UPLC-MS/MS法同時(shí)檢測抗風(fēng)濕中藥制劑中非法添加的12種非甾體抗炎藥

言慧潔，劉偉，夏青松，潘源虎（.湖北省直屬機(jī)關(guān)醫(yī)院，武漢43007；.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技與動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，武漢 43007）

UPLC-MS/MS法同時(shí)檢測抗風(fēng)濕中藥制劑中非法添加的12種非甾體抗炎藥

言慧潔1＊，劉偉1，夏青松1，潘源虎2（1.湖北省直屬機(jī)關(guān)醫(yī)院，武漢430071；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技與動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，武漢 430072）

目的：建立同時(shí)檢測抗風(fēng)濕中藥制劑中非法添加的12種非甾體抗炎藥。方法：采用超高效液相色譜-質(zhì)譜法。色譜條件：色譜柱為Hypersil Golden C18，流動(dòng)相為5 mmol/L甲酸銨溶液-甲醇（梯度洗脫），流速為0.2 mL/min，柱溫為40℃，進(jìn)樣量為2 μL。質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子源，氣簾氣壓為25 kPa，霧化氣壓為60 kPa，輔助氣壓為55 kPa，電噴霧電壓為4 500 V，離子源溫度為650℃，采集方式為多反應(yīng)監(jiān)測模式。結(jié)果：對(duì)乙酰氨基酚、乙酰水楊酸、氨基比林、美洛昔康、布洛芬、萘普生、舒林酸、尼美舒利、雙氯芬酸、吲哚美辛、酮洛芬、塞來昔布檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為0.01～2.0 μg/mL（r＝0.995 6）、0.05～5.0 μg/mL（r＝0.997 6）、0.01～2.0 μg/mL（r＝0.998 7）、0.02～5.0 μg/mL（r＝0.995 0）、0.02～5.0 μg/mL（r＝0.995 3）、0.02～5.0 μg/mL（r＝0.996 5）、0.05～5.0 μg/mL（r＝0.995 4）、0.02～5.0 μg/mL（r＝0.996 0）、0.05～5.0 μg/mL（r＝0.995 9）、0.02～5.0 μg/mL（r＝0.995 7）、0.02～5.0 μg/mL（r＝0.996 8）、0.01～2.0 μg/mL（r＝0.998 7）；定量限≤0.20 mg/g，檢測限≤0.05 mg/g；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜5.0%；加樣回收率為80.8%～114.2%（RSD為3.85%～7.32%，n＝9）。結(jié)論：該方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于抗風(fēng)濕中藥制劑中非法添加的12種非甾體抗炎藥的同時(shí)檢測。

非甾體類抗炎藥；中藥制劑；非法添加；超高效液相色譜-質(zhì)譜法

ABSTRACTOBJECTIVE：To develop a method for simultaneous determination of 12 nonsteroidal anti-inflammatory drugs（NSAIDs）illegally added into antirheumatic TCM preparations.METHODS：UPLC-MS/MS was adopted.The determination was performed on Hypersil Golden C18column with mobile phase consisted of 5 mmol/L ammonium formate solution-methanol（gradient elution）at the flow rate of 0.2 mL/min.The column temperature was 40 ℃，and the sample size was 2 μL.A tandem quadrupole mass spectrometer equipped with electrospray ionization source was used in positive-negative ion mode：curtain gas of 25 kPa，atomizing gas of 60 kPa，auxiliary gas of 55 kPa，electrospray voltage of 4 500 V，ion source temperature of 650℃.The multiple reaction monitoring mode was performed.RESULTS：The linear ranges of acetaminophen，acetylsalicylic acid，aminopyrine，meloxicam，ibuprofen，naproxen，lam acid，nimesulide，diclofenac，indomethacin，ketoprofen and celecoxib were 0.01-2.0 μg/mL（r＝0.995 6），0.05-5.0 μg/mL（r＝0.997 6），0.01-2.0 μg/mL（r＝0.998 7），0.02-5.0 μg/mL（r＝0.995 0），0.02-5.0 μg/mL（r＝0.995 3），0.02-5.0 μg/mL（r＝0.996 5），0.05-5.0 μg/mL（r＝0.995 4），0.02-5.0 μg/mL（r＝0.996 0），0.05-5.0 μg/mL（r＝0.995 9），0.02-5.0 μg/mL（r＝0.995 7），0.02-5.0 μg/mL（r＝0.996 8），0.01-2.0 μg/mL（r＝0.998 7），respectively.The limits of quantitation were no more than 0.20 mg/g，and the limits of detection were no more than 0.05 mg/g.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 5.0%.The recoveries were 80.8%-114.2%（RSD was 3.85%-7.32%，n＝9）.CONCLUSIONS：The established method is simple，accurate，stable and reproducible，and can be used for simultaneous determination of 12 NSAIDs illegally added into antirheumatic TCM preparations.

KEYWORDSNonsteroidal anti-inflammatory drugs；TCM preparation；Illegally added；UPLC-MS/MS

非甾體類抗炎藥（NSAIDs）是臨床上常用的解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥，機(jī)制為通過抑制體內(nèi)環(huán)氧化酶（COX）活性而減少局部組織前列腺素（PG）的生物合成，除具有解熱、鎮(zhèn)痛作用外，多數(shù)還有抗炎、抗風(fēng)濕的作用，也是治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及強(qiáng)直性脊柱炎的首選藥物[1]。但是使用不當(dāng)或長期過量的應(yīng)用亦會(huì)導(dǎo)致消化道潰瘍、肝腎毒性和心血管系統(tǒng)疾病[2-3]。2004年德國默克公司生產(chǎn)的羅非昔布（商品名：萬絡(luò)）退市風(fēng)波更是讓人們重新審視選擇性COX-2抑制劑這類NSAIDs可能引發(fā)的心血管事件[4]。中藥制劑可以改善風(fēng)濕性疾病癥狀，控制病情進(jìn)展，阻止不可逆的骨質(zhì)破壞，從而改善患者生活質(zhì)量，在風(fēng)濕和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢[5]。但為了快速起效或增強(qiáng)藥效，違法添加NSAIDs的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，長期服用會(huì)給患者的身體健康帶來嚴(yán)重威脅。近年來，許多文獻(xiàn)報(bào)道了NSAIDs的檢測方法如薄層色譜法[6]、高效液相色譜法[7-8]、高效液相色譜-質(zhì)譜法等（HPLC-MS）[9-10]。本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）同時(shí)測定抗風(fēng)濕類中藥制劑中可能非法添加的12種NSAIDs的方法，以期為其質(zhì)量控制提供可靠的技術(shù)支持。

1 材料

1.1 儀器

Triple-Quadrupole Instrument型UPLC-MS/MS儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；AUW-3200D型電子分析天平（日本Shimadzu公司，感量：0.01 mg）；KQ3200型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

試驗(yàn)所用樣品均為市售抗風(fēng)濕丸劑、片劑、膠囊劑、（編號(hào)：1～10）；對(duì)乙酰氨基酚（AMP）對(duì)照品（批號(hào)：100018-201409）、乙酰水楊酸（ASP）對(duì)照品（批號(hào)：100113-201104）、氨基比林（ATD）對(duì)照品（批號(hào)：100503-201302）、美洛昔康（MXC）對(duì)照品（批號(hào)：100679-201102）、萘普生（NPX）對(duì)照品（批號(hào)：100198-201205）、舒林酸（SLD）對(duì)照品（批號(hào)：100335-200001）、尼美舒利（NSL）對(duì)照品（批號(hào)：100555-201202）、雙氯芬酸（DCF）對(duì)照品（批號(hào)：100334-200302）、布洛芬（IBF）對(duì)照品（批號(hào)：100179-201105）、吲哚美辛（IMC）對(duì)照品（批號(hào)：100258-200904）、酮洛芬（KPF）對(duì)照品（批號(hào)：100337-201104）均購自中國食品藥品檢定研究院；塞來昔布（CLB）對(duì)照品（美國Sigma公司，批號(hào)：LOT F0L037），以上對(duì)照品純度均＞99%；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水（電導(dǎo)率：18.2 MΩ/cm）。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil Golden C18（150 mm×2.1 mm，5 μm）；流動(dòng)相：5 mmol/L甲酸銨溶液（A，pH4）-甲醇（B），梯度洗脫（0～5 min，90%A；5～15 min，90%→60%A；15～25 min，60%→20%A；25～30 min，20%→90%A）；流速：0.2 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI）；氣簾氣壓（CUR）：25 kPa；霧化氣壓（GAS1）：60 kPa；輔助氣壓（GAS2）：55 kPa；電噴霧電壓：4 500 V；離子源溫度：650℃；采集方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取各待測成分對(duì)照品25.0 mg，分別置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成AMP、ASP、ATD、MXC、NPX、SLD、NSL、DCF、IBF、IMC、KPF、CLB質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的單一對(duì)照品溶液，于－20℃下貯藏。

2.2.2 供試品溶液 取樣品0.5 g（片、丸研磨成細(xì)粉，膠囊取內(nèi)容物研細(xì)），置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加甲醇40 mL，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）提取20 min，靜置后傾出提取液，殘?jiān)眉状贾貜?fù)提取1次，合并提取液并定容至100 mL。取上述溶液1 mL，加甲醇定容至100 mL，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 空白對(duì)照溶液 以甲醇作空白對(duì)照溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下單一對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。結(jié)果，AMP、ASP、ATD、MXC、NPX、SLD、NSL、DCF、IBF、IMC、KPF、CLB 保留時(shí)間分別為 4.12、7.43、16.62、14.70、16.37、21.02、16.30、24.45、16.85、21.43、20.77、20.24 min，表明各待測成分分離度良好。

2.4 12種化學(xué)物質(zhì)的質(zhì)譜檢測參數(shù)

將單個(gè)化學(xué)物質(zhì)的對(duì)照品溶液進(jìn)行分析，得到目標(biāo)化合物的質(zhì)荷比。為了進(jìn)一步對(duì)化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行確證分析，通過分析單個(gè)化學(xué)物質(zhì)對(duì)照品溶液，優(yōu)化去簇電壓和碰撞電壓，以靈敏度高、穩(wěn)定性好作為離子化模式選擇和提取離子選擇依據(jù)（詳見表1，表中“a”為定量離子），其中ASP、MXC、IBF、NPX、NSL和DCF使用ESI（－）模式，其余6個(gè)化學(xué)物質(zhì)使用ESI（+）模式。

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下單一對(duì)照品溶液各適量，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，制成系列對(duì)照品溶液。精密量取上述系列對(duì)照品溶液各2 μL，按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以各待測成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程與線性關(guān)系，詳見表2。

2.6 定量限與檢測限考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下單一對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，并按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得定量限；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得檢測限，詳見表2。

2.7 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下單一對(duì)照品溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，AMP、ASP、ATD、MXC、NPX、SLD、NSL、DCF、IBF、IMC、KPF、CLB峰面積的RSD＜4.15%（n＝6），表明儀器精密度良好。

圖1 提取離子流圖Fig 1 Extraltion ion chromatograms

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：2）適量，分別于4 ℃冰箱中放置0、1、3、5、7 d時(shí)按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，AMP、ASP、ATD、MXC、NPX、SLD、NSL、DCF、IBF、IMC、KPF、CLB峰面積的RSD＜1.21%（n＝5），表明供試品溶液4℃下放置7 d內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批樣品（編號(hào)：2）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，AMP、ASP、ATD、MXC、NPX、SLD、NSL、DCF、IBF、IMC、KPF、CLB峰面積的RSD＜4.69%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量樣品（編號(hào)：2）適量，共9份，分別加入高、中、低質(zhì)量的待測成分對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。

表1 質(zhì)譜檢測參數(shù)Tab 1 Mass spectrometric parameters

表2 回歸方程、線性范圍與定量限、檢測限Tab 2 Linear regression equations， linear ranges，LO-D and LOQ

2.11 樣品中非甾體抗炎藥檢測

取10批樣品各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表4（表中“-”為未檢出）。結(jié)果，10批樣品中有4批樣品檢測出NSAIDs共有4種，含量范圍在7.5～105.2 mg/g，其中1份樣品中檢出布洛芬、3份樣品中檢出萘普生、2份樣品中檢出雙氯芬酸、1份樣品中檢出美洛昔康。

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

本試驗(yàn)分別考察了甲醇和乙腈作為流動(dòng)相B對(duì)各色譜峰的峰形和分離度的影響，并且分別添加不同濃度的甲酸或醋酸銨于流動(dòng)相A中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以甲醇為流動(dòng)相B、5 mmol/L醋酸銨水溶液為A相時(shí)，各個(gè)特征離子色譜圖的峰形和分離度良好，采用梯度洗脫可以在30 min內(nèi)完成12個(gè)組分的分離。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 3 Results of recovery tests（n＝9）

表4 樣品中NSAIDs檢測結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 4 Results of NSAIDs in samples（n＝3，mg/g）

3.2 提取方法的選擇

本研究分別以甲醇、50%甲醇及乙腈作為樣品提取溶劑。結(jié)果表明，乙腈溶解樣品的提取率不及甲醇；選用50%甲醇作為提取溶劑時(shí)對(duì)AMD、ASP、ATD、SLD和DCF的提取效率較高，但是對(duì)其他化學(xué)物質(zhì)較低；采用甲醇作為提取溶劑提取2次時(shí)，結(jié)果顯示對(duì)所有化學(xué)物質(zhì)的回收率都達(dá)到80%以上；同時(shí)，考察結(jié)果顯示，采用超聲提取20 min即可使回收率滿足要求，同時(shí)基質(zhì)干擾小。

3.3 液質(zhì)方法的選擇

NSAIDs非法添加在中藥制劑中往往干擾成分很多，因此對(duì)分析方法的選擇性提出了更高的要求。筆者所采用的UPLC-MS/MS法，通過一級(jí)全掃描模式獲得化合物的準(zhǔn)分子離子峰，再提取該準(zhǔn)分子離子為母離子進(jìn)行二級(jí)全掃描，獲得化學(xué)物質(zhì)的碎片信息。在該模式下確定化學(xué)物質(zhì)的裂解方式之后，提取穩(wěn)定的碎片離子進(jìn)行MRM模式檢測。即對(duì)提取的母離子給予特定能量碰撞后產(chǎn)生碎片離子再次經(jīng)過提取，從而獲得特定的碎片離子峰，這樣可以將一些即使在液相色譜系統(tǒng)中無法完全分離的物質(zhì)，也可通過對(duì)其母離子和碎片離子的2次提取，使其質(zhì)譜行為的差異達(dá)到完全分離，不僅提高了特異性，而且還減少了基質(zhì)干擾，提高了檢測的靈敏度。本研究同時(shí)采用正負(fù)離子掃描方式進(jìn)行檢測，其中AMD、MXC、IBF、NPX、SLD和NCF在正離子方式下不易產(chǎn)生穩(wěn)定的碎片，所以采用ESI（－）模式，而其余6個(gè)化學(xué)物質(zhì)使用ESI（+）模式。

綜上所述，本研究建立了抗風(fēng)濕中藥制劑中可能非法添加的12種NSAIDs的UPLC-MS/MS檢測方法，并用于實(shí)際樣品的檢測。本方法樣品處理簡單，沒有基質(zhì)干擾，精密度和準(zhǔn)確度高，可作為抗風(fēng)濕中藥制劑或保健品中非法添加抗炎鎮(zhèn)痛類化學(xué)藥成分的監(jiān)督檢測。

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（編輯：張 靜）

Simultaneous Determination of 12 Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs Illegally Added into Antirheumatic TCM Preparations by UPLC-MS/MS

YAN Huijie1，LIU Wei1，XIA Qingsong1，PAN Yuanhu2（1.Hubei Zhishu Jiguan Hospital，Wuhan 430071，China；2.College of Animal Sciences Technology&College of Veterinary Medicine，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430072，China）

R927.2；R917

A

1001-0408（2017）27-3871-05

2016-10-25

2017-04-13）

＊副主任藥師。研究方向：臨床藥學(xué)。電話：027-87234240。E-mail：butterfly20058@hotmail.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.27.36