小麥中麥谷蛋白大聚體的提取優(yōu)化

張 濱，王金水，陳 迪，秦逸飛，劉效謙

(河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001)

小麥中麥谷蛋白大聚體的提取優(yōu)化

張 濱，王金水，陳 迪，秦逸飛，劉效謙

(河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001)

小麥的蛋白組成及結(jié)構(gòu)是影響小麥粉加工品質(zhì)的重要因素，其中面筋蛋白中麥谷蛋白大聚體(GMP)是對小麥粉品質(zhì)貢獻最大的組分，但因其組成和結(jié)構(gòu)復(fù)雜，對其分離和定量一直是難以徹底解決的問題。以市售小麥粉為原料，研究了利用凝膠色譜法(SE-HPLC)高效提取GMP的控制條件?？疾炝颂崛》绞?、液料比、SDS含量及DTT含量對SE-HPLC法提取GMP的影響，并且基于以上結(jié)果，選取液料比、SDS含量及DTT含量等三個因素做響應(yīng)面分析。響應(yīng)面分析結(jié)果表明，液料比、SDS含量及DTT含量的最佳條件分別為17.72∶1、1.59%、1.69%；且在此條件下，GMP的理論提取率為67.85%。在該優(yōu)化條件下，驗證試驗GMP的提取率為65.71%，是初始條件的2.84倍，實現(xiàn)了GMP的高效提取，探索出用于SE-HPLC分離麥谷蛋白大聚體提取和樣品制備的方法。

麥谷蛋白大聚體；小麥；提??；凝膠色譜法；響應(yīng)面分析

麥谷蛋白是小麥面筋的主要成分，以聚合體的形式存在，根據(jù)其在SDS緩沖液中的溶解度不同，可分為可溶性麥谷蛋白和不可溶性麥谷蛋白(即麥谷蛋白大聚體，GMP)[1]?？扇苄喳湽鹊鞍椎姆肿恿枯^小，主要影響面團的延伸性；麥谷蛋白大聚體的分子量較大，主要影響面團的彈性和強度[2-3]。目前，我國小麥的蛋白質(zhì)含量并不低, 而品質(zhì)較好的品種也多數(shù)具有優(yōu)質(zhì)亞基, 但實踐表明,具有優(yōu)質(zhì)亞基品種的面團特性和加工品質(zhì)并不一定優(yōu)良, 與國外優(yōu)質(zhì)小麥仍有較大差距, 主要表現(xiàn)為面筋強度較弱和延伸性較差, 難以滿足優(yōu)質(zhì)面包、饅頭和面條加工品質(zhì)的需求, 原因可能是貯藏蛋白組成較差。研究表明, 貯藏蛋白組分的絕對含量及比例是影響小麥加工品質(zhì)更直接的因素, 尤其是GMP含量。因此，深入研究影響小麥面筋質(zhì)量的主要因素, 在育種中采用更有效的評價預(yù)測方法, 對于進一步提高小麥品質(zhì)具有重要意義。

由于GMP組成復(fù)雜，不易將其與其他組分分離，因此，GMP的高效分離分析方法一直是國內(nèi)外研究的熱點[4]，對其分離和定量一直是難以徹底解決的問題。常用的GMP含量研究方法有4種:多層濃縮膠SDS-PAGE(MS-SDS-PAGE)方法,優(yōu)點是可以設(shè)計不同膠濃度梯度, 借助凝膠掃描系統(tǒng)比較不同濃度膠中谷蛋白聚合體的粒度分布；缺點是制膠耗時, 單個樣品費用較高。近年來，高效毛細管電泳(HPCE)技術(shù)已成功地用于小麥HMW-GS 的分離、表征與鑒定[5-6]，但由于缺乏合適的緩沖溶液系統(tǒng)，利用HPCE對LMW-GS進行有效分離鑒定尚處于嘗試階段[7]。目前，國內(nèi)多采用雙縮脲比色法, 該方法的優(yōu)點是操作簡單, 所需儀器設(shè)備簡單, 但準(zhǔn)確性較低[8]。凝膠色譜法(SE-HPLC)從分析速度、準(zhǔn)確性以及單個樣品費用等方面均優(yōu)于以上三種方法[9-10]。SE-HPLC對小麥麥谷蛋白的組分有著顯著的分離效果[11]。目前，運用SE-HPLC分析小麥儲藏蛋白在國內(nèi)外已經(jīng)日趨成熟，但用于分析GMP尚未見報道[12]。

在本研究中，利用單因素試驗，分析了提取方法、液料比、SDS含量以及DTT含量等對GMP提取的影響。同時，基于單因素試驗結(jié)果，建立GMP提取的三因素三水平響應(yīng)面試驗和響應(yīng)面分析，以期得到GMP提取的最佳工藝參數(shù)水平。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1主要試劑

小麥粉，市售；十二烷基硫酸鈉(SDS)、二硫蘇糖醇(DTT)、尿素、超純水。

1.1.2主要儀器

Pico 17/21微量離心機,ATY224電子分析天平,磁力攪拌水浴鍋,pH計,HPLC-1260高效液相系統(tǒng),低溫高速離心機。

1.2 試驗方法

1.2.1樣品提取液的制備

樣品提取液為質(zhì)量分數(shù)1.5%的SDS的磷酸緩沖液(pH6.9)，參考文獻[13-14]。

1.2.2樣品處理

稱取0.5 g小麥粉于50 ml離心管中，加入2.5 ml樣品提取液，30℃水浴1 h，13 000 r/min離心10 min后，棄去上清液。

超聲波提取法：取沉淀上層蛋白質(zhì)凝膠,放入另一個 10 ml離心管,加入2.5 ml樣品提取液混勻, 進行超聲波破碎處理。

DTT提取法：分別加入質(zhì)量分數(shù)1%DTT和8 mol/L尿素后，再次30℃水浴1 h，13 000 r/min離心10 min，上清液即為GMP，取上清液上樣[15]。

所得樣品上樣前均需80℃水浴2 min，并使用0.45 μm水系尼龍膜過濾，樣品常溫放置小于48 h[16]，不可反復(fù)凍融。用于考察各單因素對麥谷蛋白大聚體提取率的影響，得到提取麥谷蛋白大聚體的適宜工藝條件范圍。

1.2.3SE-HPLC色譜工作條件

色譜柱為TSK G3000PWXL；流動相為超純水；流速為0.4 ml/min；柱溫為20℃；進樣量為20 μl，在波長280 nm處檢測。

1.2.4單因素試驗設(shè)計

利用單因素試驗分別考察了提取方式、液料比、SDS含量、DTT含量對麥谷蛋白大聚體提取率的影響。以下各部分蛋白質(zhì)含量即其峰面積。

谷蛋白大聚體提取率=谷蛋白大聚體含量÷(谷蛋白大聚體含量+SDS可溶性谷蛋白含量)×100%。

(1)

1.2.5響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，確定Box-Behnken試驗設(shè)計的自變量，以麥谷蛋白大聚體的提取率為響應(yīng)值，通過響應(yīng)曲面分析，對麥谷蛋白大聚體的工藝條件進行了優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1提取方法對麥谷蛋白大聚體提取率的影響

LMW-GS與 HMW-GS相比，表面疏水性更高，因此，高分子量亞基的保留時間短即會先出峰[17]。在提取過程中，不同的提取方法會影響蛋白質(zhì)的溶解效果。

利用DTT、超聲波等兩種方法提取小麥粉中麥谷蛋白大聚體，提取率根據(jù)公式(1)計算得出，下同。結(jié)果如圖1所示。

(a)DTT提取方法

(b)超聲波提取方法

注：EPP為SDS可溶性麥谷蛋白；UPP為SDS不可溶性麥谷蛋白，即GMP，下同。

圖1不同提取方法對麥谷蛋白大聚體提取的影響

由圖1可知，提取方法會顯著影響麥谷蛋白大聚體的提取率。采用DTT提取麥谷蛋白大聚體的提取率為37.57%，采用超聲波提取時的麥谷蛋白大聚體提取率為23.12%，這表明化學(xué)提取方法優(yōu)于物理提取方法。因此，采用DTT提取方法。

2.1.2液料比對麥谷蛋白大聚體提取率的影響

在初始DTT質(zhì)量分數(shù)為1.0%、提取液SDS質(zhì)量分數(shù)為1.5%、30℃水浴提取1 h后，考察不同液料比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1)對麥谷蛋白大聚體提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，液料比對麥谷蛋白大聚體提取率有一定的影響。液料比從5∶1提高至20∶1，麥谷蛋白大聚體提取率不斷提高：而隨著液料比繼續(xù)增加，麥谷蛋白大聚體提取率則開始下降。因此，提取麥谷蛋白大聚體的最佳液料比為20∶1。

(a)液料比對麥谷蛋白大聚體提取率的分離圖譜

(b)不同液料比對麥谷蛋白大聚體提取率的影響

2.1.3SDS含量對麥谷蛋白大聚體提取率的影響

在初始DTT質(zhì)量分數(shù)為1.0%，液料比20∶1，30℃水浴提取1 h后，考察不同含量的SDS提取液(質(zhì)量分數(shù)1%、1.5%、2%)對麥谷蛋白大聚體提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。

(a)不同含量的SDS提取麥谷蛋白大聚體的分離圖譜

(b)不同含量的SDS對麥谷蛋白大聚體提取率的影響

由圖3可知，提取液SDS的含量對麥谷蛋白大聚體提取率有一定的影響。當(dāng)質(zhì)量分數(shù)從1%提高至1.5%，麥谷蛋白大聚體提取率不斷提高；而SDS質(zhì)量分數(shù)增加到2%時，麥谷蛋白大聚體提取率有所下降。因此，選取最優(yōu)提取液中SDS質(zhì)量分數(shù)為1.5%。

2.1.4DTT含量對麥谷蛋白大聚體提取率的影響

在液料比20∶1，提取液SDS質(zhì)量分數(shù)為1.5%，30℃水浴提取1 h后,考察提取液中不同含量的DTT提取液(質(zhì)量分數(shù)0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%)對麥谷蛋白大聚體提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，提取液DTT的含量對麥谷蛋白大聚體提取率有一定的影響。當(dāng)質(zhì)量分數(shù)從0.5%提高至1.5%，麥谷蛋白大聚體提取率不斷提高；而此后隨著DTT含量繼續(xù)增加，麥谷蛋白大聚體提取率逐漸下降。因此，選取提取液中DTT質(zhì)量分數(shù)為1.5%。

(a)不同含量的DTT提取麥谷蛋白大聚體分離圖譜

(b)不同含量的DTT對麥谷蛋白大聚體提取率的影響

2.2 響應(yīng)面試驗

以液料比、SDS含量、DTT含量為3個影響因素，以麥谷蛋白大聚體的提取率為評價指標(biāo)，采用軟件Design-Expert V8.0.6建立三因素三水平響應(yīng)面分析，見表1。

表1 響應(yīng)面法因素水平編碼表

Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果見表2，并對響應(yīng)面試驗結(jié)果進行方差分析,見表3。

對試驗結(jié)果進行多元回歸模擬，得到回歸方程，即麥谷蛋白大聚體提取率為：提取率=67.30+0.40A+1.15B+4.19C-0.36AB-0.41AC+0.46BC-0.47A2-3.10B2-11.04C2。

由表3可知，回歸方程中因變量和自變量之間的線性關(guān)系顯著(R2=0.993 9)，P=0.000 1<0.01，說明此方程極顯著，表明此模型可分析和預(yù)測麥谷蛋白大聚體提取工藝參數(shù)。模型中的B、C達到極顯著水平，由F值可知，影響麥谷蛋白大聚體提取率的主要因素從大到小依次為：DTT含量、SDS含量、液料比，即DTT含量對麥谷蛋白大聚體提取率的影響最大。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

表3 二次回歸模型方差分析

2.3 響應(yīng)面分析

液料比、SDS含量以及DTT含量對麥谷蛋白大聚體提取率影響的響應(yīng)面分析，如圖5所示。

(a)液料比和SDS含量對提取率的響應(yīng)面圖

(b)液料比和DTT含量對提取率的響應(yīng)面圖

(c)SDS含量和DTT含量對提取率的響應(yīng)面圖

圖5反映了液料比、SDS含量以及DTT含量這三個因素對麥谷蛋白大聚體提取率的影響。通過比較可知，DTT含量對麥谷蛋白大聚體提取率的影響較大，曲線變化較陡；SDS含量次之；液料比對麥谷蛋白大聚體提取率的影響最小，曲面變化比較平緩。

2.4 最佳提取條件確定及驗證

由Design-Expert V8.0.6分析軟件得到的最佳浸提條件為液料比17.72∶1、SDS質(zhì)量分數(shù)1.59%、DTT質(zhì)量分數(shù)1.69%，理論上蛋白質(zhì)提取率為67.852%。為了檢驗響應(yīng)曲面法模型的可靠性，采用上述優(yōu)化條件進行驗證試驗，通過3次平行試驗，測得蛋白質(zhì)提取率為65.71%，相對誤差為2.142%，沒有顯著性差異。驗證試驗結(jié)果接近Design-Expert軟件預(yù)測的結(jié)果。

3 結(jié)論

通過單因素試驗發(fā)現(xiàn)，化學(xué)提取法提取小麥中的GMP的提取率遠高于物理提取法，并通過響應(yīng)面試驗，進一步對化學(xué)提取法做了優(yōu)化，結(jié)果顯示：在提取時間為60 min，利用DTT法提取小麥粉中麥谷蛋白大聚體優(yōu)化工藝條件為液料比17∶1、SDS質(zhì)量分數(shù)1.5%,DTT質(zhì)量分數(shù)1.6%，在此工藝條件下麥谷蛋白大聚體提取率為65.71%，為利用超聲波提取的2.84倍。經(jīng)驗證，試驗結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相近。其中提取液DTT含量對麥谷蛋白大聚體的提取率有較顯著的影響，提取液SDS含量和液料比則對麥谷蛋白大聚體的提取率有顯著影響。

[1] 何中虎,林作楫,王龍俊,等.中國小麥品質(zhì)區(qū)劃的研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2002 , 35(4):359-364.

[2] GUPTA R B, KHAN K, MACRITCHIE F. Biochemical basis of flour properties in bread wheats: I. Effects of variation in the quantity and size distribution of polymeric protein[J]. Journal of Cereal Science,1993,18: 23-41.

[3] 郭瑞林, 關(guān) 立, 秦廣慶. 蛋白質(zhì)凝膠電泳技術(shù)與小麥親本分類[J].小麥研究, 2004, 25(3):8-10.

[4] 汪家政, 范 明. 蛋白質(zhì)技術(shù)手冊[M]. 北京:科學(xué)出版社, 2000.

[5] 于雁靈, 樊惠芝, 張國安, 等. 蛋白質(zhì)組學(xué)定量的技術(shù)與方法研究進展[J]. 化學(xué)研究與應(yīng)用, 2003, 15(3):287-292.

[6] LIU L, HE Z H, YAN J,et al. Allelic variation at theGlu-1 andGlu-3 loci, presence of the 1B·1R translocation, and their effects on mixographic properties in Chinese bread wheats[J]. Euphytica, 2005, 142:197-204.

[7] 夏其昌, 曾 嶸. 蛋白質(zhì)化學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)[M]. 北京:科學(xué)出版社, 2004:272-274.

[8] 張平平, 肖永貴.劉建軍，等.SDS不溶性谷蛋白大聚體含量與和面儀參數(shù)的關(guān)系[J]. 作物學(xué)報, 2008, 34(6):1 074-1 079.

[9] ZHANG P P, HE Z H, CHEN D S,et al. Contribution of common wheat protein fractions to dough properties and quality of northern-style Chinese steamed bread[J]. Journal of Cereal Science, 2007, 46:1-10.

[10] ZHANG P P, HE Z H, ZHANG Y,et al. Pan bread and Chinese white salted noodle qualities of Chinese winter wheat cultivars and their relationship with gluten protein fractions[J]. Cereal Chemistry, 2007, 84: 370-378.

[11] ZHANG L P, HE Z H, LU M Q,et al. Identification of 1BL/1RS translocation via multiplex PCR markers ofGlu-B3,Gli-B1 andSEC-1bin common wheat[J]. Scientia Agricultura Sinica,2003, 36(12):1 566-1 570.

[12] CIAFFI M, TOZZI L, LAFIANDRA D. Relationship between flour composition determined by size-exclusion high-performance liquid chromatography and dough rheological parameters[J]. Cereal Chemistry,1996, 73:346-351.

[13] SAPIRSTEIN H D, FU B X. Intercultivar variation in the quantity of monomeric proteins, soluble and insoluble glutenin, and residue protein in wheat flour and relationships to breadmaking quality[J]. Cereal Chemistry, 1998, 74:500-507.

[14] TURTO J, GUTKOWSKA B, MALINOWSKA E. Relationship between the selenium, selenomethionine, and selenocysteine content of submerged cultivated mycelium of Lentinula edodes[J]. Acta Chromatographica, 2007, 18: 36-48.

[15] LINDSAY M P, SKERRITT J H. The glutenin macropolymer of wheat flour doughs: structure function perspectives[J].Trends in Food Science &Technology, 1999, 10(8):247-253.

[16] VASIL I K, ANDERSON O D. Genetic engineering of wheat gluten[J]. Trends in Plant Science, 1997, 2(8):292-297.

[17] 鐵 梅，李寶瑞,邢志強，等. 富硒大豆中蛋白質(zhì)的提取工藝優(yōu)化及HPLC-MS聯(lián)用測定硒代蛋氨酸[J]. 食品科學(xué), 2015, 36(8):6-11.

(責(zé)任編輯：趙琳琳)

HigheffectiveextractionofgluteninmacropolymerinwheatflourbySE-HPLC

ZHANG Bin, WANG Jin-shui, CHEN Di, QIN Yi-fei,LIU Xiao-qian

(College of Biotechnology, Henan Universities of Technology, Zhengzhou 450001,China)

The composition and structure of the wheat protein is the important factors influencing the wheat flour processing quality. Glutenin macropolymer (GMP) in gluten is the largest component of wheat flour. Because of its complex composition and structure, its separation and quantitative analysis are difficult to be completely solved. The high effective extraction conditions of GMP by using SE-HPLC were studied. The effect of extraction methods, liquid to materials ratio, and the concentrations of SDS and DTT on the extraction of GMP by SE-HPLC were investigated; and based on the above results, the three factors (liquid to materials ratio, the concentrations of SDS and DTT) were selected for response surface analysis. The results of response surface analysis indicated that the optimized level of liquid to materials ratio and the concentrations of SDS and DTT were 17.72∶1, 1.59% and 1.69%, respectively,and the theoretical extraction rate of GMP was 67.85%. In the verification test, the extraction rate of GMP with the optimization conditions was 65.71%, that was 2.84 times higher than the extraction rate with the original conditions, and the high effective extraction of GMP by SE-HPLC was achieved,indicating the methods of extracting and preparing samples for the separation of wheat gluten by SE-HPLC was feasible.

glutenin macropolymer; wheat; extraction; SE-HPLC; response surface analysis

S521.1；TS201.2+1

：A

：1003-6202(2017)09-0024-06

2017-07-10；

2017-08-30

國家自然科學(xué)基金面上項目(31571780)。

張 濱(1993-)，女，碩士研究生，研究方向為微生物學(xué)。

王金水(1964-)，男，博士，教授，研究方向為食品生物技術(shù)。

10.7633/j.issn.1003-6202.2017.09.008