響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超聲法提取橄欖果實(shí)游離氨基酸工藝

彭真汾，謝 倩，池毓斌，陳清西*

響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超聲法提取橄欖果實(shí)游離氨基酸工藝

彭真汾，謝 倩，池毓斌，陳清西*

（福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002）

為獲得橄欖果實(shí)游離氨基酸的最佳提取工藝，以橄欖果實(shí)為實(shí)驗(yàn)材料，通過單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超聲法提取橄欖果實(shí)游離氨基酸的最佳工藝。結(jié)果表明：各因素對(duì)游離氨基酸提取量的影響力由高到低為料液比＞提取次數(shù)＞超聲時(shí)間＞超聲功率＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞超聲溫度；響應(yīng)面法得出的最佳提取工藝為超聲時(shí)間20 min、料液比1∶41（g/mL）、提取次數(shù)3、超聲溫度50 ℃、超聲功率270 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，游離氨基酸的提取量實(shí)際值為79.88 mg/g，與預(yù)測值相對(duì)誤差為2.62%，表明此優(yōu)化工藝具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

橄欖；游離氨基酸；超聲法；響應(yīng)面法；Plackett-Burman設(shè)計(jì)；Box-Behnken設(shè)計(jì)

氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，是人體正常代謝和生理活動(dòng)的重要成分，具有抗菌[1]、保肝保腎[2]、降血脂[3]等作用。氨基酸可分為水解氨基酸和游離氨基酸，其中水解氨基酸以結(jié)合態(tài)形式存在于肽和蛋白質(zhì)中，主要體現(xiàn)物質(zhì)的營養(yǎng)狀況[4-5]；游離氨基酸以游離態(tài)存在，不僅可通過呈味氨基酸反映食物口感和風(fēng)味，以藥用氨基酸反映藥用價(jià)值[4,6-7]，并通過參與美拉德反應(yīng)、使酚類物質(zhì)發(fā)生褐變等直接影響食物的感官品質(zhì)[8-9]；且提取游離氨基酸獲得的天然氨基酸可作為某些食品呈味添加劑，豐富食物口感[10]。

橄欖（Canarium album（Lour.）Raeusch.），為橄欖科（Burseraceae）橄欖屬（Canarium）植物，又名青果、青欖、白欖，屬熱帶、亞熱帶果樹[11]，是福建省的名特優(yōu)水果，果實(shí)營養(yǎng)價(jià)值高，富含VC和鈣[12-13]，具有生津止渴[11]、解酒保肝[14]等藥用功效。橄欖氨基酸種類豐富，含量較高[15]，接近世界糧農(nóng)組織和衛(wèi)生組織建議的理性參考模式值（40%和60%）[16]，表明橄欖氨基酸具有較高的營養(yǎng)價(jià)值。且氨基酸含量、種類和比例是評(píng)價(jià)橄欖營養(yǎng)價(jià)值優(yōu)劣的主要指標(biāo)之一，對(duì)橄欖營養(yǎng)品質(zhì)和風(fēng)味均有重要貢獻(xiàn)[17]。目前，在橄欖氨基酸上的研究多集中于水解氨基酸[12,18-20]，對(duì)游離氨基酸研究仍鮮見報(bào)道。

目前，國內(nèi)外提取植物游離氨基酸主要采用加熱回流法[21]、超臨界流體萃取法[22]、超聲波提取法[23]、微波提取法[24]等。超聲波提取是一種物理方法，通過超聲過程中產(chǎn)生的空化作用和熱效應(yīng)，使植物細(xì)胞壁破裂，有效成分溶出，達(dá)到在較短的提取時(shí)間內(nèi)，提高提取效率的作用[25-26]，較其他方法有時(shí)間短、無需加熱、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)[27]。因此，本實(shí)驗(yàn)利用超聲法對(duì)橄欖果實(shí)游離氨基酸進(jìn)行提取，并通過單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman試驗(yàn)及最陡爬坡試驗(yàn)與響應(yīng)面法相結(jié)合，尋找超聲法提取橄欖果實(shí)游離氨基酸的最佳工藝，為進(jìn)一步研究橄欖果實(shí)游離氨基酸提供理論依據(jù)和實(shí)際指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘長營’橄欖果實(shí)于2015年11月17日采自福建省閩侯縣城關(guān)農(nóng)場；亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、十二水合磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4·H2O）、茚三酮（苯駢戊三酮）、無水乙醇均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LGJ-25C型冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；FW177型中草藥粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；Allegra 64R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 貝克曼庫爾特（美國）有限公司；DK-S22型電熱恒溫水浴鍋上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；WinLab V6型紫外-可見分光光度計(jì) 鉑金埃爾默儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 橄欖果實(shí)粉末的制備

將新鮮采下的橄欖置于4 ℃保溫箱中帶回實(shí)驗(yàn)室，立即用雙蒸水洗凈、晾干、取果肉，凍干并粉碎至過40目篩后保存于-40 ℃冰箱中備用。

1.3.2 橄欖果實(shí)游離氨基酸溶液的制備

參照朱玉婷[28]的方法稍作改進(jìn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

準(zhǔn)確稱取橄欖果實(shí)粉末0.5 g于50 mL離心管中，按料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 （g/mL））加入一定體積分?jǐn)?shù)（30%、40%、50%、60%、70%）乙醇溶液，在一定超聲功率（180、210、240、270、300 W）、超聲溫度（30、40、50、60、70 ℃）、超聲時(shí)間（10、15、20、25、30 min）提?。?、2、3、4次），之后常溫10 000 r/min離心10 min，吸取一定量上清液（視具體情況而定）于20 mL具塞試管中，用蒸餾水稀釋至刻度，作為橄欖果實(shí)游離氨基酸溶液。

1.3.3 亮氨酸溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。配制0.2 mg/mL亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別吸取0.2 mg/mL亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25、2.5、2.75、3.0、3.25 mL和3.5 mL，并用蒸餾水分別補(bǔ)足至4.0 mL。吸取上述各溶液2.0 mL于20 mL具塞試管中，加入pH 6.6磷酸緩沖液0.5 mL和2 g/mL茚三酮溶液0.5 mL，搖勻，于100 ℃恒溫水浴鍋中加熱25 min，冷卻，蒸餾水定容至刻度，在568 nm波長下測定吸光度。以亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得回歸方程為：y=10.482x-0.494 7，R2=0.999 6。表明亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液在0.05～0.175 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.3.4 橄欖果實(shí)游離氨基酸提取量的測定

吸取1.3.2節(jié)制備的橄欖果實(shí)游離氨基酸溶液2.0 mL代替1.3.3節(jié)中亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，并以2.0 mL蒸餾水作為空白對(duì)照，按1.3.3節(jié)的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測定吸光度。游離氨基酸提取量的計(jì)算公式如下：

式中：c為游離氨基酸質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為提取液總體積/mL；n為稀釋倍數(shù)；m為橄欖粉末質(zhì)量/g。

1.3.5 超聲法提取橄欖果實(shí)游離氨基酸單因素試驗(yàn)

按1.3.2節(jié)制備橄欖果實(shí)游離氨基酸溶液，后按1.3.4節(jié)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每次只改變一個(gè)因素，且考察完一個(gè)因素，將其最佳條件作為下一個(gè)因素的固定條件，直至完成全部單因素試驗(yàn)，試驗(yàn)均重復(fù)3 次。

1.3.6 Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)設(shè)計(jì)

PB試驗(yàn)?zāi)茉谳^少的試驗(yàn)次數(shù)下，從多因素試驗(yàn)中篩選出顯著的影響因素[29-32]。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用6 個(gè)因素和5 個(gè)虛擬因素進(jìn)行n為12的PB設(shè)計(jì)，以游離氨基酸提取量為響應(yīng)值，每個(gè)因素取高低2 個(gè)水平，高水平倍數(shù)不超過低水平2 倍，且因素之間間隔分布，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 PB試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels used in Plackett-Burman design

1.3.7 最陡爬坡試驗(yàn)

最陡爬坡試驗(yàn)是在PB試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)篩選得出的顯著因子進(jìn)行合理設(shè)計(jì)，從而獲得最佳工藝區(qū)域的方法，并將此結(jié)果作為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)展開試驗(yàn)[33]。主要憑借PB試驗(yàn)中顯著因素的正負(fù)效應(yīng)進(jìn)行設(shè)計(jì)合理步長和爬坡方向來達(dá)到試驗(yàn)?zāi)康?，其他因素的取值結(jié)合單因素試驗(yàn)和PB試驗(yàn)各因素的正負(fù)效應(yīng)來確定。

1.3.8 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在PB試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇超聲時(shí)間（C）、料液比（D）、提取次數(shù)（F）3 個(gè)因素作為響應(yīng)面試驗(yàn)的因素，其余因素條件固定為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲溫度50 ℃、超聲功率270 W。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2所示。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平Table 2 Levels and codes of independent variables used for Box-Behnken dessiiggnn

1.4 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗(yàn)圖表的繪制采用Excel 2003完成，顯著性分析采用SPSS 17.0完成；PB試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析采用Design-Expert 8.05b完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲溫度對(duì)游離氨基酸提取量的影響

按料液比1∶30（g/mL）加入體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液，在超聲功率180 W時(shí)超聲20 min，提取1 次，由圖1可知，隨著超聲溫度的升高，游離氨基酸提取量先上升后下降，50 ℃時(shí)到達(dá)提取量最大值50.25 mg/g，且50 ℃與60 ℃之間達(dá)到顯著性差異（P＜0.05），60、70 ℃時(shí)已降到低值且基本穩(wěn)定。這可能是由于隨著超聲溫度的增加，原本小分子游離氨基酸的溶出量會(huì)增加，但同時(shí)也會(huì)增加非游離氨基酸物質(zhì)的溶出如水溶性色素，使提取液的顏色加深[34]，另外超聲溫度對(duì)超聲提取的空化效應(yīng)具有一定影響，當(dāng)溫度過高時(shí)會(huì)減少空化效應(yīng)產(chǎn)生的高壓反而會(huì)弱化空化效應(yīng)[35]，進(jìn)而影響提取量。因此，超聲溫度應(yīng)選擇50 ℃。

圖1 超聲溫度對(duì)游離氨基酸提取量的影響Fig. 1 Effect of temperatures on the extraction yield of free amino acids

2.1.2 超聲功率對(duì)游離氨基酸提取量的影響

圖2 超聲功率對(duì)游離氨基酸提取量的影響Fig. 2 Effect of ultrasonic power on the extraction yield of free amino acids

按料液比1∶30（g/mL）加入體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液，在超聲溫度50 ℃時(shí)超聲20 min提取1 次，由圖2可知，隨著超聲功率的增加，游離氨基酸提取量不斷增加，在270 W時(shí)達(dá)到最大值50.84 mg/g，繼續(xù)加大超聲功率至300 W，提取量下降且與270 W時(shí)達(dá)到顯著差異（P＜0.05），這可能是由于隨著超聲功率的增加，使超聲處理的熱效應(yīng)和空化作用增強(qiáng)，有利于粉末中游離氨基酸溶出，但繼續(xù)增大超聲功率至300 W，有利于提高提取液的流速，造成粉末在超聲場中停留時(shí)間減少，導(dǎo)致破壁作用的減弱[36]，另外超聲功率增大至空化效應(yīng)飽和后，繼續(xù)增大只會(huì)加強(qiáng)超聲波的散射和衰減，不利空化[35]，造成提取量下降，因此，選擇超聲功率為270 W。

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)游離氨基酸提取量的影響

按料液比1∶30（g/mL）加入體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液，固定超聲溫度50 ℃、超聲功率270 W、超聲提取1 次，由圖3可知，隨著超聲時(shí)間的延長，游離氨基酸的提取量先升高后稍微下降，在20 min時(shí)達(dá)到最大值，且20 min與15 min之間達(dá)到顯著差異（P＜0.05），而20 min與25 min差異不顯著（P＞0.05），表明超聲時(shí)間20 min時(shí)，橄欖粉末中的游離氨基酸已基本被提取出來，再繼續(xù)效果不明顯，且20 min與30 min時(shí)達(dá)到顯著差異（P＜0.05），表明繼續(xù)超聲，游離氨基酸的提取量反而顯著下降，可能是由于超聲時(shí)間的延長，原本被提取出來的游離氨基酸，特別是芳香族氨基酸，被空化效應(yīng)產(chǎn)生的自由基所氧化[37]，從而影響提取效果，因此，超聲時(shí)間應(yīng)選擇20 min為宜。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)游離氨基酸提取量的影響Fig. 3 Effect of ultrasonic irradiation time on the extraction yield of free amino acids

2.1.4 料液比對(duì)游離氨基酸提取量的影響

圖4 料液比對(duì)游離氨基酸提取量的影響Fig. 4 Effect of liquid/solid ratio on the extraction yield of free amino acids

用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液提取橄欖粉末，固定超聲溫度50 ℃、超聲功率270 W、超聲20 min、提取1 次，由圖4可知，游離氨基酸提取量隨著溶劑用量的增加而增大，在1∶40（g/mL）時(shí)達(dá)到最大值，但料液比1∶30、1∶40和1∶50之間提取量沒有顯著差異（P＞0.05）。這可能是由于溶劑用量小時(shí)，溶液不足以完全提取粉末中的游離氨基酸，導(dǎo)致提取率低下，繼續(xù)增加溶劑用量，有利于游離氨基酸的充分提取，增大提取量，但當(dāng)游離氨基酸已被基本提取完全時(shí)，再增加溶劑用量，對(duì)提取量的影響小，且易造成成本的增加，結(jié)合經(jīng)濟(jì)角度的考慮，選擇料液比1∶30（g/mL）。

2.1.5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)游離氨基酸提取量的影響

固定料液比1∶30（g/mL）、超聲溫度50 ℃、超聲功率270 W、超聲20 min、提取1 次，由圖5可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，提取量逐漸增大，到60%時(shí)達(dá)到最大值62.24 mg/g，隨后降低，且與70%之間達(dá)到顯著差異（P＜0.05）。一方面可能是由于溶劑與物質(zhì)的相似相溶原理，乙醇體積分?jǐn)?shù)與游離氨基酸的極性越接近，越有利于其溶出[38]；另一方面可能是改變乙醇體積分?jǐn)?shù)的同時(shí)，其他醇溶性的物質(zhì)也被隨即溶出，從而導(dǎo)致了提取量降低，綜合考慮，選擇體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)游離氨基酸提取量的影響Fig. 5 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of free amino acids

2.1.6 提取次數(shù)對(duì)游離氨基酸提取量的影響

圖6 提取次數(shù)對(duì)游離氨基酸提取量的影響Fig. 6 Effect of number of extraction cycles on the extraction yield of free amino acids

按料液比1∶30（g/mL）加入體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液，超聲溫度50 ℃、超聲功率270 W、超聲20 min，由圖6可知，隨著提取次數(shù)的增加，游離氨基酸的提取量不斷增大，在提取3 次時(shí)基本達(dá)到穩(wěn)定，提取3 次與4 次無顯著性差異（P＞0.05）。這是由于提取1、2 次時(shí)，還未將粉末中的游離氨基酸提取完全，提取3 次已基本將粉末中的游離氨基酸提取完全，再增加提取次數(shù)對(duì)增加游離氨基酸含量影響小，且造成成本的提高和工時(shí)的拖長，因此，選擇提取3 次最佳。

2.2 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

利用Design-Expert 8.05b進(jìn)行PB試驗(yàn)的設(shè)計(jì)以及結(jié)果的分析，PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表3所示。從表4可知，PB試驗(yàn)的模型P值為0.003 4，小于0.01，達(dá)到極顯著水平，表明模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從各個(gè)因素的P值可知，各因素對(duì)游離氨基酸提取量的影響水平為料液比＞提取次數(shù)＞超聲時(shí)間＞超聲功率＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞超聲溫度，其中料液比和提取次數(shù)達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），且從參數(shù)估計(jì)值可知此2 個(gè)因素對(duì)提取量呈正效應(yīng)影響，其他因素均不顯著（P＞0.05）并均為負(fù)效應(yīng)影響，但考慮若選擇中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，則需對(duì)提取次數(shù)進(jìn)行1.414倍水平處理[39]，不符合實(shí)際操作的可行性；選擇Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)至少需要3 個(gè)因素[29]，因此，結(jié)合各因素影響水平的排名情況選擇料液比、提取次數(shù)和超聲時(shí)間3 個(gè)因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)。

表3 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Plackett-Burman design with experimental results

表4 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)效應(yīng)分析Table 4 Statistical analysis of Plackett-Burman design

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 5 Experimental design and results of steepest ascent path

由PB試驗(yàn)可知，料液比和提取次數(shù)為正效應(yīng)，超聲時(shí)間為負(fù)效應(yīng)，則適當(dāng)?shù)奶岣吡弦罕群吞崛〈螖?shù)，減小超聲時(shí)間有利于提高提取率，但考慮到隨著提取次數(shù)的增加，游離氨基酸提取量也將增加，其提取量的顯著增加易掩蓋其他因素對(duì)提取量造成的影響，因此固定提取次數(shù)為1次，另外2個(gè)因素由其正負(fù)效應(yīng)，確定爬坡方向和合理的步長，同時(shí)改變因素水平，達(dá)到快速逼近最佳區(qū)域的目的。由表5可知最佳的組合為試驗(yàn)組2，因此以試驗(yàn)組2條件為Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心值。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及方差分析

表6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Box-Behnken design with experimental results

表7 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析Table 7 Analysis of variance of response surface regression model

在PB試驗(yàn)與最陡爬坡試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 8.05b軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并得到結(jié)果如表6所示，同時(shí)進(jìn)行方差分析如表7所示。對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到回歸方程：游離氨基酸提取量/（mg/g）=77.02-0.59C+2.10D+3.85F-1.00CD+0.88CF+0.057DF-7.56C2-6.21D2-5.86F2。從表7可知，模型P值小于0.000 1，達(dá)到極顯著（P＜0.01）水平，失擬項(xiàng)P為0.666 0，大于0.05，不顯著，表明模型對(duì)本試驗(yàn)的擬合度良好，R2=0.977 5，表明模型擬合度良好，R2Adj=0.948 5，表明該模型能解釋94.85%響應(yīng)值的變化，則用該模型能代替真實(shí)試驗(yàn)點(diǎn)對(duì)超聲法提取橄欖果實(shí)游離氨基酸提取量的分析和預(yù)測。從表7中各因素的P值可知，回歸模型中D、F、C2、D2和F2極顯著（P＜0.01），而一次項(xiàng)C、交互項(xiàng)CD、CF、DF均不顯著（P＞0.05），表明各因素對(duì)游離氨基酸提取量的影響不同，調(diào)整不同因素將達(dá)到不同提取效果。

2.4.2 響應(yīng)面分析

圖7 各因素交互作用對(duì)游離氨基酸提取量影響的響應(yīng)面與等高線圖Fig. 7 Contour plots and response surface showing the interactive effects of various factors on the extraction yield of free amino acids

通過Design-Expert 8.05b軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到了各因素交互作用對(duì)游離氨基酸提取量影響的等高線圖和響應(yīng)面圖，可以更加直觀看出各因素之間交互作用的影響。從圖7可以看出，兩兩因素交互作用的響應(yīng)面圖都較平緩，等高線圖的橢圓形狀都較明顯，表明各因素之間交互作用不顯著[40-42]，與上述顯著性結(jié)果一致；圖7顯示隨著超聲時(shí)間、料液比和提取次數(shù)水平的增加，游離氨基酸提取量表現(xiàn)出先增加后下降的趨勢，均能找到其最佳值。

2.4.3 最佳工藝的確定與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過Design-Expert 8.05b軟件分析得出超聲法提取橄欖果實(shí)游離氨基酸的最佳工藝條件：超聲時(shí)間19.84 min、料液比1∶40.87（g/mL）、提取次數(shù)3.33、超聲溫度50 ℃、超聲功率270 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%。在此條件下，預(yù)測的游離氨基酸提取量為77.84 mg/g?？紤]到實(shí)際操作的可能性，將條件定為超聲時(shí)間20 min、料液比1∶41（g/mL）、提取次數(shù)3、超聲溫度50 ℃、超聲功率270 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，平行實(shí)驗(yàn)3 次，得到的游離氨基酸提取量為79.88 mg/g，與預(yù)測值的相對(duì)誤差為2.62%，與中心點(diǎn)存在顯著性差異（P=0.037＜0.05），表明通過響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超聲法提取橄欖果實(shí)游離氨基酸的提取工藝是可行的，具有實(shí)際意義。

3 討論與結(jié)論

保存植物組織的方法有許多種，如超低溫保存[43]、低溫保存[44]、干燥保存[45]等。不同保存方法對(duì)植物體內(nèi)各物質(zhì)的含量和變化趨勢有一定的影響。王子飛等[46]通過比較不同保存方法對(duì)植物葉片色素降解的影響，發(fā)現(xiàn)短期保存中以液氮保存最佳，硅膠干燥法次之。何嘉琦等[47]探討不同保存方法對(duì)秋石斛葉片抗寒生理指標(biāo)的影響，發(fā)現(xiàn)不同指標(biāo)影響不同，其中脯氨酸在-20 ℃保存2 d時(shí)與鮮葉最為接近。楊琴等[48]通過4 種保存方法保存牡丹花瓣，發(fā)現(xiàn)通過干燥箱后密封避光保存對(duì)花瓣中的色素影響最小。本實(shí)驗(yàn)橄欖粉末的保存方法為干燥低溫保存，所測得的橄欖果實(shí)游離氨基酸含量可能與鮮樣或其他保存方法測定的含量存在一定差異。

采用超聲法提取植物中游離氨基酸，提取劑不同，提取量也存在一定的差異。Arnáiz等[22]采用超聲法比較水和體積分?jǐn)?shù)70%甲醇溶液2 種提取劑對(duì)花椰菜葉片中游離氨基酸提取效果的影響，表現(xiàn)出在個(gè)別氨基酸和氨基酸總量上存在差異。吳月娜[49]通過超聲法比較水、體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液和體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液作為提取劑對(duì)青天葵藥材游離氨基酸提取效果的影響，發(fā)現(xiàn)水作為提取劑，其游離氨基酸的浸出量大，但其純度相對(duì)低于75%乙醇溶液和50%乙醇溶液。馬戎等[50]等采用超聲法提取煙草中游離氨基酸后用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定出20 種游離氨基酸，通過比較體積分?jǐn)?shù)0.1%鹽酸和體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液提取劑的提取效果，發(fā)現(xiàn)除個(gè)別氨基酸外，鹽酸超聲提取的氨基酸含量高于乙醇、變異系數(shù)小于乙醇。綜上可知不同的提取劑對(duì)超聲法提取游離氨基酸含量的方法具有不同的效果，本實(shí)驗(yàn)以乙醇溶液作為提取劑，比較了體積分?jǐn)?shù)30%、40%、50%、60%和70%乙醇溶液的提取效果，發(fā)現(xiàn)60%乙醇溶液提取效果最佳，對(duì)橄欖果實(shí)游離氨基酸的提取進(jìn)行初步的探索，為后續(xù)研究橄欖果實(shí)游離氨基酸的提取提供一定的理論參考。

本實(shí)驗(yàn)采用超聲法提取橄欖果實(shí)中的游離氨基酸，考察各因素之間的相互作用對(duì)游離氨基酸提取量的影響，并憑借響 應(yīng)面方法得到最佳組合。首先通過單因素試驗(yàn)得出各因素的適宜范圍，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上確定PB試驗(yàn)因 素范圍，篩選出顯著（P＜0.05）影響因素為料液比和提取次數(shù)，得出各因素之間對(duì)游離氨基酸提取量影響主次順序?yàn)榱弦罕龋咎崛〈螖?shù)＞超聲時(shí)間＞超聲功率＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞超聲溫度，結(jié)合單因素試驗(yàn)和PB試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)來確定中心組，進(jìn)而進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，得出超聲法提取橄欖果實(shí)游離氨基酸的最優(yōu)組合為超聲時(shí)間20 min、料 液比1∶41（g/mL）、提取次數(shù)3、超聲溫度50 ℃、超聲功率270 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，游離氨基酸提 取量實(shí)際值為79.88 mg/g，與預(yù)測值相對(duì)誤差為2.62%，表明此模型能為今后橄欖果實(shí)游離氨基酸的提取提供一定的理論支持。

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Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction of Free Amino Acids from the Flesh of Canarium album Fruits by Response Surface Methodology

PENG Zhenfen, XIE Qian, CHI Yubin, CHEN Qingxi*
(College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)

This study aimed to obtain the optimum conditions for the extraction of free amino acids from the flesh of Canarium album fruits by the combined use of one-factor-at-a-time method, Plackett-Burman design, steepest ascent design and response surface methodology. The results showed that the effects of factors on the extraction yield of free amino acids were in the descending order of solid-to-liquid ratio ＞ number of extraction cycles ＞ ultrasonication time ＞ ultrasonic power ＞ethanol concentration ＞ temperature, and the optimum levels of these variables were determined to be 20 min, 1∶41 (g/mL),3, 50 ℃, 270 W and 60%, respectively. Under these conditions, the predicted extraction yield of free amino acids was 77.84 mg/g while the actual value was 79.88 mg/g. The relative error was 2.62%, indicating that the optimized extraction method was reliable.

Canarium album; free amino acids; ultrasonic-assisted extraction; response surface methodology; Plackett-Burman design; Box-Behnken design

S667.5

A

1002-6630（2017）20-0146-08

彭真汾, 謝倩, 池毓斌, 等. 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超聲法提取橄欖果實(shí)游離氨基酸工藝[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(20)∶ 146-153.DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720021. http∶//www.spkx.net.cn

PENG Zhenfen, XIE Qian, CHI Yubin, et al. Optimization of ultrasonic-assisted extraction of free amino acids from the fl esh of Canarium album fruits by response surface methodology[J]. Food Science, 2017, 38(20)∶ 146-153. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720021. http∶//www.spkx.net.cn

2016-12-29

“十一五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（20 07BAD07B01）；福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012D085）；

福州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2009-N-55）；福建省重大科技專項(xiàng)（2013NZ0002-4）

彭真汾（1992—），女，碩士研究生，主要從事果樹生理與生態(tài)研究。E-mail：390689340@qq.com

*通信作者：陳清西（1964—），男，教授，博士，主要從事園藝植物栽培與生理研究。E-mail：cqx0246@fafu.edu.cn

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720021