃度等數(shù)據(jù)。慢性實(shí)驗(yàn)方面，使用較低的不同劑量濃度壬基酚等處理湖棲鰭蝦虎魚(yú)。考慮到慢性實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，我們需要設(shè)置多個(gè)觀測(cè)時(shí)間點(diǎn)，安排在課程的多個(gè)階段，分別開(kāi)展多方面的實(shí)驗(yàn)，具體包括：觀察記錄外部形態(tài)以及肝臟、性腺等內(nèi)臟狀態(tài)、測(cè)量相應(yīng)的長(zhǎng)度和重量；測(cè)定抗氧化氣化酶等常規(guī)酶變化；qPCR定量ChgL等基因的表達(dá)。通過(guò)急慢性的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)，是學(xué)生能夠全面認(rèn)識(shí)內(nèi)分泌干擾物的暴露對(duì)魚(yú)類個(gè)體發(fā)育不同階段的影響，從而充分認(rèn)識(shí)環(huán)境保護(hù)工作的重要性。

根據(jù)發(fā)育生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的教學(xué)要求，通過(guò)以實(shí)驗(yàn)室方便人工養(yǎng)殖和操控觀察的硬骨魚(yú)類湖棲鰭蝦虎魚(yú)為材料，從受精、正常胚胎發(fā)育過(guò)程（包括內(nèi)部和外部結(jié)構(gòu)）、環(huán)境因素對(duì)胚胎發(fā)育的影響、內(nèi)分泌干擾素濃度梯度對(duì)胚胎的影響以及檢測(cè)胚胎發(fā)育過(guò)程中相關(guān)基因的表達(dá)水平等，設(shè)計(jì)一系列連貫實(shí)驗(yàn)讓學(xué)生進(jìn)行操作，可為發(fā)育生物學(xué)的綜合性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及本科生開(kāi)放實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目提供參考。通過(guò)以上的實(shí)驗(yàn)，使得學(xué)生掌握一整套發(fā)育生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，增強(qiáng)學(xué)生的科研興趣，培養(yǎng)學(xué)生的科研素養(yǎng)，提高學(xué)生分析問(wèn)題和解決問(wèn)題的能力。

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[責(zé)任編輯：朱麗娜]endprint