龍杰 張偉 覃杰 （新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第二師畜牧獸醫(yī)工作站 841000）

單核細(xì)胞增生性李斯特菌分離鑒定

龍杰 張偉 覃杰 （新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第二師畜牧獸醫(yī)工作站 841000）

按照國家標(biāo)準(zhǔn)檢測了4類肉制品中的361份樣品。應(yīng)用PCR方法檢測了單增李斯特菌溶血素hly基因。分析單核細(xì)胞增生性李斯特菌在即食食品中污染情況。共檢出20株單增李斯特菌，檢出率為5.54% （20/361），主要污染來源是調(diào)理肉制品，污染率高達(dá)16.88% （13/77）。陽性菌株中含有溶血素基因的菌株有18株，占90%。表明被檢測地區(qū)肉類食品中，致病性單增李斯特菌污染率較高。

肉制品；檢測；食品安全；單核細(xì)胞；李斯特菌；人獸共患??；食源性

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

采集自新疆兵團(tuán)各師、團(tuán)的4類肉類制品361份樣品，詳見表1。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基，BHI培養(yǎng)基，普通營養(yǎng)瓊脂，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌增菌肉湯LB1、LB2購自北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司，李斯特菌顯色培養(yǎng)基購自鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司。2xTaq PCR Master Mix、ddH2O、DNA Marker DL2000購自天跟生化科技 （北京）有限公司；引物由生工生物工程 （上海）股份有限公司合成，其他試劑均為分析純。

1.1.3 儀器

VITEK-2 compact全自動細(xì)菌生化鑒定儀 （法國梅里埃），精密恒溫培養(yǎng)箱，PCR儀和凝膠成像分析儀 （BIO.RAD）。

1.2 方法

1.2.1 分離鑒定

按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.30-2010單核細(xì)胞增生性李斯特菌的檢測方法，生化鑒定通過VITEK-2 compact用GP卡鑒定。

1.2.2 PCR鑒定分析

分離純化病原菌堿裂解法提取細(xì)菌基因組，參考細(xì)菌16s RNA通 用 引 物 27f：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492r：TACGGYTACCTTGTTACGACTT擴(kuò)增片段，擴(kuò)增體系：10xBuffer 2.5ul，dNTP （ 2.5mmol/L）2ul，27f（ 10umol/L）1ul， 1492r （10umol/L） 1ul， 模板 DNA1ul， Taq 酶 0.3ul， 加水補(bǔ)足 25ul； 反應(yīng)程序： 94℃4min； 94℃30s， 56℃45s， 72℃1.5min，30個循環(huán)；72℃延伸7min。擴(kuò)增產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠在1xTBE電泳液中電泳30min，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)中記錄結(jié)果。條帶明亮清晰的樣，PCR產(chǎn)物送上海生工測序。所得序列結(jié)果提交GenBank，BLAST對序列進(jìn)行同源性比對鑒定。

1.2.3 溶血素因子分析

分別將分離株接種到綿羊鮮血瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)48h，在平板上觀察溶血情況，必要時用接種環(huán)，移去菌落，觀察菌落底部的溶血情況。

參考單增李斯特菌的第一毒力島上的編碼溶血素因子hly基因，合成一對特異性引物hly-f：ACGCAGTAAATACATTAGTG， hly-r： AATAAACTTGACGGCCATAC， 擴(kuò)增體系： 10xBuffer 2.5ul， dNTP （2.5mmol/L） 2ul， 10umol/L 上下游引物各1ul，模板DNA1ul，Taq酶0.3ul，加水補(bǔ)足25ul；反應(yīng)程序： 94℃4min； 94℃30s， 56℃30s， 72℃1min， 30個循環(huán)；72℃延伸7min。擴(kuò)增產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠在1xTBE電泳液中電泳30min，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)中記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

361份樣品中檢出20株單增李斯特菌，檢出率5.54%。主要在調(diào)理肉中污染最高，達(dá)到16.88%，其次是冷凍魚糜制品5.00%，熟肉制品1.61%，冷凍肉糜制品1.25% （附表）。

通過16s rRNA的PCR擴(kuò)增，測序比對，單增李斯特菌的16s rRNA序列與NCBI提交的單核細(xì)胞增生性李斯特菌序列同源性達(dá)99%，但也與有些無害李氏桿菌等同源性達(dá)99%。

20株單增李斯特菌中有18株hly基因檢測陽性且在綿羊鮮血平板上顯示溶血現(xiàn)象；1株hly基因檢測陰性且在綿羊鮮血平板上未見溶血現(xiàn)象；1株從冷凍掛漿魚糜制品中分離到的在綿羊鮮血平板上未見溶血現(xiàn)象，但PCR檢測hly基因?yàn)殛栃浴?/p>

3 討論

本文結(jié)果顯示新疆地區(qū)部分肉類制品中單增李斯特菌的檢出率為5.54%。尤其是調(diào)理肉中污染率達(dá)16.88%。國外研究易被單增李斯特菌污染的食品主要為乳制品 （奶酪、巴氏消毒奶、冰激淋）、肉制品 （雞肉、火腿等）、海產(chǎn)品及蔬菜沙拉等。國內(nèi)相關(guān)報(bào)道中吉林省以熟肉制品 （17.0%）、涼拌菜 （9.1%）檢出率較高，揚(yáng)州報(bào)道以熟肉制品及涼拌菜等即食食品 （9.62%）的檢出率較高。河北省報(bào)道以涼拌菜及沙拉、生食水產(chǎn)品中單增李斯特菌的檢出率較高，分別為2.62%、2.51%，而熟肉制品檢出率則略低 （1.53%）。而本文以調(diào)理肉檢出率最高，達(dá)16.88%，其次是冷凍魚糜制品5.00%，熟肉制品1.61%，冷凍肉糜制品1.25%。可以看出，單增李斯特菌其檢出率在不同地方及不同食品中均存在較大差異，因此，各個地方因針對肉制品加強(qiáng)衛(wèi)生安全管理。

16S rRNA序列分析是細(xì)菌系統(tǒng)分類研究中最常用的工具之一，其結(jié)構(gòu)和功能高度保守。一般認(rèn)為，16S rRNA序列同源性小于97%，可以認(rèn)為屬于不同種，同源性小于93～95%，可認(rèn)為屬于不同的屬。16S rRNA基因高度保守，但其保守性是相對的，在保守區(qū)之間存在9或l0個變異區(qū)，保守區(qū)和可變區(qū)互相交錯排列，不同細(xì)菌都有不同程度的差異，可設(shè)計(jì)不同引物對所有細(xì)菌或特定細(xì)菌進(jìn)行PCR檢測。但本文通過16s rRNA序列鑒定單增李斯特菌容與無害李氏等易混淆，鑒定必須結(jié)合生化鑒定或者擴(kuò)增單增李斯特菌特異性片段輔助鑒定。

李斯特菌溶血素O李斯特菌溶血素O（Listeriolysion O，LLO）由hly基因編碼，分子質(zhì)量為60ku，是一種孔形成毒素，通過溶解細(xì)胞吞噬體膜而使LM逃離吞噬體，促進(jìn)菌體進(jìn)入胞液，是細(xì)菌得以在胞液內(nèi)增殖的先決條件，是LM的主要致病因子。它的缺失將會導(dǎo)致細(xì)菌毒力的全部喪失，其溶細(xì)胞性可被巰基激活而被膽固醇和氧化劑所抑制。不產(chǎn)生LLO的LM突變株雖可在非吞噬細(xì)胞的胞液中生存一段時間，但卻不能繁殖，且因無法逃逸吞噬體而不能對其他細(xì)胞感染。除此之外，LLO還參與同LM致病性有關(guān)的其他反應(yīng)，研究顯示，LM感染鼠脾臟和骨髓的樹突狀細(xì)胞，可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；不產(chǎn)生LLO的LM突變體不能誘導(dǎo)。本文分離到20株單增李斯特菌，90% （18/20）的菌株含有hly基因，并且表現(xiàn)出溶血現(xiàn)象，說明大多菌株具有較高致病性。其中一株含hly基因但與溶血表型不一致，hly基因未顯示其溶血功能表型，具體原因需進(jìn)一步分析。

附表 肉類制品中單增李斯特菌檢出情況