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      福建黃兔INHBA基因5’端cDNA克隆及序列分析

      2017-10-11 07:32:38桑雷孫世坤陳冬金陳巖峰謝喜平福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所350013
      中國畜禽種業(yè) 2017年1期
      關(guān)鍵詞:福建克隆位點

      桑雷 孫世坤 陳冬金 陳巖峰 謝喜平 (福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所 350013)

      福建黃兔INHBA基因5’端cDNA克隆及序列分析

      桑雷 孫世坤 陳冬金 陳巖峰 謝喜平 (福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所 350013)

      為擴增福建黃兔INHBA基因5'端,根據(jù)GenBank上已公布的家兔序列KC831577,設(shè)計了2條巢式引物,利用5'RACE技術(shù)克隆福建黃兔INHBA基因5'端序列,獲得1個682bp片段,對該片段克隆測序,獲得包括5'UTR、第1外顯子及部分第1內(nèi)含子的片段。利用在線軟件預(yù)測在-229~-180bp處存在可能的啟動子,同時還發(fā)現(xiàn)9個潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點,其中包含對轉(zhuǎn)錄有重要調(diào)控作用的TATA-box位點。

      福建黃兔;片段;克隆;INHBA;5'RACE;啟動子;序列分析

      抑制素屬于TGF-β (transforming growth factor-bata,轉(zhuǎn)化生長因子-β)超家族成員之一,由α、β兩個亞基組成的二聚體糖蛋白激素,此類激素通過負反饋調(diào)節(jié)FSH(follicle stimulating hormone,卵泡雌激素)合成與分泌,從而影響卵泡發(fā)育和精子發(fā)生[1,2]。抑制素β亞基有βA和βB兩種形式,其中α亞基和βA組成抑制素A,此外βA與自身通過二硫鍵連接組成活化素A(Activin A,ACTA)以及與βB亞基組成活化素B(Activin B,ACTB)[3]。在母畜中,抑制素βA是影響山羊、綿羊產(chǎn)羔數(shù)的重要基因[4,5]。在公畜中,抑制素βA是影響荷斯坦公牛射精量及精子密度的重要因素[6]。目前對福建黃兔INHBA基因研究甚少,尤其cDNA 5’UTR(untranslated region,非翻譯區(qū))序列未見有報導(dǎo),本研究目的是解析福建黃兔INHBA基因啟動子序列及結(jié)構(gòu)特征,為進一步研究福建黃兔INHBA基因調(diào)控與繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析提供依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 動物及組織

      性成熟的福建黃兔母兔由福建連江玉華山生態(tài)試驗場購買。黃兔母兔屠宰后立刻取卵巢組織,放入液氮罐中,備用。

      1.2 總RNA提取

      使用RNAiso Plus(Takara)提取黃兔卵巢組織中的總RNA,然后用不含RNA酶的Recombiant DNase I(Taraka)去除基因組DNA,隨后溶于DEPC水,中保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

      1.3 引物設(shè)計及合成

      本試驗以已獲得的INHBA cDNA部分序列 (KC831577)設(shè)計引物擴增5’端序列[7],由上海生工合成,引物的部分序列見表1。

      1.4 5'RACE前處理及反轉(zhuǎn)錄

      使用Takara 5’Full RACE Kit with TAP對5μg的總DNA進行CIAP、TAP處理,并與5’RACE Adaptor連接后,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。cDNA反轉(zhuǎn)錄體系:連接好的RNA 6μl,隨機 引 物( 50μM) 0.5μl, dNTPs Mixture(各 10mM)1μl,RNase Inhibitor (40U/μl) 0.25μl, 5×M-MLV buffer 2μl, Reverse Transcriptase M-MLV (200U/μl) 0.25μl。 RT 反應(yīng)條件為:30℃下10min,42℃下60min,70℃下15min,反應(yīng)結(jié)束后將cDNA產(chǎn)物保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

      1.5 PCR擴增

      取上述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液稀釋5倍取2μl,10μM上、下游引物 (INHBA 1, Outer primer) 各 2μl, 2×GC buffer 25μl, 5U/μl LA Taq?(Takara) 0.5μl, 用水補足至 50μl體系。 反應(yīng)條件為: 94℃下 3min; 94℃下 30s, 60℃下 30s, 72℃下 2min,30個循環(huán);72℃下10min。取上述PCR產(chǎn)物1μl作為模板,上、 下游引物 (INHNA 2, Inner primer) 各取 2μl, dNTP(各 2.5mM) 8μl, 2×GC buffer25μl, 5U/μl LA Taq?(Takara)0.5μl,用水補足至50μl體系。反應(yīng)條件為:94℃下3min;94℃下 30s, 60℃下 30s, 72℃下 2min, 30個循環(huán); 72℃下10min。取5μl進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

      1.6 克隆測序

      將膠回收試劑盒切膠回收的PCR產(chǎn)物 (約700bp)與pMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)染至DH5α細胞中,涂平板37℃培養(yǎng)12h,挑選陽性克隆用PCR法鑒定重組質(zhì)粒。隨后將鑒定過質(zhì)粒送至寶生物工程 (大連)有限公司進行測序。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 兔INHBA基因5'UTR區(qū)擴增

      經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果顯示,3’RACE產(chǎn)物為大約700bp的條帶 (圖1),與預(yù)期的產(chǎn)物大小一致。將擴增產(chǎn)物送至寶生物工程 (大連)有限公司進行測序,最后得到1個682bp片段。從獲得序列分析結(jié)果來看,所獲得序列包含1個5’UTR(280bp),第1外顯子 (288bp)以及部分第1內(nèi)含子 (14bp)(見圖2)。

      圖1 黃兔INHBA 5’端擴增產(chǎn)物瓊脂糖電泳

      圖2 福建黃兔INHBA基因5’UTR區(qū)序列分析

      2.2 兔INHBA基因的生物信息學分析

      將測序得到的兔INHBA基因5’UTR區(qū)序列用BDGP∶NeuralNetwork PromoterPrediction ( http∶//www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)進行啟動子位點預(yù)測,發(fā)現(xiàn)在-229~-180bp處存在可能的啟動子位點,得分為0.92,具體位置見圖2。

      將測序得到的兔INHBA基因5’UTR序列用BIMAS網(wǎng)站的 Promoter Scan (https∶//www-bimas.cit.nih.gov/molbio/) 預(yù)測轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點,發(fā)現(xiàn)9個潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點 (表2),其中-273bp處存在 3種TFFIID結(jié)合位點,分別為TATA-box.2、 Ad2MLP US.5、 TATA-box-CS, 其中 TATA-box.2為真核生物共有的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點,Ad2MLP US.5、TATA-box-CS為哺乳動物特有的TFIID結(jié)合位點,-208bp、-206bp存在激活蛋白AP-2(activator protein-2)結(jié)合位點,此外還存在 glucagon-G3A (-230bp)、 UCE.2 (-227bp)、JCV_repeated_sequence(-58bp)轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點。

      表1 PCR引物擴增序列

      表2 轉(zhuǎn)錄結(jié)合因子

      3 討論

      TFIID(Transcription factor IID,轉(zhuǎn)錄因子IID)由TBP(TATA-box binding protein,TATA結(jié)合蛋白)和多種TBP協(xié)同因子 (TBP-associated factors,TAFs)組成,是真核生物中唯一具有位點特異的DNA結(jié)合能力的因子。TFIID能識別TATA位點并與之結(jié)合,形成TFIID-啟動子復(fù)合物,指導(dǎo)其他轉(zhuǎn)錄因子與RNA聚合酶II形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物 (transcriptional preinitiation complex),引發(fā)RNA的合成過程[8]。UCE(upstream control element,上游控制元件),與核心啟動子(core promoter) 一起被 UBF (upstream binding factor, 上游結(jié)合因子)結(jié)合,再與SL1(selectivity factor 1,選擇性因子1)一起促進轉(zhuǎn)錄[9]。GCF(GC binding factor,GC結(jié)合因子)是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子,通過與上游啟動子中富含GC序列的區(qū)域特異結(jié)合,進而抑制基因的轉(zhuǎn)錄[10]。AP-2(activator protein-2,激活蛋白-2)是一種DNA結(jié)合蛋白,參與調(diào)控多種基因轉(zhuǎn)錄及細胞增殖、分化、凋亡[11]。Csh1、PRP-I及PAG1等基因上游有AP-2結(jié)合位點,相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)Csh1、PRP-I及PAG1與胎盤子葉和胚胎發(fā)育相關(guān),敲除小鼠胚胎細胞AP-2基因會導(dǎo)致合體滋養(yǎng)層細胞喪失增殖能力[12,13]。研究發(fā)現(xiàn)人滋養(yǎng)層細胞的hCG、hCSH1和hGRH等基因上游區(qū)域存在AP-2結(jié)合位點,這些基因的特異表達受AP-2家族的調(diào)控[14,15]。INHBA基因上GCF和AP-2位點是否與表達調(diào)控相關(guān),有待進一步的驗證。

      4 小結(jié)

      本研究利用5’RACE技術(shù)獲得INHBA基因5’端1個682bp片段,通過克隆測序獲得了其5’UTR序列。通過在線分析軟件預(yù)測福建黃兔INHBA基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位置及啟動子序列,為進一步研究福建黃兔INHBA在生殖軸中的表達機制奠定了理論基礎(chǔ)。

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      項目資金:福建省公益類研究院所專項 “閩西南黑兔FABP4基因的克隆、多態(tài)性及與生長、肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析”(2015R1023-13);福建省農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新團隊PI項目 “家兔優(yōu)良品種資源創(chuàng)新育種研究”(2016PI-11);福建農(nóng)業(yè)科學院杰出青年人才基金 “閩西南黑兔FABP4基因的克隆、多態(tài)性及與生長、肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析”(2014JQ-1)。

      桑雷 (1981-),男,漢族,博士,助理研究員,從事草食動物遺傳育種與繁殖工作。

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