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      液相串聯(lián)質(zhì)譜法測定核桃中5種黃曲霉毒素

      2017-10-11 08:06:30臧國棟楊欽沾陳孟君林玉嬋
      食品研究與開發(fā) 2017年19期
      關(guān)鍵詞:親和柱黃曲霉乙腈

      臧國棟,楊欽沾,陳孟君,林玉嬋

      (惠州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測中心,廣東惠州516008)

      液相串聯(lián)質(zhì)譜法測定核桃中5種黃曲霉毒素

      臧國棟,楊欽沾,陳孟君,林玉嬋

      (惠州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測中心,廣東惠州516008)

      建立核桃中黃曲霉毒素G1、G2、B1、B2、M1的測定方法。核桃經(jīng)70%甲醇溶液提取、免疫親和柱凈化后,用高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜分析法測定。黃曲霉毒素 G1、G2、B1、B2、M1在 0.5 μg/L~50 μg/L 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系,r>0.999。回收率在86.5%~98.0%之間。此方法定量準確、專屬性比較強,假陽性率低,有較普遍的實用性,適合核桃中黃曲霉毒素的測定。

      核桃;三重四級桿質(zhì)譜;黃曲霉毒素

      Abstract:To establish the determination method of Aflatoxins G1,G2,B1,B2,M1in walnut.Walnut was extracted by 70%methanol solution,purified by immunoaffinity column and analyzed by ultra high performance liquid chromatography-tandem triple quadrupole mass spectrometry.The linear relationship between the peak area of Aflatoxins G1,G2,B1,B2,M1was 0.5 μg/L-50 μg/L,r> 0.999.The recoveries ranged from 86.5%to 98.0%.This method was accurate,and the specificity was relatively strong,the false positive rate was low,there were more general practicality,it was suitable for the determination ofAflatoxinsin walnut.

      Key words:walnut;triple quadrupole mass spectrum;Aflatoxins

      黃曲霉毒素(Aflatoxins)是生長在食物及飼料中的黃曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉代謝的一組化學結(jié)構(gòu)類似的產(chǎn)物,黃曲霉毒素具有強毒性和致癌性,其中黃曲霉毒素B1急性毒性是氰化鉀的10倍,慢性中毒可誘發(fā)肝癌[1-3]。黃曲霉毒素存在于土壤、動植物、各種堅果,特別是花生和核桃中。1993年被世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)的癌癥研究機構(gòu)劃定為一類致癌物[4],是人類原發(fā)性肝癌的主要致病因素之一,目前大多數(shù)國家和地區(qū)都已出臺相關(guān)法律,對食品和飼料中黃曲霉毒素含量進行嚴格控制。鑒于黃曲霉毒素對人類的健康造成的危害,世界上許多國家已建立黃曲霉毒素限量標準。因此,對各類油脂中黃曲霉毒素含量的檢測不可缺少,而目前油脂中黃曲霉毒素常用檢測方法包括薄層色譜法、酶聯(lián)免疫化學分析法、液質(zhì)聯(lián)用法、微柱篩選法和高效液相色譜法。在本研究中,我們建立用高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜對核桃中的黃曲霉毒素G1、G2、B1、B2、M1進行測定。

      1 材料與方法

      1.1 儀器與試劑

      Agilent G6460三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀,配電噴霧離子源,配Agilent 1290超高效液相色譜儀:美國Agilent公司;TGL-16M高速冷凍離心機:湘儀離心機公司;SC-8L-150數(shù)控固相萃取裝置:廣州智真生物公司;MCX 固相萃取小柱(60 mg,3 mL):美國 Waters公司;微孔濾膜(0.22 μm):天津津騰公司;

      黃曲霉毒素總量免疫親和柱(3mL/60mg):美國Beacon;黃曲霉毒素 G1、G2、B1、B2、M1標準品溶液:農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所;黃曲霉毒素 G1、G2、B1、B2、M1的濃度均為 1.0 μg/mL;核桃:市場購買;甲醇、乙腈(均為色譜純):MERCK公司;試劑(均為分析純):中國醫(yī)藥(集團)上?;瘜W試劑公司。

      1.2 液相色譜條件

      色譜柱:ZORBAX Eclipse PlusC18柱,2.1 mm×50 mm×1.8μm(Agilent公司);柱溫:30℃;流速:0.3 mL/min;進樣量:10 μL;流動相:A為0.2%甲酸水溶液,B為乙腈;梯度洗脫程序見表1。

      表1 流動相條件Table 1 Mobile phase conditions

      1.3 質(zhì)譜條件

      電離方式:電噴霧電離源(ESI),正離子模式掃描,多反應(yīng)監(jiān)測(multiple-reaction monitoring,MRM),離子源溫度:350℃;氣體:氮氣;干燥氣流速:6 L/min;霧化器壓力:310 kPa;鞘氣溫度:350℃;經(jīng)過對毛細管出口電壓、碰撞池能量等質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化,最終確定黃曲霉毒素 G1、G2、B1、B2、M1質(zhì)譜條件見表2。

      表2 黃曲霉毒素G1、G2、B1、B2、M1檢測的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometry parameters of Aflatoxins G1,G2,B1,B2,M1

      1.4 樣品預處理

      準確取粉碎均質(zhì)樣品5.0 g加入1.0 g氯化鈉和70%甲醇水溶液25 mL,均質(zhì)器高速攪拌提取1 min,然后超聲處理10 min,10 000 r/min離心5 min,定性濾紙過濾,吸取上清液5 mL,用水稀釋至20 mL,搖勻,待凈化。取10 mL待測液,緩慢通過免疫親和柱,流速控制在1 mL/min左右,再用10 mL純水淋洗,棄去淋洗液,準確加入1.0 mL甲醇洗脫,流速控制在1 mL/min~2mL/min,收集甲醇洗脫液,渦旋混合1 min,過0.22 μm微孔濾膜于進樣瓶,供液質(zhì)分析。

      2 結(jié)果

      2.1 線性關(guān)系

      配制黃曲霉毒素(AFT)G1、G2、B1、B2、M1混合標準溶液濃度從 0.5 μg/L~50.0 μg/L,進行檢測分析,結(jié)果表明:在 0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L 的濃度范圍內(nèi),黃曲霉毒素 G1、G2、B1、B2、M1都具有良好的線性,線性相關(guān)系數(shù)r大于0.999,記錄各待測組分色譜峰面積,以各成份的進樣量為橫坐標(X),各成份的峰面積為縱坐標(Y),進行回歸分析,校正曲線結(jié)果見表3。

      表3 回歸方程和相關(guān)系數(shù)Table 3 Regression equation and correlation coefficient

      2.2 檢出限及定量限

      以3倍信噪比(S/N=3)對應(yīng)的濃度作為方法檢出限(LOD),以10倍信噪比(S/N=10)對應(yīng)的濃度作為方法定量限(LOQ),5種黃曲霉毒素的檢出限為0.2μg/kg~0.3 μg/kg,定量限為 0.5 μg/kg~1.0 μg/kg,均滿足檢測要求,結(jié)果見表4。

      表4 5種黃曲霉毒素檢出限和定量限Table 4 LOD and LOQ about 5 kinds of Aflatoxins

      2.3 回收率及精密度

      在核桃陰性樣品中添加3.0 μg/L及10.0 μg/L黃曲霉毒素混合標準溶液,按1.4方法進行前處理,平行測定6次,得到方法平均回收率及精密度,結(jié)果如表5所示。5種黃曲霉素的平均回收率為86.5%~98.0%,RSD為0.3%~2.9%。

      2.4 樣品測定結(jié)果

      按擬訂方法測定核桃樣品,結(jié)果未檢出黃曲霉毒素 G1、G2、B1、B2、M1。

      表5 5種黃曲霉毒素回收率及相對標準偏差(n=6)Table 5 Recovery and relative standard deviation about 5 kinds ofAflatoxins(n=6)

      3 討論

      3.1 提取劑的選擇

      黃曲霉毒素易溶于有機試劑甲醇和乙腈,普遍采用的提取方法是用一定比例的甲醇水[5-7]或乙腈水[8-9]來提取樣品中的黃曲霉毒素,本文選用70%甲醇水溶液為提取劑。

      3.2 凈化小柱的選擇

      目前,用于黃曲霉毒素分離純化的固相萃取方法有多功能凈化柱[1]、免疫親和柱[10-11]和分散固相萃取法(C18)[12]等,由于免疫親和柱,本文使用免疫親和柱凈化樣品。靈敏度高,用凝膠作為固相載體,與黃曲霉毒素 G1、G2、B1、B2、M1高特異性的單克隆抗體共價連接,可以有效除去雜質(zhì),相比傳統(tǒng)凈化方法,操作簡單快速靈敏度高,可實現(xiàn)較大量樣品的提取。

      3.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

      在電噴霧正離子監(jiān)測模式下對AFT B1、AFT B2、AFT G1、AFT G2進行一級質(zhì)譜掃描,得到母離子;然后對母離子進行子離子掃描(Product Ion Scan)得到子離子;對裂解電壓(Fragmentor)和碰撞能量(CE)等二級質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化,以由母離子產(chǎn)生的子離子豐度達到最大時為最優(yōu),選擇兩個豐度最高一對子離子作為定量和定性離子。

      3.4 液相條件的優(yōu)化

      普遍用乙腈-水作為流動相,質(zhì)譜靈敏度高,在乙腈-水中加入甲酸有助于待測物母離子 [M+H]+的形成,而且隨著甲酸濃度的增加,質(zhì)譜響應(yīng)值增加,超過一定的濃度反而下降[13-14],本文采用乙腈-水(0.2%甲酸)作為流動相。因為5種黃曲霉毒素的分子結(jié)構(gòu)比較接近,采用梯度洗脫能較好的得到分離。

      4 結(jié)論

      目前,黃曲霉毒素 G1、G2、B1、B2、M1文獻記載的測定方法有液相色譜法、薄層色譜法、酶聯(lián)免疫法、熒光分光光度法等[4],我國現(xiàn)在還沒有黃曲霉毒素的質(zhì)譜檢法的國標,與以前的方法相比,本文采用免疫親和柱凈化樣品,用高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜分析樣品,優(yōu)點在于待分析樣品無需衍生,可直接分析測定,大大減少了分析的時間,結(jié)果準確性和檢測靈敏度大幅度提高,此方法快速、靈敏、準確、專屬性比較強,假陽性率低,有較普遍的實用性,是核桃及其其它堅果中的黃曲霉毒素測定較好的參考方法。

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      Determination of Aflatoxins G1,G2,B1,B2and M1in Walnut by HPLC-MS/MS

      ZANG Guo-dong,YANG Qin-zhan,CHEN Meng-jun,LIN Yu-chan
      (Huizhou Center for Agricultural Products Quality and Safety Supervision and Testing,Huizhou 516008,Guangzhou,China)

      2017-02-21

      10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.028

      惠州市科技計劃項目(2014B40008003)

      臧國棟(1981—),男(漢),碩士,研究方向:抗逆分子生物學。

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