徐家淳,趙志恒,程素利,王雪,焦召華,蔡志敏,李婷,時(shí)旭平,周震,劉保紅,李巖

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué),天津 300193;2.天津市公安醫(yī)院,天津 300042;3.河北科技師范學(xué)院,秦皇島 066000;4.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,天津 300150)

火針對脊髓損傷大鼠神經(jīng)干細(xì)胞 Wnt/β-catenin通路基因表達(dá)的離體研究

徐家淳1,趙志恒1,程素利1,王雪1,焦召華2,蔡志敏3,李婷1,時(shí)旭平1,周震4,劉保紅2,李巖2

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué),天津 300193;2.天津市公安醫(yī)院,天津 300042;3.河北科技師范學(xué)院,秦皇島 066000;4.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,天津 300150)

目的 觀察火針對脊髓損傷Wnt/β-catenin通路上神經(jīng)干細(xì)胞Wnt、β-catenin基因的調(diào)控作用。方法 將60只SD雌性大鼠隨機(jī)分為空白組5只、假手術(shù)組5只、模型組25只、火針組25只,模型組和火針組大鼠又分為1 d組、3 d組、7 d組、10 d組和14 d組;采用改良的Allen's法對模型組和火針組造模,觀察各組BBB評分,Wnt3a和β-catenin基因表達(dá)變化。結(jié)果 在7 d、10 d時(shí)模型組和火針組BBB評分明顯高于同組前一時(shí)相,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);火針組大鼠在治療后各時(shí)間點(diǎn)BBB評分明顯高于模型組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在7 d、10 d時(shí)模型組和火針組Wnt3a基因表達(dá)量較同組前一時(shí)相均增加(P＜0.05);在7 d、10 d時(shí)火針組Wnt3a基因表達(dá)量高于模型組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);β-catenin基因表達(dá)水平變化趨勢與Wnt3a基本一致。結(jié)論 火針可調(diào)控脊髓損傷神經(jīng)干細(xì)胞Wnt3a、β-catenin基因表達(dá)。

針刺療法;火針;脊髓損傷;Wnt3a基因;β-catenin基因;大鼠

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是一種嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,可引起直接性機(jī)械損傷和繼發(fā)性損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng),往往導(dǎo)致永久性損傷[1]。SCI后星形膠質(zhì)細(xì)胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性增生阻礙了脊髓再生,因此 SCI后促進(jìn)神經(jīng)元再生是早期治療SCI的關(guān)鍵。而適當(dāng)誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)增殖并向神經(jīng)元分化是減輕 SCI病理性損傷、促進(jìn)其神經(jīng)再生與修復(fù)的一種潛在治療方法[2-3]。NSCs向神經(jīng)元的分化受多種因素影響和制約,并由多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路所介導(dǎo),其中 Wnt/β-catenin信號(hào)途徑是一條經(jīng)典的信號(hào)途徑。該信號(hào)途徑對NSCs的增殖和分化有著重要的作用,給目前 SCI的治療帶來了希望[4-5]。如果可刺激該信號(hào)在SCI后高表達(dá),促使NSCs向神經(jīng)元分化,對恢復(fù)脊髓功能意義重大。本研究擬建立 SCI大鼠模型,在離體狀態(tài)下觀察火針對不同時(shí)點(diǎn)SCI大鼠Wnt/β-catenin通路基因表達(dá)的影響,為揭示火針治療SCI的機(jī)理提供部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康SPF級(jí)孕14 d SD大鼠2只。2月齡雌性SD大鼠60只,體重260 g左右;由中國食品藥品檢定研究所提供[許可證號(hào) SCXK(京)2009-0017],采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為空白組5只、假手術(shù)組5只、模型組25只、火針組25只;模型組和火針組又分別分為1 d組、3 d組、7 d組、10 d組、14 d組各5只。

1.2 模型制備及行為學(xué)評分

采用本課題組改良的 Allen's法[6]對模型組和火針組大鼠建立 SCI模型,假手術(shù)組大鼠僅切除 T9、T10椎板,術(shù)后小心護(hù)理飼養(yǎng),每天擠壓排尿3次。造模前及各時(shí)間點(diǎn)對各組大鼠進(jìn)行BBB運(yùn)動(dòng)評分[7]。

1.3 干預(yù)方法

造模成功后即對火針組SCI大鼠采用速刺法進(jìn)行火針針刺,針刺T7,T8及T11,T12棘突間隙旁的華佗夾脊穴;之后每隔24 h治療1次。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 行為學(xué)評分

造模前及各時(shí)間點(diǎn)對各組大鼠進(jìn)行BBB評分[7]。

1.4.2 血清制備

空白組和假手術(shù)組大鼠在24 h后,模型組和火針組大鼠于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)(1 d,3 d,7 d,10 d,14 d)麻醉后于無菌條件下腹主動(dòng)脈采血,分離血清。56℃滅活30 min,220 nm濾膜濾過除菌,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定

無菌條件下取SD胎鼠,D-Hanks液充分漂洗后,在解剖顯微鏡下剝離皮膚、肌肉等組織,用眼科剪剪碎脊髓后,0.25%胰蛋白酶消化,吸管吹打,200目銅網(wǎng)過濾,離心,棄上清,再轉(zhuǎn)移到 DMEM/F12(1:1)加 B27和bFGF(20 ng/mL)的無血清培養(yǎng)基,以細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/mL接種入 24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng),每孔加入細(xì)胞懸液500 μL。置入37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。此后每3 d半量換液1次,每7 d機(jī)械分離克隆傳代1次,方法同前。傳代培養(yǎng)純化的細(xì)胞經(jīng)Nestin鑒定,顯示 Nestin免疫反應(yīng)陽性,表明所培養(yǎng)的細(xì)胞為神經(jīng)干細(xì)胞。

1.4.4 火針對神經(jīng)干細(xì)胞Wnt3a及β-catenin基因表達(dá)水平影響的檢測

離心收集傳代培養(yǎng) 3代的 NSCs,將細(xì)胞接種于 6孔培養(yǎng)板,接種密度為 2×105個(gè)/mL。將 NSCs按培養(yǎng)基中所含血清成分的不同共分空白組、假手術(shù)組、模型組及火針組,其中模型組和火針組根據(jù)時(shí)間點(diǎn)不同分為1 d組、3 d組、7 d組、10 d組、14 d組,共12種血清。各組培養(yǎng)基均為含10%濃度SD大鼠不同血清成分的 DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基(不含 B27、rhEGF和rhbFGF),每3孔為同一血清成分培養(yǎng)液。不同血清成分干預(yù)神經(jīng)干細(xì)胞后培養(yǎng)72 h,采用RT-PCR法檢測各組細(xì)胞中 Wnt通路中 Wnt3a及β-catenin目的基因mRNA表達(dá)量的變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,計(jì)量資料服從正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,不服從以[中位數(shù),(四分位間距)]表示,方差齊,兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠BBB評分比較

各時(shí)間點(diǎn)評分顯示模型組和火針組大鼠BBB評分逐漸升高,其中模型組在7 d、10 d和14 d時(shí)評分明顯高于前一時(shí)相,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);火針組在7 d和10 d時(shí)評分明顯高于前一時(shí)相,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而火針組大鼠在治療后各時(shí)間點(diǎn)評分明顯高于模型組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠BBB評分情況 [M,(Q)/±s,分]

表1 各組大鼠BBB評分情況 [M,(Q)/±s,分]

注:與模型組比較1)P＜0.05;與同組前一時(shí)相比較2)P＜0.05

組別n造模前 1 d 3 d 7 d 10 d 14 d空白組 5 21.00,(0.00) 21.00,(0.00) - - - -假手術(shù)組 5 21.00,(0.00) 21.00,(0.00) - - - -模型組 5 21.00,(0.00) 0.00,(0.00) 1.40±0.55 4.80±0.842)6.00±0.712)7.6±0.552)火針組 5 21.00,(0.00) 0.00,(0.00) 2.40±0.891)7.40±0.551)2)8.80±0.841)2)9.4±0.551)

2.2 火針對神經(jīng)干細(xì)胞Wnt3a及β-catenin基因表達(dá)水平的影響

不同干預(yù)條件處理神經(jīng)干細(xì)胞72 h后,與假手術(shù)組比較,1 d時(shí)模型組和火針組Wnt3a基因表達(dá)量明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),且降低的趨勢持續(xù)到3 d;在7 d、10 d時(shí)模型組和火針組Wnt3a基因表達(dá)量均增加,較前一時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);在7 d、10 d時(shí)火針組Wnt3a基因表達(dá)量均比高于模型組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。詳見表 2。β-catenin基因表達(dá)水平變化趨勢與 Wnt3a基本一致。詳見表3。

表2 各組大鼠不同時(shí)相Wnt3a基因表達(dá) (±s)

表2 各組大鼠不同時(shí)相Wnt3a基因表達(dá) (±s)

注:與假手術(shù)組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05;與同組前一時(shí)相比較3)P＜0.05

組別n1 d 3 d 7 d 10 d 14 d空白組 3 1.10±0.26 - - - -假手術(shù)組 3 1.00±0.00 - - - -模型組 3 0.63±0.041)0.41±0.03 1.12±0.153)1.42±0.133)1.34±0.08火針組 3 0.56±0.121)0.43±0.04 1.50±0.032)3)1.80±0.142)3)1.45±0.133)

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)β-catenin基因表達(dá) (±s)

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)β-catenin基因表達(dá) (±s)

注:與假手術(shù)組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05;與同組前一時(shí)相比較3)P＜0.05

組別n1 d 3 d 7 d 10 d 14 d空白組 3 0.95±0.1 - - - -假手術(shù)組 3 1.00±0.0 - - - -模型組 3 0.32±0.031)0.21±0.03 0.53±0.143)0.83±0.133)1.12±0.133)火針組 3 0.37±0.121)0.29±0.06 1.05±0.052)3)1.42±0.162)3)1.26±0.24

3 討論

SCI后不僅降低了患者的生活質(zhì)量,而且?guī)砹顺林氐慕?jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),且隨著經(jīng)濟(jì)水平的高速發(fā)展、交通事故增多等原因,SCI發(fā)生率逐年增高。然而SCI后出現(xiàn)的組織水腫、變性、壞死、神經(jīng)細(xì)胞凋亡阻礙了脊髓神經(jīng)功能的修復(fù),因此研究探索行之有效的治療方法刻不容緩。近年來研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞直接參與了神經(jīng)系統(tǒng)損傷的自然修復(fù)過程,SCI后神經(jīng)干細(xì)胞的激活、增殖、分化成為SCI后神經(jīng)功能恢復(fù)的關(guān)鍵。

Wnt信號(hào)通路是一類廣泛存在于多細(xì)胞真核生物中高度保守的復(fù)雜的信號(hào)通路,在神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化中發(fā)揮重要作用[8],其中 Wnt/β-catenin信號(hào)通路是最經(jīng)典的一條通路,在神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化和軸突導(dǎo)向中具有關(guān)鍵作用[9]。Wnt3a不僅在發(fā)育中的脊髓神經(jīng)祖細(xì)胞具有促有絲分裂效應(yīng)[10],還可在脊髓背側(cè)神經(jīng)元的特化中發(fā)揮重要作用[11],增加 SCI后的神經(jīng)元數(shù)量,促進(jìn)軸突傳導(dǎo)及神經(jīng)功能的改善[12]?，F(xiàn)有研究顯示針灸具有調(diào)控 Wnt/β-catenin信號(hào)通路的作用[13-14],但研究多集中于骨質(zhì)疏松癥、腦梗死等,而無與SCI的相關(guān)研究。

火針為傳統(tǒng)針灸療法的一種,不僅可促進(jìn) SCI模型大鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖[15],而且具有抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用[16]。本次研究采用RT-PCR法離體研究了火針對SCI后Wnt/β-catenin信號(hào)通路中關(guān)鍵因子Wnt3a和β-catenin基因表達(dá)的影響,研究發(fā)現(xiàn)SCI后Wnt3a和β-catenin的基因表達(dá)量均顯著降低,而在7 d后呈現(xiàn)高表達(dá),這種變化可能有助于 NSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化;而經(jīng)火針療法干預(yù)后的Wnt3a和β-catenin的基因表達(dá)量在7 d和10 d時(shí)均明顯高于模型組,表明火針療法具有調(diào)控Wnt3a和β-catenin基因表達(dá)的作用,揭示了火針治療SCI的部分機(jī)制?；诖?筆者推測火針可通過調(diào)控Wnt通路促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化達(dá)到修復(fù)SCI的目的,本課題組將會(huì)進(jìn)一步對此進(jìn)行研究探索,為火針治療SCI提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]Lim PA, Tow AM. Recovery and regeneration after spinal cord injury: a review and summary of recent literature[J].Ann Acad Med Singapore, 2007,36(1):49-57.

[2]Cheng Z, Bosco DB, Sun L,et al. Neural stem cellconditioned medium suppresses inflammation and promotes spinal cord injury recovery[J].Cell Transplant,2017,26(3):469-482.

[3]Zhao Y, Zuo Y, Jiang J,et al. Neural stem cell transplanttation combined with erythropoietin for the treatment of spinal cord injury in rats[J].Exp Ther Med, 2016,12(4):2688-2694.

[4]Libro R, Giacoppo S, Bramanti P,et al. Is the Wnt/βcatenin pathway involved in the anti-inflammatory activity of glucocorticoids in spinal cord injury?[J].Neuroreport, 2016,27(14):1086-1094.

[5]Strand NS, Hoi KK, Phan TM,et al. Wnt/β-catenin signaling promotes regeneration after adult zebrafish spinal cord injury[J].Biochem Biophys Res Commun,2016,477(4):952-956.

[6]孫立明,李巖,周震,等.火針對脊髓損傷模型大鼠凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響[J].針灸臨床雜志,2010,26(12):49-53.

[7]Scheff SW, Saucier DA, Cain ME. A statistical method for analyzing rating scale data: the BBB locomotor score[J].J Neurotrauma, 2002,19(10):1251-1260.

[8]Dickinson ME, McMahon AP. The role of Wnt genes in vertebrate development[J].Curr Opin Genet Dev, 1992,2(4):562-566.

[9]Ring A, Kim YM, Kahn M. Wnt/catenin signaling in adult stem cell physiology and disease[J].Stem Cell Rev,2014, 10(4):512-525.

[10]Megason SG, McMahon AP. A mitogen gradient of dorsal midline Wnts organizes growth in the CNS[J].Development, 2002,129(9):2087-2098.

[11]Muroyama Y, Fujihara M, Ikeya M,et al. Wnt signaling plays an essential role in neuronal specification of the dorsal spinal cord[J].Genes Dev, 2002,16(5):548-553.

[12]Yin ZS, Zu B, Chang J,et al. Repair effect of Wnt3a protein on the contused adult rat spinal cord[J].Neurol Res, 2008,30(5):480-486.

[13]Chen B, Tao J, Lin Y,et al. Electro-acupuncture exerts beneficial effects against cerebral ischemia and promotes the proliferation of neural progenitor cells in the cortical peri-infarct area through the Wnt/β-catenin signaling pathway[J].Int J Mol Med, 2015,36(5):1215-1222.

[14]Zhang YM, Dai QF, Chen WH,et al. Effects of acupuncture on cortical expression of Wnt3a, β-catenin and Sox2 in a rat model of traumatic brain injury[J].Acupunct Med, 2016,34(1):48-54.

[15]李巖,周震,程素利,等.火針干預(yù)脊髓損傷大鼠后血清對神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的影響[J].天津中醫(yī)藥,2013,30(1):25-27.

[16]孫立明,李巖,周震,等.火針對脊髓損傷模型大鼠凋亡細(xì)胞的影響[J].針灸臨床雜志,2011,27(1):58-61.

In Vitro Study on Fire Needling and the Expression of Wnt/β-catenin Pathway Genes in Neural Stem Cells in Rats with Spinal Cord Injury

XU Jia-chun1,ZHAO Zhi-heng1,CHENG Su-li1,WANG Xue1,JIAO Zhao-hua2,CAI Zhi-min3,LI Ting1,SHI Xu-ping1,ZHOU Zhen4,LIU Bao-hong2,LI Yan2. 1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin300193,China; 2.Tianjin Public Security Hospital,Tianjin300042,China; 3.Hebei Normal University of Science and Technology,Qinhuangdao066000,China; 4.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine Second Hospital,Tianjin300150,China

Objective To investigate the regulating effect of fire needling on Wnt and β-catenin genes of Wnt/β-catenin pathway in neural stem cells in spinal cord injury. Methods Sixty female SD rats were randomly allocated, including 5 rats to a blank group, 5 rats to a sham operation group, 25 rats to a model group and 25 rats to a fire needling group. The model and fire needling groups of rats were again separately divided into 1 d, 3 d, 7 d, 10 d and 14 d groups. A model was made using modified Allen’s method in the model and fire needling groups. The BBB score was recorded and the expressions of Wnt and β-catenin genes were determined in every group. Results In the model and fire needling groups, the BBB scores were significantly higher at 7 and 10 days than at the previous time point and there was a statistically significant difference (P＜0.05). The BBB score at every time point after treatment was significantly higher in the fire needling group than in the model group and there was a statistically significant difference(P＜0.05). Wnt3a gene expressions increased in the model and fire needling groups at 7 and 10 days compare with theprevious time point (P＜0.05). At 7 and 10 days, Wnt3a gene expression was higher in the fire needling group than in the model group and there was a statistically significant difference (P＜0.05). The changing tendency of β-catenin gene expression levels was basically the same as that of Wnt3a’s. Conclusion Fire needling can modulate the expressions of Wnt3a and β-catenin genes in neural stem cells in spinal cord injury.

Acupuncture therapy; Fire needling; Spinal cord injury; Wnt3a gene; β-catenin gene; Rats

R2-03

A

2017-04-11

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.09.1121

1005-0957(2017)09-1121-04

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81373839)

徐家淳(1989—),男,2015級(jí)博士生,Email:xujiachunzhu@163.com

李巖(1970—),男,主任醫(yī)師,博士,Email:liyan66950@sina.com