面包乳桿菌（Lactobacillus panis）C-M2細(xì)菌素的分離純化及特性分析

單成俊，胡彥新，夏秀東，劉小莉，李 瑩，王 英，章建浩，周劍忠,*

面包乳桿菌（Lactobacillus panis）C-M2細(xì)菌素的分離純化及特性分析

單成俊1,2，胡彥新1,2，夏秀東2，劉小莉2，李 瑩2，王 英2，章建浩1，周劍忠1,2,*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014）

本實(shí)驗(yàn)對面包乳桿菌C-M2所產(chǎn)的新型細(xì)菌素進(jìn)行分離純化和特性研究。通過乙酸乙酯萃取、陽離子交換層析和半制備液相三步分離純化該細(xì)菌素。最終細(xì)菌素的比活力達(dá)到5 044.96 AU/mg，純化倍數(shù)為79.8 倍，但回收率僅為0.35%。通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析，該細(xì)菌素的分子質(zhì)量為863.52 D，氨基酸序列為MVKKTSAV，它是一種新型的Ⅱ類細(xì)菌素。該細(xì)菌素具有廣泛的抑菌譜，可以抑制革蘭氏陽性和陰性的食品腐敗菌。該細(xì)菌素對熱和pH值穩(wěn)定，即使在121 ℃滅菌15 min，仍保留82.1%的抑菌活性，在pH 6條件下保留85.6%的抑菌活性。它能被多種蛋白酶失活，不能被脂肪酶和淀粉酶失活，這些結(jié)果表明該細(xì)菌素具有作為食品生物防腐劑的潛在應(yīng)用價(jià)值。

面包乳桿菌；細(xì)菌素；分離純化；抑菌特性

細(xì)菌素由某些細(xì)菌在代謝過程中通過核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生，是一類對親緣關(guān)系相近的乳酸菌和非乳酸菌的革蘭氏陽性細(xì)菌或革蘭氏陰性細(xì)菌具有抑菌生物活性的蛋白質(zhì)或多肽，而產(chǎn)生菌多所產(chǎn)的細(xì)菌素具有免疫性[1-2]。由于細(xì)菌素能被人胃腸道分泌的蛋白酶降解，對人體無毒副作用，所以細(xì)菌素作為生物食品防腐劑比化學(xué)防腐劑更安全且天然，并且細(xì)菌素具有高效、耐高溫、無抗藥性等特點(diǎn)，能較好地適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)[3-5]。因此，細(xì)菌素在天然食品防腐劑、飼料添加劑、益生素及開發(fā)新藥等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

根據(jù)細(xì)菌素的化學(xué)結(jié)構(gòu)、分子質(zhì)量大小和穩(wěn)定性將細(xì)菌素分為四大類[6-7]：第I類nisin為代表的羊毛硫抗生素，一般為小分子（＜5 kD）且熱穩(wěn)定的、含羊毛硫氨酸的多肽；第Ⅱ類是小分子、熱穩(wěn)定、不含羊毛硫氨酸的多肽（＜10 kD），分為3個(gè)亞類：Ⅱa（如pediocin）、Ⅱb（如lactocin G）、Ⅱc（如lactocin B）；第Ⅲ類熱敏感的大分子蛋白（＞30 kD）；第Ⅳ類復(fù)合細(xì)菌素，除蛋白質(zhì)外還包含其他化學(xué)成分(如碳水化合物、脂類等)。其中Ⅰ類和Ⅱ類細(xì)菌素作為生物防腐劑在食品工業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用的最為廣泛[8-9]。

到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有百余種乳酸菌素，但真正用于商業(yè)化的卻只有nisin和pediocin PA-1，其余僅限于實(shí)驗(yàn)室研究[10]。主要是因?yàn)槿樗峋氐男再|(zhì)（抑菌譜窄、pH值敏感性、熱穩(wěn)定性差）和分離純化方法等諸多因素限制了乳酸菌素的獲取及其工業(yè)化生產(chǎn)[11-12]。因此篩選具有廣譜、耐酸堿、熱穩(wěn)定性好的乳酸菌細(xì)菌素仍然是目前的首要任務(wù)。

本研究室從發(fā)酵玉米粉中分離得到一株產(chǎn)廣譜細(xì)菌素的乳酸菌C-M2。本實(shí)驗(yàn)主要對該乳酸菌C-M2進(jìn)行16S rDNA分子鑒定、所產(chǎn)的細(xì)菌素進(jìn)行分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定以及生物學(xué)特性的研究，以期為進(jìn)一步研究該細(xì)菌素的合成調(diào)控機(jī)制研究和在食品保鮮、生物防腐提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳酸菌C-M2（Lactobacillus panis C-M2）分離于發(fā)酵玉米粉，指示菌金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC25923和大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC25922均保藏于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工所食品生物工程研究室。

H2O2酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K 美國Sigma公司；MRS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基（配方參考文獻(xiàn)[13]） 北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司；檸檬酸、檸檬酸鈉、鹽酸等均為國產(chǎn)分析純；乙腈、三氟乙酸和甲醇均為色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-900 AKTA蛋白純化系統(tǒng) 瑞典GE公司；1525高效液相色譜 美國Waters公司；FDU-1200冷凍干燥機(jī)日本Eaely公司；3K15冷凍離心機(jī) 美國Sigma公司；SW-CJ-2G超凈工作臺、LRH-150生化培養(yǎng)箱 蘇州凈化設(shè)備有限公司；DSX-280B立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器材廠。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化和培養(yǎng)流程[14]

1.3.2 菌種的16S rDNA鑒定

參照文獻(xiàn)[15]進(jìn)行分子鑒定。用細(xì)菌基因組提取試劑盒（Bacterial DNA Kit（200），OMEGA）提取菌株C-M2的DNA，以通用的DNA引物作為PCR的模板，反應(yīng)體系為25μL（表1）。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。將PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電壓為100 V，電泳結(jié)束后用凝膠成像儀觀察條帶，將觀察到的條帶用DNA膠回收試劑盒進(jìn)行切膠回收，并由上海生工生物工程股份有限公司完成測序。

表1 PCR擴(kuò)增體系及用量Table 1 Composition of PCR reaction system used in this study

1.3.3 細(xì)菌素的提取

采用乙酸乙酯萃取的方法[16]提取細(xì)菌素。將發(fā)酵上清液與乙酸乙酯等體積混合置于搖床（120 r/min，2 h）,讓細(xì)菌素充分融入有機(jī)相中，隨后將混合液置于分液漏斗中靜置2 h、收集有機(jī)相（上層液體）、水相（下次液體）重復(fù)上述的操作，共萃取4 次。將4 次萃取獲得的有機(jī)相合并后在45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙酯。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后獲得的細(xì)菌素粗提物用檸檬酸緩 沖液（20 mmol/L，pH 4）進(jìn)行復(fù)溶。以金黃色葡萄球菌為指示菌，采用瓊脂擴(kuò)散牛津杯法[17-18]測定其抑菌活性。

1.3.4 細(xì)菌素的分離純化

1.3.4.1 細(xì)菌素的SP Sepharose Fast Flow陽離子交換層析[19]

將用乙酸乙酯萃取獲得的細(xì)菌素用0.22 μm的過濾膜過濾。配制20 mmol/L、pH 4的檸檬酸緩沖液和含有1 mol/L NaCl的檸檬酸緩沖液。首先用20 mmol/L、pH 4的檸檬酸緩沖液平衡層析柱，以2.0 mL/min的流速、3 mL的上樣量、含1 mol/L NaCl的檸檬酸緩沖液進(jìn)行梯度洗脫。在280 nm波長處紫外檢測收集蛋白峰。將收集的各個(gè)蛋白峰4 ℃透析脫鹽后真空冷凍干燥。以金黃色葡萄球菌為指示菌，采用瓊脂擴(kuò)散牛津杯法測定其抑菌活性。1.3.4.2 半制備高效液相色譜純化[20]

取適量陽離子層析柱純化后獲得的活性峰樣品溶于5%的乙腈中（含有0.1%三氟乙酸）。色譜柱的條件設(shè)定為：平衡液A：超純水+0.1% TFA，洗脫液B：純乙腈+0.1% TFA，流速2.0 mL/min，上樣量0.1 mL，進(jìn)行梯度洗脫。洗脫程序?yàn)椋?～5 min，5% B；5～25 min，5%～25% B；25～35 min，25%～50% B；35～45 min，50% B；45～50 min，50%～0% B。在280 nm波長紫外檢測處收集蛋白峰，將收集的各個(gè)蛋白峰真空冷凍干燥除去乙腈。以金黃色葡萄球菌為指示菌，采用瓊脂擴(kuò)散牛津杯法測定其抑菌活性。

1.3.4.3 細(xì)菌素純度的檢測

利用分析性高效液相色譜來檢測細(xì)菌素的純度是否達(dá)到95%以上。將經(jīng)過半制備高效液相色譜純化后獲得的活性峰樣品溶于5%的乙腈中（含有0.1%三氟乙酸），流速為0.8 mL/min，上樣量為20 μL，按照1.3.4.2節(jié)洗脫程序進(jìn)行洗脫。

1.3.5 質(zhì)譜分析

采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定該細(xì)菌素的分子質(zhì)量和氨基酸序列[21]。將通過冷凍干燥的半制備液相獲得細(xì)菌素樣品懸浮于含0.2%的甲酸的超純水中，以0.3mL/min的流速，上樣量為5μL，洗脫程序?yàn)樵?0min內(nèi)乙腈體積分?jǐn)?shù)從5%升到35%。一級質(zhì)譜在正離子模式下進(jìn)行m/z 300～1 800全掃描，通過DDA（dependent acquisition mode）收集數(shù)據(jù)。二級質(zhì)譜采用CID（collision-induced dissociation）捕捉二級質(zhì)譜中的b和y離子，通過Peaks 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。

1.3.6 細(xì)菌素效價(jià)的測定

面包乳桿菌細(xì)菌素效價(jià)的測定按照參考文獻(xiàn)[22-23]的方法，采用二倍稀釋法，將發(fā)酵上清液用pH 5.0的檸檬酸緩沖液進(jìn)行二倍稀釋，以金黃色葡萄球菌為指示菌，采用瓊脂擴(kuò)散牛津杯法，吸取100 μL進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，用對指示菌顯示沒有抑菌圈的最高稀釋濃度定義為一個(gè)活力單位（AU），稀釋濃度的倒數(shù)就是細(xì)菌素的效價(jià)（AU/mL）。計(jì)算公式如下所示：

式中：Y為細(xì)菌素的效價(jià)/（AU/mL）；n為對指示菌顯抑菌圈的孔數(shù)；x為每孔中的細(xì)菌素液加樣體積/μL。

1.3.7 細(xì)菌素蛋白含量的測定

采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[24]測定細(xì)菌素蛋白含量。

1.3.8 抑菌譜的測定

采用瓊脂擴(kuò)散牛津杯法，將經(jīng)過SP Sepharose Fast Flow陽離子交換層析純化后獲得的細(xì)菌素用于測定面包乳桿菌C-M2的抑菌譜。

1.3.9 細(xì)菌素對溫度、pH值、蛋白酶敏感性的測定

將經(jīng)過SP Sepharose Fast Flow陽離子交換層析純化后獲得的細(xì)菌素分別置于37、60、80、100 ℃水浴鍋中水浴30 min和121 ℃處理15 min，考察不同溫度對細(xì)菌素抑菌活性的影響。

將經(jīng)過SP Sepharose Fast Flow陽離子交換層析純化后獲得的細(xì)菌素分別溶于pH 2～5的檸檬酸緩沖液（20 mmol/L）和 pH 6～9 的磷酸緩沖液（20 mmol/L），然后置于37 ℃水浴鍋中4 h后，測定其殘留活性?？疾觳煌膒H值對細(xì)菌素抑菌活性的影響。

將經(jīng)過SP Sepharose Fast Flow陽離子交換層析純化后獲得的細(xì)菌素分別溶于各種酶的最適pH值的緩沖液中。按質(zhì)量濃度1 mg/mL分別加入蛋白酶K（20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液，pH 7）、胃蛋白酶（20 mmol/L的醋酸鹽緩沖液，pH 2）、胰蛋白酶（20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液，pH 7）、木瓜蛋白酶（20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液，pH 7）、脂肪酶（20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液，pH 7）、α-淀粉酶和β-淀粉酶（20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液，pH 6），在37 ℃水浴2 h后，將上述酶處理過的細(xì)菌素溶液于100 ℃水浴5 min使酶失活?？疾觳煌N類的酶對細(xì)菌素抑菌活性的影響。上述經(jīng)過各種處理后的細(xì)菌素溶液采用瓊脂擴(kuò)散牛津杯法測定其抑菌活性，其中以金黃色葡萄球菌為指示菌，以未做任何處理的細(xì)菌素溶液作為空白對照。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)的結(jié)果表示為 ±s。采用SAS 8.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌菌種的鑒定

圖1 16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of PCR-amplifi ed 16S rDNA

用1.0%的瓊脂糖凝膠對菌株C-M2的16S rDNA產(chǎn)物進(jìn)行電泳，在1 500 bp附近獲得一條熒光條帶（圖1），回收的DNA片段經(jīng)測序后，共獲得1 485 個(gè)堿基，將該序列通過NCBI中BLAST進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)該菌與面包乳桿菌Lactobacillus panis strain C17（基因登錄號：EF412978.1）同源性高達(dá)99%，因此可以把該菌鑒定為面包乳桿菌。

2.2 細(xì)菌素的分離純化

表2 細(xì)菌素的分離純化Table 2 Summary of purifi cation steps of the bacteriocin

圖2 細(xì)菌素的SP Sepharose Fast Flow陽離子交換層析圖譜Fig. 2 Ion-exchange chromatography of the bacteriocin on SP Sepharose fast fl ow column

由于大多數(shù)乳酸菌細(xì)菌素帶正電并且在酸性條件下穩(wěn)定，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過乙酸乙酯粗提的細(xì)菌素由SP Sepharose Fast Flow陽離子交換樹脂分離后得到3個(gè)洗脫峰（圖2），S2和S3兩個(gè)洗脫峰相連，分離度很差，對金黃色葡萄球菌的抑制能力很差，故本實(shí)驗(yàn)不對此洗脫條件進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。而S1洗脫峰較窄且高、分離度較好，能與其他雜質(zhì)蛋白分開。并且S1洗脫峰對金黃色葡萄球菌的抑菌活性最好，故選擇S1洗脫峰做下一步的純化工作。經(jīng)過乙酸乙酯萃取和陽離子交換樹脂分離純化后，細(xì)菌素的比活力達(dá)到3 515.03 AU/mg，純化倍數(shù)為55.6倍，回收率為3.19%（表2）。由于該細(xì)菌素可以被陽離子交換樹脂吸附，說明該細(xì)菌素是一種帶正電的多肽[25]。

圖3 lactocin C--MM2的半制備高效液相色譜圖Fig. 3 Semi-preparative HPLC chromatrogram of the bacteriocin

反相高效液相色譜是根據(jù)分子疏水性的不同來達(dá)到分離抗菌肽的目的，具有靈敏度高、速度快、分辨率好，并且經(jīng)反相高效液相色譜分離得到的樣品可以直接進(jìn)行質(zhì)譜分析[26]。本實(shí)驗(yàn)將經(jīng)過陽離子純化后獲得的活性峰S1合并后用節(jié)流分子質(zhì)量為500 D透析袋透析除鹽、真空濃縮后通過半制備液相進(jìn)行分離純化后得到4 個(gè)洗脫峰（圖3），將4個(gè)洗脫峰合并、凍干后測定其活性，結(jié)果顯示H2洗脫峰對金黃色葡萄球菌的抑菌活性最好。經(jīng)過分析液相分析H2，在9.5 min左右出現(xiàn)一個(gè)單峰（圖4），在其他時(shí)間沒有出現(xiàn)明顯的吸收峰，表明該樣品已為色譜純，并將該細(xì)菌素命名為lacocin C-M2。經(jīng)過半制備液相純化后的細(xì)菌素比活力達(dá)到5 044.96 AU/mg，純化倍數(shù)為79.8 倍。

圖4 lactocin C--MM2的反相高效液相色譜圖Fig. 4 Analytical RP-HPLC chromatogram of the bacteriocin

在純化的過程中發(fā)現(xiàn)，最終該細(xì)菌素的回收率非常低，僅有0.35%，回收率低主要的原因是該細(xì)菌素的提取采用有機(jī)溶劑乙酸乙酯萃取的方法，由于乙酸乙酯的極性較正丁醇小，采用該方法致使一部分細(xì)菌素殘留在發(fā)酵的上清液中導(dǎo)致提取率大幅降低，雖可以通過重復(fù)提取實(shí)驗(yàn)提高回收率，但前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著提取重復(fù)次數(shù)的增加，提取效率也在逐漸降低，為了降低工作量和實(shí)驗(yàn)成本，本實(shí)驗(yàn)只提取了4 次，導(dǎo)致回收率降低。又由于乙酸乙酯較正丁醇更容易從細(xì)菌素的混合液中除去且獲得細(xì)菌素純度較高，故本實(shí)驗(yàn)采用乙酸乙酯萃取該細(xì)菌素。另外一個(gè)原因是通過陽離子交換樹脂純化，陽離子樹脂具有高度的選擇性，而細(xì)菌素在不同的pH值緩沖液中可能帶正電荷或負(fù)電荷以及所帶電荷的數(shù)量不同，并且現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的可以產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌，一般可以產(chǎn)生多種細(xì)菌素，不同的細(xì)菌素在同一pH值條件下所帶電荷不同，而在實(shí)驗(yàn)過程中只會針對其中的一種細(xì)菌素進(jìn)行分離純化，導(dǎo)致部分細(xì)菌素不能吸附在陽離子柱上，除此之外，離子交換柱在純化的過程中還可以除去很大一部分不帶電的雜蛋白，進(jìn)而使回收率很低。后期可以通過優(yōu)化面包乳桿菌C-M2產(chǎn)細(xì)菌素的發(fā)酵條件和純化過程（比如找更合適提取該細(xì)菌素的有機(jī)溶劑）來提高該細(xì)菌素最終的回收率。除此之外，來源于半制備液相分離的組分H3也可以抑制金黃色葡萄球菌的生長，說明面包乳桿菌C-M2可以產(chǎn)生多種細(xì)菌素，這大大地增加了其開發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。相類似的結(jié)果也出現(xiàn)在其他產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌中，例如Izquierdo等[27]從軟奶酪中分離的Enterococcus faecium WHE81、Yi Lanhua等[28]從江水白菜中分離的Lactobacillus coryniformis XN8都可以產(chǎn)生至少兩種細(xì)菌素。

2.3 質(zhì)譜分析

經(jīng)過高效液相色譜檢測后具有抑菌活性的細(xì)菌素樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析，得到一級質(zhì)譜圖（未列出），顯示該細(xì)菌素的分子質(zhì)量為863.52 D。對863.52 D的峰進(jìn)行高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，得到二級質(zhì)譜圖（圖4）。通過Peaks 7.0軟件對該細(xì)菌素的二級質(zhì)譜片段進(jìn)行分析得出該細(xì)菌素的氨基酸序列為MVKKTSAV。序列的推斷過程見表3。將該細(xì)菌素的氨基酸序列在NCBI（National Center for Biotechnology Information）進(jìn)行比對，未找到與該細(xì)菌素完全一樣的序列，說明該細(xì)菌素是一種新型的細(xì)菌素。

圖5 細(xì)菌素的二級質(zhì)譜圖Fig. 5 Tandem mass spectrum of the bacteriocin

表3 細(xì)菌素氨基酸序列的推斷Table 3 Predicted b-ion and y-ion fragments and sequence of the bacteriioocciinn

2.4 lactocin C-M2的抑菌譜

由表4可知，lactocin C-M2和大多數(shù)的乳酸菌細(xì)菌素具有相類似的特性，對與它們親緣關(guān)系較近的乳酸菌具有抑制作用[29]，例如戊糖片球菌、植物乳桿菌、短乳桿菌、瑞士乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌。同時(shí)lactocin C-M2還可以抑制常見的致病菌和腐敗菌，如金黃色葡萄球菌、志賀菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、單核細(xì)胞性李斯特菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和沙門菌,可廣泛應(yīng)用于食品的防腐殺菌處理。尤其lactocin C-M2可以抑制單核細(xì)胞性李斯特菌的生長，說明lactocin C-M2具有Ⅱ類細(xì)菌素的特性。但是lactocin C-M2對供試的酵母菌和霉菌沒有抑制作用。

表4 細(xì)菌素的抑菌譜Table 4 Antimicrobial spectrum of the bacteriocin

2.5 lactocin C-M2對溫度、pH值、蛋白酶敏感性

表5 細(xì)菌素對溫度、pH值、酶的敏感性Table 5 Effects of heat, pH and enzymes on antibacterial activity of the bacteriocin

由表5可知，lactocin C-M2經(jīng)過各種蛋白酶處理后抑菌活性完全消失，但是該細(xì)菌素經(jīng)脂肪酶和淀粉酶處理后抑菌活性基本保持不變，說明lactocin C-M2是蛋白類抑菌物質(zhì)，并且可以被蛋白酶降解而不會在體內(nèi)殘留，可以安全地應(yīng)用到食品的防腐方面。

lactocin C-M2在酸性條件下（pH 2～6）抑菌活性比較穩(wěn)定，在pH 6的條件下，該細(xì)菌素仍保留85.6%的抑菌活性。但lactocin C-M2在堿性條件下抑菌活性喪失比較明顯，在pH 9的條件下，該細(xì)菌素只有初始抑菌活性的40%。結(jié)果顯示lactocin C-M2在酸性條件下抑菌活性升高，而在堿性條件下抑菌活性降低。這可能是有由于在極端pH值條件下，在強(qiáng)的分子內(nèi)靜電相互作用下誘導(dǎo)氨基和羧基基團(tuán)的解離，終導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，從而使該細(xì)菌素的活性降低[30]。

lactocin C-M2在37、60、80、100 ℃條件下處理30 min后，抑菌活性保持在90%以上。即使在121 ℃滅菌15 min后，抑菌活性仍保留82.1%。說明細(xì)菌素lactocinC-M2具有良好的熱穩(wěn)定性。由于延長食品保質(zhì)期通常會采取加熱或者創(chuàng)造酸性、堿性環(huán)境的方法，以達(dá)到殺死或抑制腐敗微生物，而細(xì)菌素lactocin C-M2具有良好的穩(wěn)定性和耐酸堿性，該優(yōu)勢使得它在食品加工和食品的生物保鮮中均具有廣泛的應(yīng)用前景。由于lactocin C-M2具有小分子質(zhì)量、熱穩(wěn)定、不含羊毛硫氨酸、可以抑制單核細(xì)胞性李斯特菌的生長等特點(diǎn)，因此lactocin C-M2屬于Ⅱ類細(xì)菌素。

3 討 論

目前，16S rDNA序列是編碼核糖體RNA小亞基16S rRNA的基因，是當(dāng)今細(xì)菌分類學(xué)中最常用且有效的分子分析方法。本實(shí)驗(yàn)中利用16S rDNA基因序列對從發(fā)酵玉米粉分離出來的一株產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌C-M2進(jìn)行鑒定，最終鑒定該菌為面包乳桿菌。根據(jù)目前報(bào)道，盡管已經(jīng)成功的從各種材料中分離出很多面包乳桿菌，其功能也各式各樣，例如Grahame[31]發(fā)現(xiàn)Lactobacillus panis PM1可以產(chǎn)1,3-丙二醇，但是這是第一次發(fā)現(xiàn)可以產(chǎn)細(xì)菌素的面包乳桿菌。

細(xì)菌素的分離純化與其特性研究密切相關(guān)。乳酸菌細(xì)菌素一般均帶有正電荷、疏水特性等特點(diǎn)。細(xì)菌素的初步分離方法可以采取鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法和pH值吸附法等，進(jìn)一步純化方法有凝膠過濾層析、離子交換層析、疏水相互作用層析，精度純化一般采用反相高效液相色譜。本實(shí)驗(yàn)采取乙酸乙酯萃取、陽離子交換層析和制備液相三步法成功的從菌株C-M2上清液中分理處細(xì)菌素lactocin C-M2，與張瑜[32]所分離細(xì)菌素的純化過程類似，同時(shí)也說明本實(shí)驗(yàn)分離的出細(xì)菌素是小分子質(zhì)量的細(xì)菌素。但細(xì)菌素最終純化倍數(shù)為79.8 倍，回收率為0.35%，說明純化過程中目的蛋白損失較大。今后應(yīng)繼續(xù)對該細(xì)菌素的分離純化條件進(jìn)行優(yōu)化，為將來的精細(xì)純化及應(yīng)用提供理論支持。將lactocin C-M2序列提交到APD數(shù)據(jù)庫（Antimicrobial Peptide Database）進(jìn)行比對，只找到與其相識度為38.46%和37.5%的抗菌肽Uperin 7.1和Fusaricidin A，說明該細(xì)菌素是一種新型抗菌肽。

由于食品加工過程中對采用熱加工，所以細(xì)菌素對熱的穩(wěn)定性好壞是衡量其潛在應(yīng)用價(jià)值的標(biāo)準(zhǔn)。lactocin C-M2具有良好的熱穩(wěn)性，即使在121 ℃滅菌15 min后，抑菌活性仍保留82.1%，其熱穩(wěn)定性優(yōu)于pentocin LPEM818[8]。不同的細(xì)菌素適用的pH值范圍不同，大多數(shù)在酸性環(huán)境下抑菌活性較好。但在中性或堿性條件下，抑菌活性減弱或喪失。如nisin在低pH值條件下有很強(qiáng)的抑菌活性，但在pH 7以上時(shí)，活性喪失。而lactocin C-M2在pH 9的條件下仍保留40.34%的抑菌活性，但該細(xì)菌素耐酸堿性不及步氏乳桿菌KLDS1.0364[33]所產(chǎn)的細(xì)菌素。同時(shí)與步氏乳桿菌KLDS1.0364所產(chǎn)的細(xì)菌素一樣，lactocin C-M2對供試的蛋白酶敏感，對非蛋白酶不敏感，說明其產(chǎn)生的類細(xì)菌素是蛋白類物質(zhì)，具有較高的安全性。該細(xì)菌素對供試的大部分G+菌株和G-菌株均具有較強(qiáng)抑制作用，對多數(shù)致病菌和食品腐敗菌抑菌作用明顯，特別是對Listeria mouocytogeues和G-菌株較強(qiáng)的抑制作用，所以其具有作為食品生物防腐劑的潛在應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié) 論

面包乳桿菌C-M2分離于發(fā)酵玉米粉，其產(chǎn)生的細(xì)菌素（命名為lactocin C-M2）經(jīng)過乙酸乙酯萃取、陽離子交換層析和半制備液相三步成功的從菌株培養(yǎng)液中提取和純化出該菌所產(chǎn)的細(xì)菌素，最終該細(xì)菌素的比活力達(dá)到5 044.96 AU/mg，純化倍數(shù)為79.8 倍，回收率為0.35%。該細(xì)菌素的分子質(zhì)量為863.52 D，氨基酸序列為MVKKTSAV，并且是一種新的Ⅱ類細(xì)菌素。該細(xì)菌素具有廣泛的抑菌譜，它不僅可以抑制與它親緣關(guān)系較近的乳酸菌的生長，同時(shí)它還可以抑制革蘭氏陽性和陰性的致病菌。該細(xì)菌素對熱、pH值、淀粉酶和脂肪酶具有良好的穩(wěn)定性，但對多種蛋白酶敏感。綜上，面包乳桿菌C-M2所產(chǎn)的細(xì)菌素在食品保鮮和生物防腐具有良好的應(yīng)用前景。

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Purifi cation and Characterization of the Bacteriocin Produced by Lactobacillus panis C-M2

SHAN Chengjun1,2, HU Yanxin1,2, XIA Xiudong2, LIU Xiaoli2, LI Ying2, WANG Ying2, ZHANG Jianhao1, ZHOU Jianzhong1,2,*
(1. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;2. Research Institute of Agricultural Product Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China)

The present study aimed to purify and characterize a novel bacteriocin produced by Lactobacil lus panis C-M2.The bacteriocin was purified through sequential ethyl acetate extraction, cation exchange chromatography and semipreparative high-performance liquid ch romatography (RP-HPLC). Finally, the specifi c activity reached 5 044.96 AU/mg and the purifi cation fold was 79.8, but the recovery was only 0.35%. The bacteriocin had a molecular mass of 863.52 D and its N-terminal sequence was MVKKTSAV as determined by LC-MS/MS, showing low similarity with other class II bacteriocins reported earlier. It showed a good stability to heat and pH and retained 82.1% of the original antibacterial activity even after exposure to 121 ℃ for 15 min and retained 85.6% of the original activity at pH 6. The bacteriocin could be totally inactivat e d after treatment with protease, but it was not sensitive to lipase or amylase. These results indicate the potential of the bacteriocin for application in food preservation.

Lactobacillus panis; bacteriocin; purifi cation; antimicrobial activity

10.7506/spkx1002-6630-201720004

R996.1

A

1002-6630（2017）20-0020-07

單成俊, 胡彥新, 夏秀東, 等. 面包乳桿菌(Lactobacillus panis) C-M2細(xì)菌素的分離純化及特性分析[J]. 食品科學(xué), 2017,38(20): 20-26. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201720004. http://www.spkx.net.cn

SHAN Chengjun, HU Yanxin, XIA Xiudong, et al. Purification and characterization of the bacteriocin produced by Lactobacillus panis C-M2[J]. Food Science, 2017, 38(20)∶ 20-26. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720004. http∶//www.spkx.net.cn

2016-11-14

江蘇省水產(chǎn)三新工程項(xiàng)目（Y2015-29）

單成?。?978—），男，博士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：chengjun_shan@163.com

*通信作者：周劍忠（1965—），男，研究員，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：zjzluck@126.com