李玉平，侯亞莉，程千川，蘇亮

（重慶市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，重慶401120）

高效液相色譜法測(cè)定豬腎臟中赭曲霉毒素A

李玉平，侯亞莉，程千川，蘇亮

（重慶市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，重慶401120）

建立高效液相色譜法測(cè)定豬腎臟中赭曲霉毒素A（OTA）的含量。采用免疫親和柱凈化，Zorbax SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱，乙腈-2%乙酸為流動(dòng)相，激發(fā)波長(zhǎng)（λem）為 332 nm，發(fā)射波長(zhǎng)（λex）為 460 nm。結(jié)果顯示，赭曲霉毒素A在0.1 ng/mL～10 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2=0.999 9），平均加樣回收率為77.3%～84.4%，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.8%～1.3%。該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確性好、靈敏度高，可用于豬腎臟中赭曲霉毒素含量的測(cè)定。

赭曲霉毒素A；免疫親和柱；高效液相色譜法

Abstract：The orhratoxin A（OTA）content in the kidney of pigs was determined by high performance liquid chromatography.The Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）column was used with the mobile phase of acetonitrile-2%acetic acid and the detection of extraction wavelength 332 nm and emission wavelength 460 nm，and purified by immunoaffinity column.The results showed that the OTA content had good linear relationship in the range of 0.1 ng/mL-10 ng/mL（R2=0.999 9），the average recovery was 77.3%-84.4%，and relative standard deviation （RSD）was 0.8%-1.3%.The method was simple，accurate and sensitive for the determination of ochratoxin in the kidney of pigs.

Key words：ochratoxin A；immunoaffinity column；high performance liquid chromatography

赭曲霉毒素A（ochratoxins A，OTA）是由曲霉菌屬和青霉菌屬的某些細(xì)菌產(chǎn)生的一種有毒真菌次生代謝產(chǎn)物[1]，對(duì)動(dòng)物和人類具有腎臟毒性、肝毒性、致突變、致畸性、致癌性和免疫抑制作用[2]。OTA廣泛分布于各種飼料及飼料原料中，動(dòng)物食用了含OTA的飼料后會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)蓄積，尤其是動(dòng)物的肝臟、腎臟、肌肉及血液，殘留在動(dòng)物產(chǎn)品中的OTA可通過(guò)食品鏈傳遞給消費(fèi)者，進(jìn)而嚴(yán)重威脅著人類的健康。

目前，檢測(cè)OTA常用方法有薄層色譜法（TLC）、酶聯(lián)吸附免疫法（ELISA）、高效液相色譜法（HPLC）和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS/MS）[3-8]。TLC法為半定量方法，靈敏度較低、方法繁瑣、重復(fù)性差，且在提取過(guò)程中所需有機(jī)溶劑種類多、用量大，易污染環(huán)境，對(duì)人體也有較大危害。ELISA法測(cè)定結(jié)果受試劑盒種類、儀器靈敏度和實(shí)驗(yàn)溫度等條件影響較大，假陽(yáng)性率高。LC-MS/MS法省時(shí)、高效、靈敏，但成本高。HPLC法可進(jìn)行定性和定量分析，靈敏度較高、回收率高、重復(fù)性好、定量結(jié)果準(zhǔn)確，成為最常用的檢測(cè)方法。近年來(lái)，我國(guó)對(duì)谷類、糧食等植物產(chǎn)品方面采用HPLC法測(cè)定OTA含量的研究較多，也制定了相關(guān)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和限量標(biāo)準(zhǔn)[9-10]，而對(duì)動(dòng)物性產(chǎn)品中OTA檢測(cè)方面的研究報(bào)道較少，因此建立快速、靈敏、簡(jiǎn)便的HPLC法，完善我國(guó)畜產(chǎn)品的OTA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和限量標(biāo)準(zhǔn)是有必要的。參考國(guó)外相關(guān)文獻(xiàn)[11-14]，本試驗(yàn)建立了采用免疫親和柱凈化，高效液相色譜-熒光檢測(cè)法檢測(cè)豬腎臟中的OTA含量的方法。該方法操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可為我國(guó)動(dòng)物產(chǎn)品制定檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和限量標(biāo)準(zhǔn)提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

免疫親和柱：北京華安麥科生物技術(shù)有限公司；OTA標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma公司；甲醇、乙酸、乙腈、乙酸乙酯：色譜純，美國(guó)Fisher公司；氯化鈉、碳酸氫鈉、吐溫-20：分析純，重慶邁克公司；水由Milli-Q純水儀制造。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters e2695高效液相色譜儀-2475熒光檢測(cè)器：美國(guó)Waters公司；ML204電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；TTL-Dcll型氮吹儀：北京同泰聯(lián)科技發(fā)展公司；SIGMA 3K30高速離心機(jī)：德國(guó)SIGMA公司；SIR 4渦旋振蕩器：德國(guó)IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

OTA標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制：稱取適量的OTA標(biāo)準(zhǔn)品，用苯-乙酸（99∶1，體積比）配制成 0.10 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

淋洗緩沖液：稱取12.5 g氯化鈉、5 g碳酸氫鈉溶于水中，加入0.1 mL吐溫-20，用水稀釋至1.0 L。

洗脫液：甲醇∶乙酸=49∶1（體積比）配制。

1.3.2 液相色譜分析條件

色譜柱：ZorbaxSB-C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；柱溫：30℃；流動(dòng)相：乙腈-2%乙酸（45∶55，體積比）；流速：1.0 mL/min；熒光檢測(cè)器：激發(fā)波長(zhǎng)（λex）332 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為（λem）460 nm；進(jìn)樣量：50 μL。

1.3.3 樣品的提取

將樣品勻漿混勻，準(zhǔn)確稱取2.0 g（精確到0.01 g）于50 mL離心管中，加入0.6 mL濃度為1.0 mol/L的磷酸溶液（調(diào)節(jié)pH值約至2.5），再加入5.0 mL乙酸乙酯，混勻。以4 000 r/min離心5 min，移出上清液，重復(fù)提取3次，合并3次上清液。上清液中加入5.0 mL濃度為0.5 mol/L的碳酸氫鈉（NaHCO3）試液，振蕩提取3 min，4 000 r/min離心5 min，棄去上層提取液。剩余的提取液中加正己烷適量，靜置，棄去正己烷層，用磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值約至8.4，備用。

1.3.4 樣品的凈化

將免疫親和柱置室溫下預(yù)先平衡，加入提取液，調(diào)節(jié)流速不超過(guò)1.0 mL/min，使其緩慢通過(guò)免疫親和柱。待柱內(nèi)液體流干后，加入10.0 mL淋洗緩沖液進(jìn)行淋洗，棄去全部流出液。把柱內(nèi)殘余液體抽干，加入3.0 mL洗脫液，收集洗脫液于玻璃刻度試管中，氮?dú)?0℃下吹干。精密加入1.0 mL流動(dòng)相溶解，過(guò)濾膜后，采用高效液相色譜法測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品溶液色譜圖

根據(jù)1.3.2下色譜條件、1.3.3和1.3.4項(xiàng)下方法操作，得出OTA標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液的色譜圖，結(jié)果見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品（A）和樣品（B）溶液色譜圖Fig.1 HPLC of standard（A）and sample（B）

由圖1可知，所得OTA色譜峰形對(duì)稱，基線平穩(wěn)，且樣品中的OTA和雜質(zhì)的分離度好。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程

將0.1 μg/mL的OTA標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用流動(dòng)相分別稀釋制成濃度為 0.1、0.2、0.5、1.0、5.0、10.0 ng/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。根據(jù)相應(yīng)的峰面積和對(duì)應(yīng)的檢測(cè)濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖2），此標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 9，回歸方程是y=144 488x-154.59。

圖2 赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of ochratoxin A

2.3 檢測(cè)限

將標(biāo)準(zhǔn)品溶液適當(dāng)稀釋后制得一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)樣分析，以信噪比S/N=3時(shí)的質(zhì)量濃度作為檢出限，測(cè)得OTA的檢出限為0.1 ng/mL。

2.4 精密度試驗(yàn)

取1.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣50 μL，根據(jù)峰面積計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表1。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of precision assay

由表1可知，樣品檢測(cè)結(jié)果的RSD=0.7%，表明該方法的精密度良好。

2.5 回收率試驗(yàn)

稱取樣品約2.0 g，分別加入濃度為0.5、1.0、5.0 ng/mL赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品溶液各1.0 mL，按照1.3.3、1.3.4項(xiàng)下方法操作，1.3.2下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度平行測(cè)定3次，測(cè)定其加標(biāo)回收率及RSD（%），結(jié)果見表2。

表2 樣品回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of recovery assay

由表2可知，3個(gè)不同濃度的平均回收率為77.3%～84.4%，其標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.8%～1.3%，表明本方法的準(zhǔn)確度高，可滿足檢測(cè)的要求。

2.6 樣品含量測(cè)定

稱取10份樣品，每份2.0 g（精確至0.01 g），按1.3.3和1.3.4項(xiàng)下的方法處理后，再用1.3.2下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有4份樣品中含有OTA，其余未檢出，測(cè)得其含量分別為 0.151、0.225、0.185、0.201 ng/mL。

3 結(jié)論與討論

3.1 提取溶劑的選擇

赭曲霉素A（OTA）溶于極性溶劑和稀碳酸氫鈉溶液，微溶于水，試驗(yàn)中選擇甲醇、乙腈、乙酸乙酯等作為提取溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用乙酸乙酯提取回收率較高，結(jié)合試劑費(fèi)用和安全性考慮，選擇乙酸乙酯作為提取溶劑。此外，依據(jù)OTA溶于稀碳酸氫鈉溶液的物理性質(zhì)，試驗(yàn)中又采用了0.5 mol/L的碳酸氫鈉試液對(duì)乙酸乙酯提取液進(jìn)行了提取，進(jìn)而更好的保證了OTA的提取。

3.2 凈化條件的選擇

肉制品及內(nèi)臟組織中赭曲霉毒素的測(cè)定比谷物類食品中要困難很多，因?yàn)橐コ罅啃》肿拥牡鞍踪|(zhì)、干擾肽、磷脂和其他干擾物質(zhì)，本文采用選擇性高的免疫親和柱來(lái)除去多數(shù)雜質(zhì)成分，且使用時(shí)不需要活化。但免疫親和柱具有選擇性吸附的特性，樣品在凈化過(guò)程中，某些具有生物活性的雜質(zhì)也會(huì)有少量吸附于柱子上，因此試驗(yàn)過(guò)程中預(yù)先采用正己烷對(duì)提取的樣品進(jìn)行了脫脂處理，從而提高了親和柱對(duì)OTA的吸附。

3.3 流動(dòng)相條件的選擇

流動(dòng)相對(duì)樣品中待測(cè)組分的峰形、分離度及靈敏度均有影響，試驗(yàn)中分別考察了乙腈-水、乙腈-2%乙酸和甲醇-2%乙酸3種流動(dòng)相的效果，結(jié)果表明選用乙腈-2%乙酸峰形較好。同時(shí)比較了不同比例的乙腈-2%乙酸（45∶55，體積比）、乙腈-2%乙酸（55∶45，體積比）的效果。因考慮到出峰時(shí)間、峰形及組分分離效果，故最后確定乙腈-2%乙酸（45∶55，體積比）作為流動(dòng)相。

本文建立了一種使用高效液相色譜法測(cè)定動(dòng)物腎臟中OTA的檢測(cè)方法，結(jié)果表明，本方法簡(jiǎn)便易行，靈敏度和準(zhǔn)確度高，線性關(guān)系良好，可以滿足對(duì)樣品中此種毒素的檢測(cè)要求。

[1]Krogh P.Mycotoxins in Food[M]．London:Academic Press,1987:97

[2]Kuiper-Goodman T,Scott P M．Risk assessment of the mycotoxin ochratoxin A[J].Biomed Environ Sci,1989,2:179-248

[3]SANTOS E A,VARGAS E A.Immunoaffinity column clean-up and thin layer chromatography for determination of ochratoxin A in green coffee[J].FoodAdditivesandContaminants,2002,19(5):447-458

[4]THIRUMALA-DEVI K,MAYO M A,REDDY G,et al.Production of polyclonal antibodies against ochratoxin A and its detection in chillies by ELISA[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2000,48(10):5079-5082

[5]王鄭平,郭健,曹陽(yáng),等.高效液相色譜法快速測(cè)定糧食中赭曲霉毒素A[J].糧食科技與經(jīng)濟(jì),2014,39(4):31-32

[6]梁桂娟,張瓊,楊波.高效液相色譜-熒光檢測(cè)法檢測(cè)大米中的赭曲霉毒素A[J].中國(guó)釀造2015,34(8):136-138

[7]鄭潤(rùn)生,肖啟衍,邱薇,等.10種中藥材和3種食品污染赭曲霉毒素A的LC－MS/MS檢測(cè)研究[J].藥物分析雜志,2015,35(2):289-294

[8]莫瑾,龔強(qiáng),周慧平,等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)法檢測(cè)茶葉中的赭曲霉毒素A[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào),2016,7(1):182-187

[9]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.SN/T 1746-2006進(jìn)出口大豆、油菜籽和食用植物油中赭曲霉毒素A的檢驗(yàn)方法[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2006:1-6

[10]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局,中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 23502-2009食品中赭曲霉毒素A的測(cè)定免疫親和層析凈化高效液相色譜法[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2009:1-4

[11]Monaci L,Tantillo G,Palmisano F.Determination of ochratoxin A in pig tissues by liquid-liquid extraction and clean-up and highperformance liquid chromatography[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry,2004,378:1777-1782

[12]R Matrella,L Monaci,M A Milillo,et al.Ochratoxin A determination in paired kineys and muscle samples from swines slaughtered in southern Italy[J].Food Control,2006,17:114-117

[13]Dragan Milicevic,Verica Juric,Srdan Stefanovic,et al.Evaluation and validation of two chromatographic methods (HPLC-Fluorescence and LC-MS/MS)for the determination and confirmation of ochratoxin A in pig tissues[J].Arch Environ Contam Toxicol,2010,58:1074-1081

[14]Sorensen L M,Mogensen J,Nielsen K F.Simultaneous determination of ochratoxin A,mycophenolic acid and fumonisin B2in meat products[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry,2010,398:1535-1542

Determination of Ochratoxin A in Kidney of Pigs by High Performance Liquid Chromatography

LI Yu-ping，HOU Ya-li，CHENG Qian-chuan，SU Liang
（Animal Disease Control and Prevention Center of Chongqing，Chongqing 401120，China）

2017-02-17

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.033

李玉平（1986—），女（漢），獸醫(yī)師，碩士，從事獸藥質(zhì)量及獸藥殘留檢測(cè)及研究工作。