孫艷濤，宋玉紅，趙磊，于浪天，王良（1.吉林師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，吉林四平16000；2.吉林師范大學(xué)環(huán)境友好材料制備與應(yīng)用省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林四平 1010；.吉林省四平市食品藥品檢驗(yàn)所，吉林四平 16099；.中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院，南京 211198）

HPLC法同時(shí)測定牛黃寧宮片中6種成分的含量

孫艷濤1，2＊，宋玉紅1，2，趙磊3，于浪天4，王良1#（1.吉林師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，吉林四平136000；2.吉林師范大學(xué)環(huán)境友好材料制備與應(yīng)用省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林四平 130103；3.吉林省四平市食品藥品檢驗(yàn)所，吉林四平 136099；4.中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院，南京 211198）

目的：建立同時(shí)測定牛黃寧宮片中6種成分含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為TC-C18，流動(dòng)相為甲醇-0.05%磷酸（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為280 nm，柱溫為25℃，進(jìn)樣量為10μL。結(jié)果：甘草苷、鹽酸小檗堿、連翹苷、黃芩苷、大黃素和大黃酚檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為3.2～320 μg/mL（r＝0.999 9）、8.8～880 μg/mL（r＝0.999 8）、5.6～560μg/mL（r＝0.999 5）、2.0～200 μg/mL（r＝0.999 9）、4.4～440 μg/mL（r＝0.999 9）、2.0～200 μg/mL（r＝0.999 7）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜6.0%；加樣回收率分別為96.34%～97.25%（RSD＝0.33%，n＝6）、96.12%～98.06%（RSD＝0.82%，n＝6）、96.36%～99.09%（RSD＝1.02%，n＝6）、95.84%～97.32%（RSD＝0.65%，n＝6）、95.83%～97.92%（RSD＝0.88%，n＝6）、98.60%～99.65%（RSD＝0.42%，n＝6）。結(jié)論：該方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于牛黃寧宮片中6種成分含量的測定。

牛黃寧宮片；高效液相色譜法；含量測定

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of 6 components in Niuhuang ninggong tablets.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on TC-C18column with mobile phase consisted of methanol-0.05%phosphate acid（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 280 nm，and the column temperature was 25℃.The sample size was 10μL.RESULTS：The linear ranges of glycyrrhizin，berberine hydrochloride，baicalin，baicalin，emodin and chrysophanol were 3.2-320 μg/mL（r＝0.999 9），8.8-880 μg/mL（r＝0.999 8），5.6-560 μg/mL（r＝0.999 5），2.0-200 μg/mL（r＝0.999 9），4.4-440 μg/mL（r＝0.999 9），2.0-200 μg/mL（r＝0.999 7），respectively.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 6.0%.The recoveries were 96.34%-97.25%（RSD＝0.33%，n＝6），96.12%-98.06%（RSD＝0.82%，n＝6），96.36%-99.09%（RSD＝1.02%，n＝6），95.84%-97.32%（RSD＝0.65%，n＝6），95.83%-97.92%（RSD＝0.88%，n＝6），98.60%-99.65%（RSD＝0.42%，n＝6），respectively.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate，stable and reproducible，and can be used for content determination of 6 components in Niuhuang ninggong tablets.

KEYWORDSNiuhuang ninggong tablets；HPLC；Content determination

中成藥作為一個(gè)完整的制劑，強(qiáng)調(diào)的是各味藥材的協(xié)同作用。目前，以單一有效成分或指標(biāo)成分難以真正控制中成藥質(zhì)量。有些中成藥生產(chǎn)企業(yè)為了降低成本，利用藥檢質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不能完全控制所有藥材的漏洞，漏加、少加藥材。因此，必需建立一種快速、準(zhǔn)確、全面分離、檢測中成藥中多種活性成分的方法，以便更好地監(jiān)控中成藥質(zhì)量和用藥安全[1-4]。

精神分裂癥是最常見和最嚴(yán)重的精神疾病之一[5]。牛黃寧宮片可用于外感熱病、高熱神昏、驚風(fēng)抽搐、肝陽眩暈、耳鳴頭痛、心煩不寐及癲癇狂燥的治療，對(duì)精神分裂癥有一定的抗復(fù)發(fā)作用[6-12]。牛黃寧宮片由牛黃、蒲公英、雄黃、連翹、大黃、冰片、金銀花、甘草、黃連、黃芩、鉤藤、大黃磁石（煅）、玄參、葛根等27味中藥材經(jīng)提取加工制成，該制劑收錄于《中國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》（WS3-B-2852-98）。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有簡單的顯微鑒別、砷量檢測和膽酸含量檢測[13]。專利“一種控制牛黃寧宮片質(zhì)量的方法”也僅對(duì)性狀鑒別、顯微及薄層色譜鑒別、三氧化二砷檢驗(yàn)和黃芩含量測定進(jìn)行了控制[14]。上述方法檢測指標(biāo)少，有可能導(dǎo)致其他組分不穩(wěn)定或缺乏，難以全面準(zhǔn)確控制藥品質(zhì)量。目前，有關(guān)牛黃寧宮片中多個(gè)活性成分含量的測定未見報(bào)道。本試驗(yàn)采用高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測定牛黃寧宮片中6種成分的含量，為全面控制該制劑的質(zhì)量提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

1100型HPLC儀，包括VWD檢測器（美國Agilent公司）；UV-2550型紫外分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司）；FA1104N型萬分之一電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；SK5200H型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

牛黃寧宮片（沈陽紅藥制藥有限公司，批號(hào)：Z21021460，規(guī)格：0.34 g/片）；大黃素對(duì)照品（批號(hào)：110756-200110，純度：100%）、大黃酚對(duì)照品（批號(hào)：110796-201017，純度：100%）、連翹苷對(duì)照品（批號(hào)：110821-201112，純度：96.8%）、甘草苷對(duì)照品（批號(hào)：111610-201106，純度：93.7%）、黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)：110715-201318，純度：93.3%）、鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)：110713-201212，純度：86.7%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：TC-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.05%磷酸（B），梯度洗脫（0～35 min，10%→80%A；35～55 min，80%A；55～60 min，80%→10%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：280 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10μL。在上述色譜條件下，理論板數(shù)以甘草苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、連翹苷、大黃素和大黃酚峰計(jì)均＞3 000；保留時(shí)間分別為21.73、23.05、25.96、27.74、43.20和44.28 min，各成分基線分離良好，詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取待測成分對(duì)照品各適量，分別置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，稱定質(zhì)量，超聲（功率：200 W，頻率：59 kHz，下同）處理30 min，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，制成甘草苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、連翹苷、大黃素、大黃酚質(zhì)量濃度分別為200、800、560、320、200、440 μg/mL的單一對(duì)照品溶液。分別精密量取上述單一對(duì)照品溶液適量，置于5 mL量瓶中，加甲醇定容，即得。

2.2.2 供試品溶液 取樣品若干，除去糖衣，用玻璃研缽研細(xì)，精密稱取0.038 14 g，置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，稱定質(zhì)量，超聲處理45 min，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置24 h，濾過，即得。

2.3 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.1、0.5、1、2、4、5、6、7、8、9、10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表1。

表1 回歸方程與線性范圍Tab 1 Linear equations and linear ranges

2.4 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，甘草苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、連翹苷、大黃素、大黃酚峰面積的RSD分別為1.41%、2.80%、2.87%、2.11%、1.02%、1.45%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：Z21021460）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，甘草苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、連翹苷、大黃素、大黃酚峰面積的RSD分別為0.76%、1.56%、2.56%、2.09%、4.96%、5.68%（n＝5），表明供試品溶液室溫放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批樣品（批號(hào)：Z21021460）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，甘草苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、連翹苷、大黃素、大黃酚峰面積的RSD分別為1.51%、1.46%、6.44%、2.46%、1.54%、1.98%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量樣品（批號(hào)：Z21021460）適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量的待測成分對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 2 Results of recovery tests（n＝6）

2.8 樣品含量測定

取樣品適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，樣品中甘草苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、連翹苷、大黃素、大黃酚含量平均值分別為1.161 4、0.220 3、0.467 2、0.194 0、0.162 2、1.136 0 mg/g（n＝3）。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

通過紫外分光光度計(jì)對(duì)大黃酚、大黃素、甘草苷、連翹苷、黃芩苷和鹽酸小檗堿進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)上述幾種成分在280 nm波長處均有較好的紫外吸收，故采用280 nm作為檢測波長。

3.2 流動(dòng)相的選擇

預(yù)試驗(yàn)中筆者分別選用甲醇-水（70∶30，V/V，等度洗脫）、甲醇-水（梯度洗脫）、甲醇-0.05%磷酸溶液（梯度洗脫）、乙腈-水（80∶20，V/V，等度洗脫）、甲醇-0.05%磷酸溶液（梯度洗脫）作流動(dòng)相。結(jié)果顯示，流動(dòng)相為甲醇-0.05%磷酸溶液（梯度洗脫）時(shí)，色譜峰能夠很好地分離，且峰形較好，可有效地縮短分析時(shí)間，滿足分析要求。

綜上所述，本方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于牛黃寧宮片中6種成分含量的測定。

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（編輯：張 靜）

Simultaneous Determination of 6 Components in Niuhuang Ninggong Tablets by HPLC

SUN Yantao1，2，SONG Yuhong1，2，ZHAO Lei3，YU Langtian4，WANG Liang1（1.College of Chemistry，Jilin Normal University，Jilin Siping 136000，China；2.Key Laboratory of Preparation and Application of Environmental Friendly Materials，Ministry of Education，Jilin Normal University，Jilin Siping 130103，China；3.Siping Institute for Food and Drug Control，Jilin Siping 136099，China；4.College of TCM，China Pharmaceutical University，Nanjing 211198，China）

R286；R927

A

1001-0408（2017）27-3862-03

2016-10-12

2016-12-08）

＊副教授。研究方向：光譜分析和色譜分析。E-mail：1979yanzi@163.com

#通信作者：教授。研究方向：分析化學(xué)。E-mail：16421800@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.27.33