群體飼養(yǎng)對(duì)比格犬血液學(xué)及生化指標(biāo)的影響

宋 征，李 華，阮 斌，汪溪潔，趙 琪，常 艷

(國(guó)家上海新藥安全評(píng)價(jià)研究中心/上海益諾思生物技術(shù)有限公司，上海 201203)

群體飼養(yǎng)對(duì)比格犬血液學(xué)及生化指標(biāo)的影響

宋 征，李 華，阮 斌，汪溪潔，趙 琪，常 艷*

(國(guó)家上海新藥安全評(píng)價(jià)研究中心/上海益諾思生物技術(shù)有限公司，上海 201203)

為了研究群體飼養(yǎng)及單籠飼養(yǎng)對(duì)于比格犬血液學(xué)和血清生化指標(biāo)的影響，并提供GLP條件下新藥臨床前安全性評(píng)價(jià)中動(dòng)物飼養(yǎng)方式的科學(xué)性依據(jù)，采用20只比格犬，分為2組，交叉進(jìn)行為期2周的群體飼養(yǎng)和單籠飼養(yǎng)，每周采集血液進(jìn)行血液學(xué)和血清生化指標(biāo)的檢測(cè)。結(jié)果顯示，群養(yǎng)與單籠飼養(yǎng)相比，對(duì)比格犬的血液學(xué)及血清生化指標(biāo)無不良影響。在新藥臨床前安全性評(píng)價(jià)中可以針對(duì)動(dòng)物的不同毒性反應(yīng)的程度，遵照獸醫(yī)的意見采用不同的飼養(yǎng)方式，以最大程度保證動(dòng)物福利。

比格犬；群體飼養(yǎng)；良好實(shí)驗(yàn)室規(guī)范；血液學(xué)；血清生化

新藥申報(bào)時(shí)，要求臨床前安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)在良好實(shí)驗(yàn)室規(guī)范(good laboratory practice，GLP)條件下進(jìn)行，GLP中對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇及飼養(yǎng)均有非常嚴(yán)格的要求。國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的相關(guān)指導(dǎo)原則中對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的要求為：對(duì)受試物的代謝與人體相近；對(duì)受試物敏感；已有大量歷史對(duì)照數(shù)據(jù)，來源、品系及遺傳背景清楚[1]。通常，推薦嚙齒類動(dòng)物首選大鼠和非嚙齒類動(dòng)物首選比格犬。因此比格犬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在臨床前安全性評(píng)價(jià)中有著非常廣泛的應(yīng)用。

在GLP建立及早期發(fā)展的過程中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在試驗(yàn)期間往往采用單籠飼養(yǎng)。隨著動(dòng)物福利的發(fā)展，群體飼養(yǎng)(群養(yǎng))成為了現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行業(yè)中環(huán)境豐富程序的重要組成部分之一。歐盟和美國(guó)均以法規(guī)的形式提出了對(duì)于群居動(dòng)物需要群體飼養(yǎng)的要求[2-4]。目前，國(guó)內(nèi)共有60家機(jī)構(gòu)已通過了國(guó)際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物評(píng)估和認(rèn)可委員會(huì)(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care，AAALAC)的動(dòng)物福利認(rèn)可，在AAALAC推薦的動(dòng)物福利參考書《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理和使用指南》第8版中明確說明群體飼養(yǎng)對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利的重要性，并強(qiáng)制要求對(duì)群居動(dòng)物進(jìn)行群體飼養(yǎng)[5]。因此，本試驗(yàn)通過檢測(cè)比格犬群養(yǎng)及單籠飼養(yǎng)前后動(dòng)物血液學(xué)及生化指標(biāo)的變化，評(píng)價(jià)群養(yǎng)對(duì)于動(dòng)物臨床病理檢查結(jié)果的影響，為GLP條件下比格犬群體飼養(yǎng)方式的運(yùn)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本試驗(yàn)共使用20只健康比格犬，其中雌性14只，雄性6只。動(dòng)物分別購自2個(gè)動(dòng)物供應(yīng)商，其中16只購自北京瑪斯生物技術(shù)有限公司，4只動(dòng)物購自廣州醫(yī)藥研究總院有限公司。所有動(dòng)物均通過出場(chǎng)質(zhì)量檢驗(yàn)。

1.1.2 動(dòng)物飼養(yǎng)條件 飼料：每日喂食1次，約250 g。犬維持飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供，每批飼料均提供包含常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分、重金屬、農(nóng)藥和微生物學(xué)等檢測(cè)指標(biāo)的質(zhì)量檢測(cè)報(bào)告。

飲水：動(dòng)物自由飲用自制去離子水。每季度進(jìn)行一次包含pH、電導(dǎo)率、微生物及重金屬等的水質(zhì)分析；每年進(jìn)行一次包括感官指標(biāo)、理化指標(biāo)和微生物等指標(biāo)的全面水質(zhì)檢測(cè)。

籠具：不銹鋼籠具，單個(gè)籠具尺寸為1 080 mm×930 mm×930 mm，不同籠具之間可以聯(lián)通，以進(jìn)行群體飼養(yǎng)。

1.1.3 儀器 ADVIA 2120型全自動(dòng)血液分析儀，德國(guó)西門子公司產(chǎn)品；Hitachi-7060型自動(dòng)生化分析儀，日本日立產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及飼養(yǎng)方法 20只按照性別采用完全隨機(jī)分組，將動(dòng)物分為組1和組2，每組雌性動(dòng)物7只，雄性動(dòng)物3只，且保證每組均包括2個(gè)動(dòng)物供應(yīng)商的動(dòng)物。

組1動(dòng)物從第1天至第14天均為單籠飼養(yǎng)，第15天至第28天為群體飼養(yǎng)。組2動(dòng)物自第1天至第14天均為群體飼養(yǎng)，第15天至第28天為單籠飼養(yǎng)。群體飼養(yǎng)方式為模擬GLP試驗(yàn)中常用的群體飼養(yǎng)方式：白天單籠飼養(yǎng)，每日傍晚撤食后，按照性別整夜群養(yǎng)，隔日上午加食前分籠。

1.2.2 血液學(xué)及血清生化指標(biāo)檢測(cè) 分別在試驗(yàn)開始前(基礎(chǔ)值)、第7天、第14天、第21天、第28天采集血液進(jìn)行血液學(xué)及血清生化檢測(cè)。血液學(xué)檢測(cè)的指標(biāo)、方法及本試驗(yàn)體系背景數(shù)據(jù)范圍參考見表1，血清生化檢測(cè)指標(biāo)、方法及本試驗(yàn)體系背景數(shù)據(jù)范圍參考見表2。

表1 血液學(xué)檢測(cè)指標(biāo)及背景數(shù)據(jù)范圍參考

注：背景數(shù)據(jù)范圍基于本試驗(yàn)機(jī)構(gòu)累積的1 800余只比格犬?dāng)?shù)據(jù)匯總計(jì)算而得。

Note:The background reference data were calculated based on the hematology data from 1 800 Beagle dogs.

表2 血清生化檢測(cè)指標(biāo)及正常值范圍參考

注：背景數(shù)據(jù)范圍基于本試驗(yàn)機(jī)構(gòu)累積的1 800余只比格犬?dāng)?shù)據(jù)匯總計(jì)算而得。

Note:The background reference data were calculated based on the serum chemistry data from 1 800 Beagle dogs.

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析 血液學(xué)及血清生化指標(biāo)按性別以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。上述數(shù)據(jù)應(yīng)采用SPSS Statistics 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，每組的不同階段與基礎(chǔ)值相比時(shí)，均按照以下方法統(tǒng)計(jì)：①用Levene's檢驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)的方差齊性，如果方差齊(P>0.05)，則進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)；如果方差不齊(P≤0.05)，則Dunnett T3檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較檢驗(yàn)(0.05和0.01水平);②如果方差分析結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P≤0.05)，則進(jìn)一步用Dunnett t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較檢驗(yàn)(0.05和0.01水平)；如果方差分析結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，則統(tǒng)計(jì)結(jié)束。

2 結(jié)果

2.1 血液學(xué)檢測(cè)結(jié)果

組1和組2動(dòng)物在不同階段采用不同飼養(yǎng)方式后檢測(cè)的血液學(xué)檢測(cè)結(jié)果見表3和表4。從檢測(cè)結(jié)果可知，組1動(dòng)物在D21(群養(yǎng))階段可見MCV高于基礎(chǔ)值，MCHC低于基礎(chǔ)值(P<0.01)。組2動(dòng)物在D21(單籠飼養(yǎng))階段可見MCV高于基礎(chǔ)值(P<0.05)，MCHC低于基礎(chǔ)值(P<0.01)。這2項(xiàng)指標(biāo)的改變程度在背景數(shù)據(jù)參考范圍附近波動(dòng)，且未伴隨其他紅系參數(shù)的改變。因此不認(rèn)為是不良反應(yīng)或改變。

表3 組1動(dòng)物不同階段血液學(xué)數(shù)據(jù)

注：n為動(dòng)物數(shù)。與基礎(chǔ)值比較，**P<0.01。

Note:n is the animal number of each group.Compared with the pre-study data,**P<0.01.

表4 組2動(dòng)物不同階段血液學(xué)數(shù)據(jù)

注：n為動(dòng)物數(shù)。與基礎(chǔ)值比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note:n is the animal number of each group.Compared with the pre-study data,*P<0.05,**P<0.01.

2.2 血清生化檢測(cè)結(jié)果

組1和組2雌雄動(dòng)物在不同階段采用不同飼養(yǎng)方式后檢測(cè)的血清生化檢測(cè)結(jié)果見表5和表6。從檢測(cè)結(jié)果可知，組1動(dòng)物在D7～D21(單籠飼養(yǎng)→群養(yǎng))階段可見TBIL及DBIL低于基礎(chǔ)值(P<0.05，P<0.01)。組2動(dòng)物在試驗(yàn)期間未見明顯血清生化指標(biāo)的改變。TBIL和DBIL的降低無臨床毒理學(xué)意義，因此不認(rèn)為是不良反應(yīng)或改變。

表5 組1動(dòng)物不同階段血清生化數(shù)據(jù)

注：n為動(dòng)物數(shù)。與基礎(chǔ)值比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note:n is the animal number of each group.Compared with the pre-study data,*P<0.05,**P<0.01.

表6 組2動(dòng)物不同階段血清生化數(shù)據(jù)

注：n為動(dòng)物數(shù)。與基礎(chǔ)值比較，P>0.05。

Note:n is the animal number of each group.Compared with the pre-study data,P>0.05.

3 討論

隨著新藥安全性評(píng)價(jià)機(jī)構(gòu)的不斷發(fā)展和完善，各個(gè)機(jī)構(gòu)對(duì)于動(dòng)物福利的要求也越來越高，逐漸與國(guó)際并軌。目前，國(guó)際上對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境豐富的重要措施之一就是提倡對(duì)于社群動(dòng)物的群養(yǎng)，而新藥的安全性評(píng)價(jià)研究不僅需關(guān)注動(dòng)物福利更需要保證試驗(yàn)的科學(xué)性，已有研究人員在關(guān)注動(dòng)物福利措施對(duì)于試驗(yàn)數(shù)據(jù)的影響[6-9]。在安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)設(shè)計(jì)中多數(shù)機(jī)構(gòu)會(huì)采取優(yōu)先采用群養(yǎng)，當(dāng)動(dòng)物給藥后出現(xiàn)異常癥狀時(shí)，會(huì)在獸醫(yī)批準(zhǔn)的情況下進(jìn)行單籠飼養(yǎng)。這樣就會(huì)導(dǎo)致在同一個(gè)試驗(yàn)中，不同劑量組別的動(dòng)物由于毒性反應(yīng)的程度不同而處于不同的飼養(yǎng)條件。這會(huì)為實(shí)驗(yàn)人員帶來擔(dān)憂，不統(tǒng)一的飼養(yǎng)條件是否會(huì)帶來動(dòng)物健康情況的變化，特別是對(duì)于比較敏感的臨床病理指標(biāo)的影響。

本試驗(yàn)采用兩組動(dòng)物交叉進(jìn)行群養(yǎng)及單籠飼養(yǎng)，分別在不同節(jié)點(diǎn)檢測(cè)臨床前安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)中常用的血液學(xué)及血清生化檢測(cè)指標(biāo)，結(jié)果顯示群養(yǎng)相對(duì)于單籠飼養(yǎng)的方式對(duì)于比格犬的血液學(xué)及血清生化指標(biāo)不會(huì)造成不良的影響。提示在今后的安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)中，同一個(gè)試驗(yàn)的動(dòng)物采用不同的飼養(yǎng)方式并不會(huì)對(duì)動(dòng)物的臨檢指標(biāo)造成影響，從而影響毒性結(jié)果的判斷。同時(shí)，基于本試驗(yàn)的結(jié)果，可以確定在臨床前安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)中可以針對(duì)不同動(dòng)物的毒性表現(xiàn)程度，遵照獸醫(yī)的意見采用不同的飼養(yǎng)方式，而不必為保證飼養(yǎng)條件的一致，輕易中斷所有試驗(yàn)動(dòng)物的群養(yǎng)，這樣才能更好的保證動(dòng)物的福利。

[1] 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局. 藥物重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則[EB/OL].http//www.cde.org.cn.2014.

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Abstract:The objectives of this experiment was to assess the possible effect of social housing and/or single housing on hematology and serum chemistry in Beagle dogs,and to provide data for animal housing methods in new drug preclinical research.Twenty Beagle dogs were divided into two groups,and single housed and/or social housed for two weeks.Blood was collected once per week for hematology and serum chemistry tests.The result showed that social housing did not have adverse effect on hematology and serum chemistry parameters.This result indicated that animals in GLP studies can be social housed.Beagle dogs only can be changed to single housing under the suggestion of veterinarians when abnormal clinical signs were observed.This is the best way to improve animal welfare.

Keywords:Beagle dog; social housing; good laboratory practice; hematology; serum chemistry

EffectofSocialHousingonHematologicalandSeralChemistryParametersinBeagleDogs

SONG Zheng，LI Hua，RAN Bin，WANG Xi-jie，ZHAO Qi,CHANG Yan

(NationalShanghaiCenterforNewDrugSafetyEvaluationandResearch，ShanghaiInnostarBio-TechCo.,Ltd，Shanghai，201203，China)

S852.2;S815.4

A

1007-5038(2017)08-0071-05

2016-09-20

宋 征(1982-)，女，江蘇南京人，副研究員，博士，主要從事藥物臨床前安全性評(píng)價(jià)研究。*