3種大腸埃希氏菌O157：H7篩檢方法的比較

張婧，王利剛，張磊，費(fèi)云滟，付莎莉，吳丹，陳欣，楊小珊

（重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，重慶401121）

3種大腸埃希氏菌O157：H7篩檢方法的比較

張婧，王利剛，張磊，費(fèi)云滟，付莎莉，吳丹，陳欣，楊小珊*

（重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，重慶401121）

比較mini-VIDAS、膜芯片兩種快速篩檢方法和常規(guī)培養(yǎng)法，以確定兩種快速篩檢方法對(duì)大腸埃希氏菌O157：H7篩檢的效果。以大腸埃希氏菌O157：H7為目標(biāo)菌，針對(duì)3種方法設(shè)計(jì)靈敏性、特異性、抗干擾性試驗(yàn)和人工污染試驗(yàn)。結(jié)果表明，常規(guī)培養(yǎng)法和mini-VIDAS法的靈敏性較高，mini-VIDAS法和膜芯片法的特異性和抗干擾性較高，人工污染試驗(yàn)三者表現(xiàn)符合預(yù)期。日常檢驗(yàn)中可采用國標(biāo)法和mini-VIDAS法進(jìn)行篩檢工作，應(yīng)急檢驗(yàn)可使用膜芯片法縮短篩檢時(shí)間，mini-VIDAS法和膜芯片法可作為初步篩檢的工具使用。

大腸埃希氏菌O157：H7；mini-VIDAS；膜芯片；篩檢

Abstract：This study aimed to compare of two rapid pre-detection methods and traditional culture method for detection ofEscherichia coliO157：H7.Experiments were designed to test the sensitivity，specificity and anti interference of these methods，artificially contaminated samples were tested and verified.The results showed that，traditional culture method and mini-VIDAS method with high sensitivity，mini-VIDAS and membranebased array method with specificity and high anti-interference，artificially contaminate test was as expected.Traditional culture method and mini-VIDAS method can be used for pre-detection in daily inspections，membrane-based array method could shorten the pre-detection time in emergency testing.Additionally，mini-VIDAS and membrane-based array are good tools for pre-detection of theEscherichia coliO157：H7.

Key words：Escherichia coliO157：H7；mini-VIDAS；membrane-based array；pre-detection

大腸埃希氏菌 O157：H7（Escherichia coliO157：H7，E.coliO157）是一種食源性致病菌，是腸出血性大腸埃希氏菌的主要血清型，感染后會(huì)出現(xiàn)腹瀉、出血性腸炎等癥狀，進(jìn)而引發(fā)溶血性尿毒綜合征、血栓形成性血小板減少性紫癜等嚴(yán)重并發(fā)癥，兩種并發(fā)癥的致死率高達(dá)30%[1-2]。1982年美國爆發(fā)了由E.coliO157導(dǎo)致的流行感染，之后世界各國相繼發(fā)生，美國、加拿大、日本等國發(fā)病案例較多，1997年，世界衛(wèi)生組織將E.coliO157列為新的食源性致病菌[3-4]。我國E.coliO157流行多為散發(fā)案例，但在江蘇、安徽、河南等地出現(xiàn)過流行爆發(fā)的報(bào)道[5-7]。為控制食品中E.coliO157污染，預(yù)防E.coliO157導(dǎo)致食源性疾病發(fā)生，國家衛(wèi)生計(jì)生委對(duì)其在食品中的限量進(jìn)行了規(guī)定[8]。

E.coliO157的常規(guī)檢驗(yàn)方法為培養(yǎng)法[9]，操作步驟繁瑣，人員素質(zhì)要求高，且耗時(shí)較長，已經(jīng)不能滿足現(xiàn)在食品檢測(cè)中高通量、短時(shí)效的要求。隨著檢驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)步，基于分子技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)的快速篩檢方法[10-13]逐步進(jìn)入檢驗(yàn)行業(yè)，可靠穩(wěn)定的技術(shù)被開發(fā)為商業(yè)化的產(chǎn)品。本試驗(yàn)將VIDAS大腸桿菌O157（ECO）篩選法[14]和膜芯片法兩種快速篩檢方法與常規(guī)培養(yǎng)法進(jìn)行對(duì)比，從靈敏性、特異性、抗干擾性等方面進(jìn)行試驗(yàn)，評(píng)估兩種快速篩檢方法在檢驗(yàn)工作中的可操作性。

1 試驗(yàn)材料

1.1 菌株與樣品

大腸埃希氏菌 O157：H7（Escherichia coliO157：H7，CICC 21530）、福氏志賀氏菌（Shigella flexneri，CICC 10865）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，CICC 21636/ATCCR27853TM）：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；大腸埃希氏菌（Escherichia coli，ATCCR25922TM）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhimurium，ATCCR14028TM）、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，ATCCR19115TM）：美國菌種保藏中心。

樣品為實(shí)驗(yàn)室日常檢驗(yàn)樣品。

1.2 主要儀器

ZDP-2106常規(guī)生化培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造有限公司；mini-VIDAS全自動(dòng)免疫分析儀：法國生物梅里埃股份有限公司；MFS-8膜芯片雜交儀、IMG-1膜芯片成像儀：四川華漢三創(chuàng)生物科技有限公司。

1.3 主要試劑

常規(guī)培養(yǎng)基、大腸桿菌O157顯色培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；VIDAS大腸桿菌O157（ECO）試劑條：法國生物梅里埃股份有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒：天根生化科技有限公司；致病微生物檢測(cè)芯片：四川華漢三創(chuàng)生物科技有限公司。

2 方法

2.1 3種方法操作步驟

2.1.1 常規(guī)培養(yǎng)法

按照GB/T 4789.36-2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸埃希氏菌O157：H7/NM檢驗(yàn)》第一法檢驗(yàn)流程，轉(zhuǎn)接大腸桿菌O157顯色培養(yǎng)基，36℃培養(yǎng)24 h，觀察篩檢結(jié)果。

2.1.2 mini-VIDAS法

按照GB/T 4789.36-2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸埃希氏菌O157：H7/NM檢驗(yàn)》第三法檢驗(yàn)流程，培養(yǎng)后上機(jī)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)束后儀器報(bào)告并打印篩檢結(jié)果。

2.1.3 膜芯片法

接種產(chǎn)品自帶培養(yǎng)基，并按照其要求培養(yǎng)溫度、時(shí)間培養(yǎng)后，使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌總DNA，使用自帶的PCRMix對(duì)提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物99℃變性10 min，膜芯片雜交儀進(jìn)行雜交、洗脫等操作，結(jié)束后使用膜芯片成像儀觀察篩檢結(jié)果。

2.2 靈敏性試驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希氏菌O157：H7接種到改良EC肉湯培養(yǎng)基中，36℃培養(yǎng)24 h，按照1∶10進(jìn)行梯度稀釋，獲得103CFU/mL～106CFU/mL濃度的菌懸液，不同濃度視作不同方法液體培養(yǎng)基培養(yǎng)物，并分別采用2.1.1、2.1.2、2.1.3 的方法進(jìn)行篩檢。

2.3 特異性試驗(yàn)

大腸埃希氏菌O157：H7、福氏志賀氏菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌分別進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)物按照1∶10進(jìn)行梯度稀釋，獲得105CFU/mL濃度的菌懸液，分別采用2.1.1、2.1.2、2.1.3 的方法進(jìn)行篩檢。

2.4 雜菌干擾試驗(yàn)

大腸埃希氏菌O157：H7、福氏志賀氏菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌分別進(jìn)行培養(yǎng)，按照1∶10進(jìn)行梯度稀釋，以大腸埃希氏菌O157：H7為目標(biāo)，設(shè)定3組混合菌。第一組福氏志賀氏菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的濃度為 103CFU/mL，按照體積比 1∶1∶1∶1∶1混合，第二組5種菌的濃度為104CFU/mL，按照體積比1∶1∶1∶1∶1混合，第三組5種菌的濃度為105CFU/mL，按照體積比1∶1∶1∶1∶1混合。以上混合菌按照體積比1∶1的比例與濃度105CFU/mL大腸埃希氏菌O157：H7混合，同時(shí)分別使用濃度105CFU/mL大腸埃希氏菌O157：H7和濃度105CFU/mL混合菌作為陽性和陰性對(duì)照，分別采用2.1.1、2.1.2、2.1.3的方法進(jìn)行篩檢。

2.5 人工污染試驗(yàn)

收集實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)的大腸埃希氏菌O157：H7陰性樣品20批次，其中畜肉制品5批次、禽肉制品5批次、動(dòng)物內(nèi)臟制品5批次、蔬菜制品5批次，每批次樣品分為兩組，一組為陽性組，按照每25g樣品添加1mL濃度103CFU/mL大腸埃希氏菌O157：H7的比例進(jìn)行人工污染，一組為陰性對(duì)照組，不進(jìn)行人工污染，分別采用2.1.1、2.1.2、2.1.3的方法進(jìn)行篩檢。

3 結(jié)果與討論

3.1 靈敏性試驗(yàn)結(jié)果

用3種方法對(duì)不同濃度的大腸埃希氏菌O157：H7菌懸液進(jìn)行靈敏性試驗(yàn)的結(jié)果如表1所示，在常規(guī)培養(yǎng)法中，顯色培養(yǎng)基上出現(xiàn)典型菌落的濃度為104CFU/mL，mini-VIDAS法判定陽性的濃度為104CFU/mL，膜芯片法檢出濃度為105CFU/mL，mini-VIDAS法靈敏性高于其他兩者。在常規(guī)培養(yǎng)法中采用的顯色培養(yǎng)基選擇性強(qiáng)，因此對(duì)靈敏性有一定影響，在顯色培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)符合其典型菌落特征。mini-VIDAS法基于抗原抗體反應(yīng)，靈敏性較高，當(dāng)檢測(cè)閾值（TV，test va lue）值大于0.10時(shí)，系統(tǒng)判定檢出大腸埃希氏菌O157：H7。膜芯片法通過核酸雜交顯色后觀察是否陽性，但在雜交前還經(jīng)過了DNA提取、PCR擴(kuò)增、高溫變性等過程，操作步驟越多對(duì)靈敏度的影響越大。

表1 不同檢測(cè)方法靈敏性比較Table 1 Comparison of sensitivity of three methods

3.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果

常規(guī)培養(yǎng)法中，顯色培養(yǎng)基上大腸埃希氏菌O157：H7的生長特征明顯，同菌屬的大腸埃希氏菌也可以有效分離，但是福氏志賀氏菌與大腸埃希氏菌O157：H7生長情況相似，還需進(jìn)行下一步試驗(yàn)才能確定?；诳乖贵w特異結(jié)合反應(yīng)的mini-VIDAS法對(duì)大腸埃希氏菌O157：H7的特異性較強(qiáng)，除單核細(xì)胞增生李斯特氏菌判定陽性外，其他幾種菌的判定均為陰性。膜芯片法針對(duì)大腸埃希氏菌O157：H7的eaeA基因設(shè)計(jì)探針，特異性較好。不同檢測(cè)方法特異性比較見表2。

表2 不同檢測(cè)方法特異性比較Table 2 Comparison of specificity of three methods

3.3 雜菌干擾試驗(yàn)結(jié)果

按照2.4的設(shè)計(jì)，干擾菌的總濃度水平為104、105、106CFU/mL，分別處于高于、相當(dāng)、低于大腸埃希氏菌O157：H7的濃度水平，陽性對(duì)照和陰性對(duì)照的結(jié)果顯示3種方法的操作正常。常規(guī)培養(yǎng)法中在3個(gè)設(shè)計(jì)中均有典型菌落生長，但由于其中有其他干擾菌的存在，故無法直接判定，還需進(jìn)一步試驗(yàn)才能確定，同時(shí)由于雜菌存在，進(jìn)行鑒定時(shí)應(yīng)該選擇多個(gè)菌落進(jìn)行鑒定，以防發(fā)生漏檢的情況。Mini-VIDAS法的篩檢結(jié)果均為陽性，陰性對(duì)照結(jié)果為陰性，顯示了該方法的特異性較強(qiáng)。膜芯片法在干擾菌濃度低或者相當(dāng)時(shí)檢出，干擾菌濃度高時(shí)未檢出的原因分析為，DNA提取后總DNA濃度不變，但是目標(biāo)菌的DNA濃度相對(duì)降低，影響判定結(jié)果。不同檢測(cè)方法抗干擾性比較見表3。

表3 不同檢測(cè)方法抗干擾性比較Table 3 Comparison of anti-interference of three methods

3.4 人工污染試驗(yàn)

人工污染試驗(yàn)中，常規(guī)培養(yǎng)法對(duì)于陽性組的篩檢效率為100%，仍需進(jìn)行下一步試驗(yàn)；對(duì)陰性組的篩檢效率為5%，其中有1批次牛肉有典型菌落，進(jìn)一步試驗(yàn)后確定非腸埃希氏菌O157：H7。mini-VIDAS法對(duì)于陽性組篩檢效率為100%，對(duì)陰性組篩檢效率為0%，完全符合人工污染設(shè)計(jì)。膜芯片法對(duì)于陽性組篩檢效率為100%，但是陽性結(jié)果觀察顯色程度不同，個(gè)別顯色較淺，肉眼幾乎無法分辨，借助膜芯片成像儀可見顯色，分析原因?yàn)樵鼍^程中由于雜菌較多大腸埃希氏菌O157：H7未形成優(yōu)勢(shì)菌株，進(jìn)而影響以后的一系列操作，符合預(yù)期。人工污染試驗(yàn)篩檢結(jié)果比較見表4。

表4 人工污染試驗(yàn)篩檢結(jié)果比較Table 4 Comparison of the screening for artificially contaminated samples

4 結(jié)論

從兩種快速篩檢方法與常規(guī)培養(yǎng)法的比較結(jié)果可以看出，常規(guī)培養(yǎng)法的靈敏性較優(yōu)，但是某些細(xì)菌在顯色培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)與目標(biāo)菌相似，使其特異性和抗干擾性受到一定影響；mini-VIDAS法在特異性、靈敏性和抗干擾上表現(xiàn)良好，可作為較好的篩選方法應(yīng)用到檢驗(yàn)工作中；膜芯片法的特異性較好，但是該方法要從菌株水平轉(zhuǎn)換到分子水平，操作人員的熟練程度對(duì)其靈敏性有一定的影響。實(shí)際操作中3種方法的篩檢時(shí)間差異較大，常規(guī)培養(yǎng)法為78 h，mini-VIDAS法為30 h，膜芯片法為14 h。綜合以上情況，建議日常檢驗(yàn)中可以采用國標(biāo)法和mini-VIDAS法進(jìn)行篩檢工作，對(duì)于應(yīng)急任務(wù)可使用膜芯片法縮短篩檢時(shí)間，同時(shí)用mini-VIDAS法進(jìn)行驗(yàn)證，確保試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確。

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Comparison of Three Pre-detection Methods for Detection of Escherichia coli O157：H7

ZHANG Jing，WANG Li-gang，ZHANG Lei，F(xiàn)EI Yun-yan，F(xiàn)U Sha-li，WU Dan，CHEN Xin，YANG Xiao-shan*
（Chongqing Institute for Food and Drug Control，Chongqing 401121，China）

2017-01-16

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.024

重慶市社會(huì)民生科技創(chuàng)新專項(xiàng)項(xiàng)目（cstc2015shmszx 00002）；重慶市科技計(jì)劃項(xiàng)目（cstc2015jcsf8001）

張婧（1985—），女（漢），工程師，碩士研究生，研究方向：食源性致病菌檢驗(yàn)。

*通信作者：楊小珊（1975—），女（漢），高級(jí)工程師，博士，研究方向：食品安全與監(jiān)管。