馬麗華，鄧 榕，徐曉艷，楊宏靜，謝 鵬

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2017.09.005

抗博爾納病病毒磷蛋白單克隆抗體的制備及鑒定

馬麗華1,3，鄧 榕2，徐曉艷1,3，楊宏靜1，謝 鵬3

目的以重組的博爾納病病毒(BDV)磷蛋白(p24)為免疫原制備單克隆抗體，并鑒定其特異性。方法以純化后的重組BDVp24免疫小鼠，將骨髓瘤細(xì)胞與其脾細(xì)胞進(jìn)行融合，經(jīng)ELISA法篩選出分泌抗p24單抗的細(xì)胞株，并對(duì)其進(jìn)行克隆與亞克隆培養(yǎng)，將最終獲得的其中2株細(xì)胞株分別注入小鼠腹腔制備單抗，經(jīng)親和純化法純化后，采用ELISA法測(cè)定效價(jià)，利用蛋白免疫印跡和免疫熒光鑒定其特異性。結(jié)果建立了2株穩(wěn)定分泌抗p24單抗的雜交瘤細(xì)胞株，抗體亞類均為IgG1型。純化后的腹水抗p24單抗純度為98%和93%，ELISA 效價(jià)在1∶81 000以上,該抗體均能識(shí)別重組p24蛋白和BDV感染人類少突膠質(zhì)細(xì)胞(Oligodendroglia cell，OL細(xì)胞)所表達(dá)的p24蛋白。結(jié)論成功制備了靈敏性高、特異性好的抗BDVp24單抗，為博爾納病病毒診斷方法的研制及感染機(jī)理的研討提供依據(jù)。

博爾納病病毒;磷蛋白類;單克隆抗體

博爾納病病毒(Borna disease virus, BDV)是博爾納病毒科博爾納病毒屬的唯一成員，是一種人畜共患病病原體，易感染多數(shù)恒溫動(dòng)物，包括人類在內(nèi)[1]，其感染地域廣泛，在全世界均有報(bào)道[2]。BDV具有高度的嗜神經(jīng)性[3]，感染后主要表現(xiàn)為精神、行為異常，稱為Borna病。BDV最早于戰(zhàn)馬中引起致死性腦膜腦炎的暴發(fā)流行，而后在雙向情感障礙、強(qiáng)迫癥患者及精神分裂癥患者體內(nèi)成功分離出BDV[4-5]，許多實(shí)驗(yàn)也證明BDV 與人類神經(jīng)精神疾病密切相關(guān)[6-7]。Borna病病死率非常高[8]，目前，治療Borna病最有效的方法是對(duì)癥和支持治療。避免接觸病毒來(lái)源是預(yù)防Borna病唯一的方法，因此建立BDV的實(shí)驗(yàn)室檢查方法顯得尤為重要。

BDV基因組長(zhǎng)8 900 bp，其6 個(gè)開(kāi)放式讀碼框(Open reading frame，ORF)分別編碼核蛋白(N，p40)、磷蛋白(P，p24)、基質(zhì)蛋白(M，p16)、糖蛋白(G，p57)、L-聚合酶(L，P190)和非糖基化蛋白(X，p10)[9]。與其他很多RNA病毒不一樣，在不同感染區(qū)域、不同感染時(shí)間、不同宿主類別及不同病毒株，BDV的核酸序列均具有高度的保守性[10]，其中保守性最大的是ORFⅡ，它編碼的p24 蛋白抗原性極強(qiáng)，可能在BDV感染中起重要作用[11]，且p24 蛋白一直處于表達(dá)狀態(tài)[12]，因而，可成為檢測(cè)BDV的重要診斷指標(biāo)。單克隆抗體具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、且能大量制備等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于免疫組化、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和放射免疫分析等技術(shù)。本研究制備并純化了特異性抗BDVp24單抗，為博爾納病病毒診斷方法的研制及感染機(jī)理的研討提供依據(jù)。

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠，由重醫(yī)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心豢養(yǎng)。

1.2 病毒與細(xì)胞 OL細(xì)胞和BDV由德國(guó)HannsLudwig教授贈(zèng)予；小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0購(gòu)自南京金絲瑞公司;單皰病毒1型(HSV-1 )F株由重慶醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究中心保存。1.3 主要試劑 重組BDV p24蛋白和重組BDVp40蛋白由本課題組前期制備;弗氏佐劑和PEG4000、Trien-X100購(gòu)自Sigma ；DMEM培養(yǎng)液和PBS購(gòu)自HyClone；熒光標(biāo)記的羊抗鼠IgG、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG 、pNPP顯色液和TMB購(gòu)自上海生工;蛋白marker購(gòu)自Fermentas公司;聚偏二氟乙烯膜購(gòu)自Millipore公司;NaOH和4%多聚甲醛為國(guó)產(chǎn)分析純；HisTrapTM親和柱購(gòu)自GE公司。

2 方 法

2.1 動(dòng)物免疫 將重組BDV p24蛋白作為免疫原，選取5只SPF級(jí)6～8周齡的雌性BALB/c小鼠進(jìn)行免疫。初次免疫時(shí)，每只小鼠的免疫劑量是100 μg，p24蛋白與弗氏完全佐劑1∶1乳化均勻，注射入小鼠腹腔。2周后進(jìn)行第2次免疫，免疫劑量50 μg/只，使用弗氏不完全佐劑進(jìn)行乳化，腹腔注射。21 d后采用相同的方法進(jìn)行第3次免疫。7 d后取尾靜脈血用ELISA法測(cè)血清中抗體效價(jià)，選取效價(jià)水平達(dá)到要求的小鼠，2周后不加佐劑進(jìn)行最后一次加強(qiáng)免疫，3 d后取脾細(xì)胞。

2.2 雜交瘤細(xì)胞株的建立 將凍存的骨髓瘤細(xì)胞SP2/0復(fù)蘇后，培養(yǎng)于37 ℃含 5% CO2的培養(yǎng)箱中，選擇存活率高且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后期融合。融合前1 d取SPF級(jí)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)于96孔板中。融合當(dāng)天將骨髓瘤細(xì)胞SP2/0和加強(qiáng)免疫后取的小鼠脾細(xì)胞按1∶5的比例，在50%PEG4000的作用下進(jìn)行融合，用 HAT 培養(yǎng)液重懸加到預(yù)先準(zhǔn)備好的飼養(yǎng)細(xì)胞板中，于37 ℃ 5% CO2中培養(yǎng)。

觀察雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)情況，用ELISA法檢測(cè)其上清，篩選出分泌抗p24單抗的陽(yáng)性孔。用有限稀釋法對(duì)篩選得到的陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆，再用ELISA法對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)陽(yáng)性孔再進(jìn)行亞克隆，直至陽(yáng)性孔為 100%。

2.3 單克隆抗體亞類鑒定 使用SBA公司抗體亞類測(cè)定試劑對(duì)分泌的單克隆抗體進(jìn)行亞類的鑒別。

2.4 單克隆抗體的腹水制備與純化 將液體石蠟以0.5 mL/只注入經(jīng)產(chǎn)BALB/c小鼠腹腔，1周后再將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞按每只小鼠1×106個(gè)細(xì)胞的量注入小鼠腹腔。約 7～10 d后，小鼠的腹腔極度膨脹時(shí)采集腹水，進(jìn)行離心取上清，分裝后凍存。將制備的腹水單抗采取protein G親和純化法純化，經(jīng)SDS-PAGE和ELISA檢測(cè)后分裝于-20 ℃保存。

2.5 腹水型單克隆抗體純化后效價(jià)的測(cè)定 將重組BDV p24蛋白用PBS(pH7.4)包被緩沖液稀釋至10 μg/mL，酶標(biāo)板每孔加入 100 μL稀釋液，37 ℃孵育2 h。用300 μL洗滌液(含 0.9% NaCl，0.05% Tween-20，0.02% 疊氮化鈉)洗滌3次，每孔加300 μL封閉液于37 ℃孵育1 h。用300 μL洗滌液洗滌3次后，每孔加入100 μL從 1∶1 000起用PBS(pH7.4)按3倍梯度遞增稀釋的腹水抗體， 37 ℃孵育1 h。用300 μL洗滌液洗滌4次，每孔加入100 μL 1∶25 000稀釋的HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h。洗滌液洗滌4次，每孔加入pNPP顯色液100 μL，避光反應(yīng)約10 min。最后加入3 mol/L的NaOH 50 μL，測(cè)出A450值。

2.6 單克隆抗體特異性的鑒定

2.6.1 蛋白免疫印跡分析 將OL細(xì)胞培養(yǎng)于含5% CO237 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá) 90%時(shí)，按細(xì)胞數(shù)和病毒數(shù)1∶1接種BDV，換液傳代培養(yǎng)15 d。待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層時(shí)，洗滌3次后用含PMSF的裂解液裂解細(xì)胞30 min，于4 ℃，12 000 r/min離心5 min，分別收集感染BDV和正常OL細(xì)胞的蛋白。將收集到的蛋白與重組BDVp40蛋白和p24蛋白各取50 μg，煮沸5 min后，12 000 r/min離心1 min,分別取2μL上清，經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗抗p24單抗孵育2 h，洗滌3次，加入二抗HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG孵育2 h，洗滌3次，用ECL 發(fā)光試劑盒發(fā)光，凝膠成像照相。

2.6.2 免疫熒光分析 6孔板用4%多聚賴氨酸包被，培養(yǎng)正常OL細(xì)胞和感染BDV的OL細(xì)胞，每組3個(gè)孔，培養(yǎng)于含5% CO237 ℃的培養(yǎng)箱中。細(xì)胞鋪滿瓶底時(shí)，PBS洗滌5 min，重復(fù)3次，加入4%多聚甲醛，15 min后棄之，加入0.2%Trien-X100裂解細(xì)胞膜，室溫下孵育10min。洗滌3次，加入5%脫脂奶粉溶液，1 h后加入純化的抗p24單抗，4 ℃孵育過(guò)夜,37 ℃復(fù)溫40min。PBS洗滌3次，避光加入熒光標(biāo)記的羊抗鼠IgG，于37 ℃溫箱作用1 h。PBS洗滌3次，熒光顯微鏡下觀察。用HSV-1感染OL細(xì)胞，重復(fù)上述步驟。

3 結(jié) 果

3.1 免疫小鼠血清抗體效價(jià)的測(cè)定 第3次免疫后的第7 d用ELISA法測(cè)小鼠血清中抗體的效價(jià)，5只小鼠的血清抗體效價(jià)均在1∶27 000以上，滿足細(xì)胞融合要求。選擇健康狀況最好、效價(jià)較高的4號(hào)和6號(hào)小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫。

3.2 雜交瘤細(xì)胞株的篩選與克隆 細(xì)胞融合后，用ELISA篩選出OD值高且團(tuán)小的雜交瘤細(xì)胞株，采用有限稀釋法進(jìn)行克隆及3次亞克隆，獲得穩(wěn)定分泌抗BDVp24單抗的雜交瘤細(xì)胞株3株。以骨髓瘤細(xì)胞SP2/0上清為陰性對(duì)照，采用間接 ELISA 法檢測(cè)其培養(yǎng)上清單抗的效價(jià)為1∶2 430以上(表1)。選取3E9B2和3B10A4雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行凍存，復(fù)蘇后培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，傳20 代以上，都能穩(wěn)定分泌抗BDVp24單抗。

表1 細(xì)胞培養(yǎng)上清抗BDVp24單克隆抗體效價(jià)
Tab.1 Titer of BDV p24 monoclonal antibody in cell culture supernatant

Dilutedtimes1∶101∶301∶901∶2701∶8101∶2430NegativeTiter3E9B21.8831.8171.7121.5451.1931.0850.082>1∶24303B10A42.2091.4310.8520.8420.8260.5830.082>1∶24301A6G111.8011.7841.6111.3320.740.2580.082>1∶2430

3.3 單克隆抗體亞類的鑒定結(jié)果 通過(guò)單克隆抗體亞類鑒定分析得出IgG1的OD值均明顯高于其他亞類的OD值，所以本實(shí)驗(yàn)獲得的抗BDVp24單抗的抗體亞類均為IgG1，輕鏈為K。

3.4 腹水型單克隆抗體純化后SDS-PAGE結(jié)果 將雜交瘤細(xì)胞3E9B2和3B10A4分別注入小鼠腹腔產(chǎn)生的抗BDVp24單克隆抗體純化后SDS-PAGE結(jié)果如圖1所示，純化效果良好純度分別達(dá)到了 98%和93%。

3.5 腹水型單克隆抗體純化后效價(jià)測(cè)定結(jié)果 小鼠腹腔注射3E9B2和3B10A4雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗BDVp24單克隆抗體純化后，其效價(jià)經(jīng)ELISA法檢測(cè)均在8.1×104以上(表2)。

圖1 腹水單克隆抗體的SDS-PAGE圖Fig.1 SDS-PAGE of purified monoclonal antibodies from ascites

表2 腹水型單克隆抗體純化后ELISA結(jié)果
Tab.2 Titer of purified monoclonal antibody in ascites

3.6 腹水型單克隆抗體純化后特異性的鑒定

3.6.1 蛋白免疫印跡分析 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示，以純化抗p24單克隆抗體作為一抗，感染BDV的OL細(xì)胞和重組p24蛋白處有明顯特異的條帶，而正常OL細(xì)胞和重組p40蛋白處無(wú)條帶 (圖2)。表明制備的抗p24 單抗不僅可特異性結(jié)合BDV重組p24蛋白,且能特異性結(jié)合細(xì)胞所表達(dá)的p24 蛋白，特異性好。

1: recombinant p24; 2: OL cells infected with BDV; 3: normal OL cells; 4: recombinant p40圖2 抗BDVp24單抗的蛋白免疫印跡分析結(jié)果Fig.2 Western blot analysis of BDV p24 monoclonal antibody

3.6.2 免疫熒光分析 以純化后的抗p24單抗為一抗，熒光標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，熒光顯微鏡下，感染BDV的OL細(xì)胞發(fā)出明顯的綠色熒光，而感染HSV-1的OL細(xì)胞和正常的OL細(xì)胞無(wú)熒光信號(hào)。說(shuō)明抗p24單抗能特異地結(jié)合細(xì)胞所表達(dá)的p24蛋白，特異性好(圖3)。

4 討 論

BDV宿主種類多，感染地理分布廣，病死率高，為預(yù)防BDV可能引發(fā)的爆發(fā)流行，建立該病毒的實(shí)驗(yàn)室檢查方法顯得尤為必要[13]。另有研究者提出，雖然BDV有著廣泛的宿主，但馬、綿羊外的動(dòng)物感染后發(fā)病率較低，認(rèn)為臨床上易誤診及漏診[14]，因此需要建立高靈敏度和特異性的診斷方法。

A: OL cells infected withHSV-1; B: OL cells infected with BDV; 3: normal OL cells圖3 抗p24單抗的免疫熒光分析結(jié)果(SP染色，×200)Fig.3 Immunofluorescence analysis of monoclonal antibody (SP staining, ×200)

病毒檢測(cè)公認(rèn)的金指標(biāo)是病毒分離的，但病毒分離方法較復(fù)雜且敏感性較低，而B(niǎo)DV感染時(shí)病毒顆粒較少，且為非溶細(xì)胞性感染，不易分離[5]?？旖?、簡(jiǎn)單、特異和敏感是血清免疫學(xué)檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)，可作為診斷 BDV感染的一種重要方法。

在機(jī)體感染過(guò)程中p24蛋白持續(xù)表達(dá)，且抗原性較強(qiáng)[13]，所以，在本實(shí)驗(yàn)中我們以前期制備并純化的p24蛋白(純度>85%)為免疫原制備抗BDVp24單抗[15]。本研究選取雌性的6～8周齡Balb/c小鼠，經(jīng)3次免疫后小鼠血清抗體效價(jià)達(dá)萬(wàn)時(shí)，采用腹腔注射加強(qiáng)免疫后3 d取脾細(xì)胞與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合，通過(guò)間接ELISA法反復(fù)篩選，通過(guò)有限稀釋法克隆，最后獲得3株穩(wěn)定分泌抗BDVp24單抗的細(xì)胞株，且抗體亞類均為IgG1型。2株單抗3E9B2和3B10A4的小鼠腹水純化后 ELISA 效價(jià)在1∶81 000以上，靈敏度較高。免疫熒光與蛋白免疫印跡分析顯示，制備并純化的抗BDVp24單抗不但能與重組p24蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，而且能與BDV感染的OL細(xì)胞所表達(dá)的p24蛋白發(fā)生特異性結(jié)合。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)順利制備了靈敏度高、特異性好的抗BDVp24單抗，為博爾納病病毒診斷方法的研制及感染機(jī)理的研討提供依據(jù)。

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PreparationandidentificationofmonoclonalantibodyagainstphosphoproteinofBornadiseasevirus

MA Li-hua1, DENG Rong2, XU Xiao-yan1,3, YANG Hong-jing1, XIE Peng3

(1.DepartmentofBasicMedicine,ChongqingThreeGorgesMedicalCollege,Wanzhou404120,China;2.DepartmentofNeurology,ChongqingThreeGorgesCenterHospital,Wanzhou404120,China;3.InstituteofNeuroscience,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

In order to prepare the monoclonal antibodies (MAbs) by the recombinant phosphoprotein (p24) of Borne disease virus (BDV) as immunogen, the spleen cells of immunized balb/c mice with the recombinant BDV p24 were fused with the myeloma cells SP2/0. The hybridoma cell lines secreting MAbs against p24 were obtained after selected by indirect ELISA and subcloned for 3 times. The MAbs were prepared by intraperitoneal injection in mice, purified by affinity chromatography, identified by western blot and immunofluorescence assay (IFA) for specificity. The purified MAbs against BDV p24 from ascites belonged to IgG1 showed a purity of 98% and 93%, and a titer of 1∶81 000, and specific reaction with the BDV p24 restructured and expressed in Oligodendroglia cells (OL). The MAbs against BDV p24, with high specificity and sensitivity, were prepared successfully, which laid a basis for the study of diagnostic reagents and pathogenic mechanism of BDV.

Borna disease virus (BDV); phosphoproteins; monoclonal antibody

Xie Peng, Email: xiepeng58@21cn.com

謝鵬，Email：xiepeng58@21cn.com

1.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，萬(wàn)州 404120；

2.重慶三峽中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，萬(wàn)州 404120；

R392

：A

：1002-2694(2017)09-0779-05

2017-02-14編輯：劉岱偉

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973 計(jì)劃，No.2009CB918300)

3.重慶醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究中心，重慶 400016

Supported by the National Basic Research Program of China (973 Program, Grant No. 2009CB918300)