張熒，魏立菲，劉勝玉，劉威，劉昕宇，李逸

珠江水資源保護科學研究所，珠江流域水環(huán)境監(jiān)測中心，廣州 510611

自動化前處理-氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定淡水魚體中的有機磷阻燃劑

張熒*，魏立菲，劉勝玉，劉威，劉昕宇，李逸

珠江水資源保護科學研究所，珠江流域水環(huán)境監(jiān)測中心，廣州 510611

應用自動化前處理設備和氣相色譜串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀建立了淡水魚體中10種有機磷阻燃劑的檢測方法。該方法先采用自動索氏提取儀進行樣品的提取，再應用凝膠滲透色譜凈化儀和florisil柱對提取液進行兩級凈化，最后用氣相色譜串聯(lián)四級桿質(zhì)譜法(多反應監(jiān)測模式)對樣品中的有機磷阻燃劑(OPFRs)定性定量。實驗表明，凝膠滲透色譜凈化系統(tǒng)在以乙酸乙酯∶環(huán)己烷(1∶1，V/V)為流動相，流速為5.0 mL·min-1的條件下，收集OPFRs的最佳時間為900～1 680 s；方法的檢出限為0.002～0.192 ng·g-1濕重，加標水平為5.000 ng·g-1濕重時，平均加標回收率為48.7%～122%，相對偏差除磷酸三乙酯(TEP)(17.7%)和磷酸三(1,3-二氯異丙基)酯(TDCP)(11.9%)外均小于10%。應用該方法測定采集于東江某污水處理廠入河排污口的魚類樣品時，回收率指示物(d27-TBP)的回收率為82.4%～114%，魚類樣品中∑OPFRs的濃度范圍為nd～6.41 ng·g-1濕重。

有機磷阻燃劑；自動化；串聯(lián)質(zhì)譜；淡水魚體

Received14 January 2017accepted20 March 2017

Abstract: An analytical method for the determination of 10 organophosphorus flame retardants (OPFRs) in freshwater fish samples was developed using automated equipment for pretreatment and gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) for quantification. In the present method, the samples were extracted using automatic soxhlet extraction system, and then a two-step clean-up (including automatic gel permeation chromatography (GPC) and florisil) was used to purify the extract. Finally, the GC-MS/MS was used for qualitation and quantitation by multi-reaction monitoring (MRM) mode. Experimental results showed that the best collection time of the automatic GPC system was from 900 to 1 680 seconds using ethyl acetate and hexane mixture (1:1, V/V) as mobile phase at a flow rate of 5.0 mL·min-1. The method detection limits ranged from 0.002 ng·g-1to 0.192 ng·g-1wet weight, and the recoveries were in the range of 48.7%-122%, with relative standard deviations (RSDs) of less than 10% except for triethylphosphate (TEP) (17.7%) and tris(1,3-dichloropropyl) phosphate (TDCP) (11.9%). The developed method was applied to determine the OPFRs in freshwater fish collected from an outlet of a sewage treatment plant in the East River. The recoveries of d27-TBP spiked in the samples ranged from 82.4% to 114%, and the total concentrations of OPFRs in the samples ranged from not detected to 6.41 ng·g-1wet weight.

Keywords: organophosphorus flame retardants; automation; tandem mass spectrometry; freshwater fish

近30年來，阻燃劑在減少火災引起的生命財產(chǎn)損失方面發(fā)揮了重要的作用。然而，部分阻燃劑由于具有持久性、生物富集性和環(huán)境毒性等，進入環(huán)境后，可能對生物體和人類產(chǎn)生危害。隨著各國對溴代阻燃劑(brominated flame retardants, BFRs)環(huán)境效應的關注以及BFRs的禁用，有機磷阻燃劑(organophosphorus flame retardants, OPFRs)的產(chǎn)量快速提高，據(jù)歐洲阻燃劑協(xié)會的統(tǒng)計，2006年西歐OPFRs的產(chǎn)量大約為91 000 t·a-1，比2005年提高了7.1%，比2001年提高了9.6%[1]。另據(jù)前瞻產(chǎn)業(yè)研究院預計，未來我國磷系替代溴系的步伐會快于全球，到2020年磷系、無機和其他新型阻燃劑將成為重點產(chǎn)品，其比重或可達阻燃劑總量的30%。

有報道指出，多種OPFRs具有神經(jīng)毒性、生殖毒性、致癌性和基因毒性[2-3]。隨著其產(chǎn)量的顯著增加，OPFRs的污染已引起了各國政府的高度關注，其污染現(xiàn)狀、環(huán)境行為和毒理效應等成為環(huán)境領域的研究熱點[1, 4-14]。對OPFRs的毒性研究離不開對其在生物體內(nèi)的濃度水平的檢測，目前國內(nèi)外對生物體中OPFRs的檢測報道主要采用氣相色譜法(GC)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[15-16]。用氣相色譜測定OPFRs，在確證方面存在不足，易產(chǎn)生假陽性；氣相色譜-質(zhì)譜法在定性方面優(yōu)于氣相色譜，但由于基質(zhì)產(chǎn)生的碎片離子有時會對目標物產(chǎn)生干擾，所以在定性方面尚存在不足；氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法通過離子對方式定性化合物，可以彌補GC和GC-MS法在確證方面的不足，且具有雜質(zhì)影響小，對凈化要求低、靈敏度高、適合多組分同時分析等特點。

此外，在分析過程中，樣品前處理過程耗費時間最長，一般占整個分析過程的2/3以上的時間，因此，樣品前處理過程對分析結果的影響很大。自動化的前處理設備不僅可以大大縮短前處理時間，還能減少人為操作的誤差。本研究建立了用自動索氏提取儀和自動凝膠滲透色譜(GPC)凈化儀凈化生物樣品基質(zhì)，同時測定生物體中10種OPFRs的氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。

1 實驗部分(Experimental section)

1.1 儀器、材料與試劑

Foss2050型Soxtec全自動索氏抽提系統(tǒng)(丹麥，F(xiàn)oss公司)；全自動凝膠滲透色譜系統(tǒng)(德國，LC-tech，型號Freestyle GPC EVA)含自動凝膠滲透色譜(凝膠滲透色譜柱25 mm×50 cm，填料為50 g的Biobeads SX-3)和在線濃縮裝置；Thermo TSQ Quantum XLS三重四級桿氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS/MS)，DB-5 MS色譜柱(325 ℃, 30 m×250 μm×0.25 μm)；氮吹儀(北京八方世紀科技有限公司，型號BF-2000)；FD-80冷凍干燥機(北京博醫(yī)康)等實驗設備。

Florisil小柱：500 mg，3 mL(CNW Technologies)；丙酮、正己烷、環(huán)己烷和乙酸乙酯均為色譜純(美國TEDIA)；10種OPFRs(具體名稱見表1)均為純品(純度大于99%，購于德國Dr.Ehrenstorfer公司)，d15-磷酸三苯酯(d15-TPP，100 μg·mL-1于異辛烷，AccuStandard)和d27-磷酸三丁酯(d27-TBP，100 μg·mL-1于異辛烷，AccuStandard)為標準溶液。

標準儲備液的制備：準確稱取10 mg(精確到0.1 mg)OPFRs各標準品分別于10 mL容量瓶中，用乙酸乙酯溶解，配制成1 000 mg·L-1的單標儲備液，于-18 ℃條件下儲存。

1.2 樣品采集和前處理

1.2.1 樣品采集與預處理

2014年于惠州市東江某污水處理廠入河排污口附近采集了3條羅非魚(Oreochromis mossambicus)、2條鯉魚(Cyprinus carpio)、4條鰱魚(Hypophthalmichthys molitrix)、3條鳊魚(Parabramis pekinensis)和6條餐條(Hemiculter leucisculus)。樣品運回實驗室后，進行解剖，取背脊肌肉用二氯甲烷和正己烷淋濾過的鋁箔紙包裹，置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 自動索氏抽提

每個樣品取約10 g濕重，經(jīng)冷凍干燥處理后，加入約50 g的無水硫酸鈉研磨，添加一定量的回收率指示物(d27-TBP)，使用Foss索氏抽提儀進行浸提，抽提液為V(丙酮)∶V(正己烷)=1∶1混合提取液80 mL，浸提溫度160 ℃，其中浸提時間60 min，淋洗時間60 min。浸提液轉換成V(環(huán)己烷)∶V(乙酸乙酯)= 1∶1的混合試劑后，轉移至管制玻璃瓶待濃縮凈化。

1.2.3 自動凝膠色譜凈化

自動GPC凈化系統(tǒng)采用三聯(lián)機模式，即濃縮—凈化—濃縮。上述浸提液經(jīng)濃縮并轉換溶劑為V(環(huán)己烷)∶V(乙酸乙酯)= 1∶1的混合試劑(與GPC流動相溶劑相同)后，再經(jīng)GPC凈化。GPC流動相的柱流速為5.0 mL·min-1，收集時間為900～1 680 s的洗脫液，洗脫液經(jīng)濃縮為5 mL后，氮吹并轉換溶劑為正己烷，濃縮至1 mL，待進一步凈化。

1.2.4 Florisil柱凈化

取Florisil小柱，先用8 mL乙酸乙酯，再用6 mL正己烷活化，保持該柱濕潤，將1.2.3節(jié)中洗脫液移至Florisil小柱上，再用2 mL正己烷分2次洗滌樣品瓶，將洗滌液一并加到該柱上，待凈化液通過該柱后，用8 mL正己烷洗脫，棄去，再用8 mL乙酸乙酯洗脫，收集，收集的洗脫液用氮吹儀氮吹定容至0.5 mL后，加入100 ng內(nèi)標物d15-TPhP待上機測試。

1.2.5 定性定量分析

儀器條件：DB-5 MS石英毛細管柱，載氣為高純氦氣，柱流量為1.2 mL·min-1，進樣口溫度250 ℃，無分流進樣，進樣量1 μL；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃。采用程序升溫，初始溫度60 ℃，保持1 min，以20 ℃·min-1升至160 ℃，再以10 ℃·min-1升至290 ℃；采用電子轟擊離子源(EI)，電子能量70 eV，接口溫度280 ℃。掃描方式：多反應離子監(jiān)測模式(MRM)，采用“EZ Method”設定方法，在“Start time”設定為“該目標化合物保留時間RT-0.5 min”，在“End time”設定為“該目標化合物保留時間RT+0.5 min”；各種化合物的母離子、子離子、碰撞能量及保留時間見表1。

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 GPC凈化條件的選擇

GPC的流動相為V(環(huán)己烷)∶V(乙酸乙酯)= 1∶1的混合試劑；混合標準溶液由10種OPFRs和d27-TBP的標準液用3 mL與流動相相同的混合試劑稀釋配制而成，進GPC色譜柱量均為100 ng。運行LC-tech全自動凝膠滲透色譜儀將該混合標準溶液全量輸入到色譜柱內(nèi)進行GPC淋洗凈化實驗，其初始設置參數(shù)為：流速5 mL·min-1(恒流方式)；Forerun(雜質(zhì)丟棄時間)780 s；Mainrun(收集時間) 900 s(連續(xù)收集15段淋洗液，每段60 s)；Tailing時間300 s。

所收集的上述15段淋洗液氮吹定容到0.5 mL，加入內(nèi)標物d15-TPP后，用GC-MS/MS進行測定，得到10種OPFRs和d27-TBP的GPC淋洗時間與各組分的累積回收率關系曲線(圖1)。從淋洗曲線可知，OPFRs和d27-TBP的淋出區(qū)間為900～1 680 s。

然而，在900～1 680 s的淋出區(qū)間中，動物脂肪可能同時洗出，為此，以玉米油代表動物脂肪，測定了玉米油在紫外波長λ=254 nm時的淋洗曲線。從淋洗曲線可知，玉米油在900 s、960 s和1 020 s時的回收率分別為55.4%、85.2%和100%(圖1)。因此，為盡可能在保證目標物的回收率下去除較多的動物脂肪，選擇OPFRs和d27-TBP的收集時間為960～1 680 s。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

質(zhì)譜掃描選擇多反應監(jiān)測模式(MRM)。為獲得最佳的色譜條件，保證對目標物定量和定性的準確性，對目標物的母離子、子離子、碰撞能量等一系列質(zhì)譜參數(shù)進行了優(yōu)化。首先采用全掃描(full scan)方式獲取待測物的母離子，之后采用子離子掃描方式(product scan)，并通過不斷改變碰撞能量獲得子離子響應最高時的最優(yōu)碰撞能量。最后，每個OPFR單體選擇最優(yōu)的2～3對離子對和相應的碰撞能量，對目標物進行定性和定量分析。10種OPFRs、d27-TBP和d15-TPhP的質(zhì)譜條件詳見表1，色譜分離效果可見圖2。

2.3 線性關系和方法檢出限

用陰性基質(zhì)溶液與有機磷阻燃劑混合溶液配制成濃度分別為0.010、0.020、0.050、0.100、0.200、0.500、1.00 mg·L-1的OPFRs基質(zhì)標準溶液，用峰面積對濃度作圖，得到線性范圍和線性相關系數(shù)，以每種OPFR的3倍信噪比時的添加濃度確定為檢出限，以10倍信噪比的添加濃度確定了定量限。結果表明(表1)，在相應的質(zhì)量范圍內(nèi)，各OPFRs的響應值與其質(zhì)量濃度均呈良好的線性關系，相關系數(shù)均高于0.99，方法的LOD范圍為0.002～0.192 ng·g-1濕重，LOQ的范圍為0.005～0.641 ng·g-1濕重。

表1 多反應監(jiān)測模式下有機磷阻燃劑(OPFRs)的保留時間、監(jiān)測離子對、碰撞能量、線性相關系數(shù)和方法的回收率及相對標準偏差(n=3)Table 1 The retention time, ion pair, collision energy, linear correlation of organophosphorus flame retardants (OPFRs) in the MRM mode, and the recovery and relative standard deviation of the method (n=3)

圖1 有機磷阻燃劑各組分和玉米油的自動凝膠滲透色譜(GPC)淋洗曲線Fig. 1 The gel permeation chromatography (GPC) elution curves of organophosphorus flame retardants, including their recoveries

圖2 MRM模式的質(zhì)譜條件下有機磷阻燃劑的色譜圖Fig. 2 The chromatogram of organophosphorus flame retardants in the MRM mode of the mass spectrum

2.4 質(zhì)量控制與質(zhì)量保證(QA/QC)

所有玻璃器皿使用前均用丙酮、二氯甲烷和正己烷依次洗滌2次。在分析過程中，增加了控制樣品分析流程(3個方法空白、3個加標空白、3個陰性樣品加標和3個樣品平行樣)等質(zhì)量控制與質(zhì)量保證措施。在樣品提取前，向每個分析樣品加入d27-TBP回收率指示物，用于監(jiān)測樣品的制備與分析及基質(zhì)的影響。在陰性基質(zhì)加標和空白加標中加入100 ng的10種OPFRs混合標準溶液，其中陰性基質(zhì)取樣量為20.0 g，OPFRs的質(zhì)量濃度為5.00 ng·g-1濕重。基質(zhì)加標和空白加標實驗主要檢測目標化合物的回收率。在樣品分析時，用已知濃度標樣檢查儀器的靈敏度和穩(wěn)定性。結果顯示，3個方法空白中均未檢出OPFRs，基質(zhì)加標和空白加標中各OPFRs的加標回收率在48.7%～122%之間，樣品平行樣中80%的OPFRs的對偏差小于10%。

3 實際樣品測定(Determination of the actual samples)

應用建立的方法對采自東江某污水處理廠入河排污口5種魚類中的10種OPFRs進行檢測，檢出的OPFR單體和總量(∑OPFRs)的濃度見表2，樣品中回收率指示物d27-TBP的回收率范圍在82.4%～114%之間。

OPFRs在魚類樣品中的檢出率極低，檢出的4個單體為TPrP、TBP、TCEP和TCiP，它們在所有魚肉樣品中的檢出率分別為5.56%、38.9%、50.0%和33.3%。TPrP僅在1條鳊魚中檢出，含量為0.961 ng·g-1濕重(85.8 ng·g-1脂重)；TBP在羅非魚、鯉魚和餐條中的含量為nd～2.42 ng·g-1濕重(nd～209 ng·g-1脂重)，在鳊魚和鰱魚中未檢出；TCEP在鯉魚、鳊魚和餐條中檢出，含量為nd～4.96 ng·g-1濕重(nd～148 ng·g-1脂重)；TCiP在鯉魚和鳊魚中檢出，含量為nd～2.42 ng·g-1濕重(nd～121 ng·g-1脂重)。Ma等[9]報道了珠江三角洲地區(qū)漁民采集的胡子鯰和草魚肌肉中TBP、TCEP和TCiP的含量分別為43.9～2 946 ng·g-1脂重，82.7～4 692 ng·g-1脂重和62.7～883 ng·g-1脂重，其濃度水平高于本研究魚類一個數(shù)量級，可能是由于該研究的采樣地點處于電子垃圾污染區(qū)。國外報道的鱸魚、鯉魚、貽貝等體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)了高于本研究一個數(shù)量級的OPFRs[2]，可能是由于物種的差異。

綜上所述，采用自動索式抽提-凝膠滲透色譜和Florisil柱凈化-GC-MS/MS測定淡水魚體中OPFRs，通過實驗條件優(yōu)化，該方法OPFRs的加標回收率在48.7%～122%之間，相對標準偏差除TEP(17.7%)和TDCP(11.9%)外均小于10%，生物樣品中回收率指示物d27-TBP的回收率范圍在82.4%～114%之間，具有較好的準確度和精密度，該方法自動化程度較高，靈敏度高、操作簡單快捷且重現(xiàn)性好，節(jié)約了時間和成本，可用于實際生物樣品的分析和測定。

表2 5種魚類中有機磷阻燃劑的含量(ng·g-1濕重)Table 2 The concentrations of organophosphorus flame retardants in the five kinds of fish (ng·g-1 wt)

注：a中值(范圍)；b未檢出。

Note:amedium value (range);bnot detected.

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◆

AutomaticPretreatmentandDeterminationofOrganophosphorusFlameRetardantsinFreshwaterFishSamplesbyGasChromatographyTandemMassSpectrometry

Zhang Ying*, Wei Lifei, Liu Shengyu, Liu Wei, Liu Xinyu, Li Yi

Scientific Institute of Pearl River Water Resources Protection, Monitoring Centre of Pearl River Valley Aquatic Environment, Guangzhou 510611, China

10.7524/AJE.1673-5897.20170114009

2017-01-14錄用日期2017-03-20

1673-5897(2017)3-604-07

X171.5

A

張熒(1984—)，女，環(huán)境科學博士，高級工程師，主要研究方向為水環(huán)境中有機污染物的遷移和轉化，發(fā)表學術論文30余篇。

國家自然科學基金項目(41303082)；

張熒(1984-)，女，工程師，研究方向為水環(huán)境有機污染物監(jiān)測，E-mail: cec_007@126.com；

張熒, 魏立菲, 劉勝玉, 等. 自動化前處理-氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定淡水魚體中的有機磷阻燃劑[J]. 生態(tài)毒理學報，2017, 12(3): 604-610

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