劉芝余，翟毓秀，姚琳，江艷華，李風(fēng)鈴,*，王聯(lián)珠，尚德榮，楊元昊，郭萌萌，譚志軍

1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測與評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 2660712. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院，無錫2141823. 陜西省水產(chǎn)研究所，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃河水產(chǎn)研究所，西安 710086

全氟辛酸(PFOA)對菲律賓蛤仔體內(nèi)酶活性的影響

劉芝余1,2，翟毓秀1，姚琳1，江艷華1，李風(fēng)鈴1,*，王聯(lián)珠1，尚德榮1，楊元昊3，郭萌萌1，譚志軍1

1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測與評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 2660712. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院，無錫2141823. 陜西省水產(chǎn)研究所，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃河水產(chǎn)研究所，西安 710086

采用半靜態(tài)毒性實(shí)驗(yàn)方法，將菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)分別暴露于0.2、2、20 μg·L-1的全氟辛酸(perfluorooctanoic acid, PFOA)中，在處理后第1、3、6、10、15、21天分別取樣，測定整體組織中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、7-乙氧基異吩噁唑酮脫乙基酶(EROD)活性和過氧化脂質(zhì)(LPO)含量。酶活性分析結(jié)果顯示：PFOA對菲律賓蛤仔組織SOD、CAT和POD活性均呈現(xiàn)先促進(jìn)后抑制的作用；低濃度組SOD活性在暴露第1天達(dá)到最高，顯著高于對照組(P < 0.01)；中高濃度組SOD活性在暴露第6天達(dá)到最低；暴露1～15 d，低濃度組CAT活性均顯著高于對照組(P < 0.05)；高濃度組CAT活性在暴露第6天得到顯著誘導(dǎo)，其余時(shí)間基本處于抑制狀態(tài)；中濃度組POD活性在暴露第3天即達(dá)到最高，高濃度組POD活性基本一直處于抑制狀態(tài)；隨著PFOA暴露時(shí)間的延長，菲律賓蛤仔組織LPO含量呈現(xiàn)了先降低后升高的趨勢；各濃度組中EROD的活力都顯著被誘導(dǎo)(P < 0.01)，與處理濃度呈正相關(guān)；中高濃度組的GST活性在脅迫期間變化比較顯著，呈現(xiàn)誘導(dǎo)-抑制的變化規(guī)律。研究表明，PFOA暴露能夠引起菲律賓蛤仔組織抗氧化酶和生物轉(zhuǎn)化酶的變化，可以與其他敏感性指標(biāo)一起作為指示早期海洋PFOA污染的生物標(biāo)志物。

PFOA；菲律賓蛤仔；毒性效應(yīng)；抗氧化酶系；生物轉(zhuǎn)化酶

Received13 January 2017accepted13 March 2017

Abstract: A semi-static toxicity experiment under laboratory conditions was carried out to study the effects of different concentrations (low, 0.2 μg·L-1; medium, 2 μg·L-1; and high, 20 μg·L-1) perfluorooctanoic acid (PFOA) on Ruditapes philippinarum. After exposure for 1, 3, 6, 10, 15, 21 days, activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), peroxidase (POD), glutathione-S-transferase (GST), 7-ethoxy-resorufin-o-deethylase (EROD) and lipid peroxide (LPO) content were measured. Under the effects of PFOA, the SOD, CAT, and POD activities decreased after an initial increase. After 1 day exposure to low concentration PFOA, the SOD activity reached the maximum, being significantly higher than the control (P < 0.01). The SOD activity in the medium and high concentration group reached the lowest at 6th day. After exposure to low concentration PFOA for 1-15 days, the CAT activity was significantly higher than the control. However, the CAT activity was basically inhibited when exposed to high concentration PFOA, except for being the highest on the 6th day. The POD activity in the medium concentration group reached the highest on the 3th day, and was basically inhibited in the high concentration group. As the extension of PFOA exposure time, the LPO content increased after an initial decrease. The EROD activity was significantly induced, and was positively correlated with the concentration of PFOA. The GST activity significantly changed when exposed to medium and high concentrations PFOA during the stress period, and changed by the rule of induction-inhibition. The results showed that PFOA exposure could trigger the changes of antioxidant enzymes and biotransformation enzymes in Ruditapes philippinarum, which could be considered as potential biomarkers to warning PFOA pollution in marine.

Keywords: PFOA; Ruditapes philippinarum; toxic effects; antioxidant enzymes; biotransformation enzymes

全氟辛酸(perfluorooctanoic acid, PFOA)是人工合成的化學(xué)品，具有獨(dú)特的疏水疏油性，被廣泛應(yīng)用于航空科技、運(yùn)輸、電子行業(yè)，以及廚具等民生用品中[1-2]。目前，PFOA的生產(chǎn)和使用已經(jīng)超過50年，環(huán)境中存在大量的PFOA殘留。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，PFOA在大氣[3]、水體[4-5]、沉積物[6]、野生動物[7]和人體[8-10]中甚至偏遠(yuǎn)地區(qū)均可檢測到。毒理學(xué)研究顯示，PFOA對魚類、禽類、大鼠等動物具有胚胎發(fā)育、生殖、腎臟等多種毒性[11]，另外可引起動物基因的異常表達(dá)、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)損傷或破壞、酶活性降低等多種不良生物學(xué)效應(yīng)，并易使機(jī)體感染疾病致使死亡率增加[12]。PFOA污染已引起越來越多科學(xué)家的關(guān)注，探索其致毒機(jī)理，評價(jià)其對生態(tài)環(huán)境及人體健康的影響[13]。

研究表明，污染物的毒性作用最先體現(xiàn)在機(jī)體的細(xì)胞、生物化學(xué)和分子水平上的變化[14]。當(dāng)PFOA進(jìn)入機(jī)體內(nèi)，引起體內(nèi)系統(tǒng)的代謝轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生系列活性氧，如·O2-、·OH、H2O2等，造成機(jī)體氧化損傷[15]。脂質(zhì)過氧化物(lipid peroxidation, LPO)是機(jī)體膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的主要產(chǎn)物之一，其含量的高低可以直接反應(yīng)生物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，也可間接反映生物體內(nèi)活性氧的累積程度和細(xì)胞的損傷程度[16]。生物體需要開啟防御系統(tǒng)來對抗自由基可能產(chǎn)生的細(xì)胞損傷，抗氧化酶系統(tǒng)及機(jī)體生物轉(zhuǎn)運(yùn)反應(yīng)的啟動，就可以認(rèn)為是生物體抵抗環(huán)境污染和抵御毒性損傷的反應(yīng)[17]。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)和過氧化物酶(peroxidase, POD)是生物體抗氧化酶體系的重要組成部分，在活性氧自由基的清除中發(fā)揮重要作用。SOD能歧化氧自由基變成H2O2，CAT和POD催化分解H2O2為H2O和O2。相關(guān)研究指出，PFOA可以引起生物體內(nèi)SOD和CAT等抗氧化酶活性顯著變化，產(chǎn)生及一系列抗氧化反應(yīng)，從而導(dǎo)致氧化損傷[18-20]。當(dāng)活性氧平衡遭到破壞時(shí)，機(jī)體通過相Ⅰ、相Ⅱ的生物轉(zhuǎn)運(yùn)反應(yīng)來緩解氧化壓力，參與相Ⅰ、相Ⅱ反應(yīng)的主要酶系為7-乙氧基異吩噁唑酮脫乙基酶(7-ethoxy-resorufin-o-deethylase, EROD)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase, GST)，可以將它們作為生物標(biāo)志物來指示特定污染物的污染狀況[21-22]。

菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)是我國沿海地區(qū)重要的灘涂貝類，分布極廣，對污染物具有高蓄積性、高敏感性等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于污染物檢測和環(huán)境預(yù)警研究中[23-25]。本實(shí)驗(yàn)通過海水直接暴露方式，觀察不同時(shí)間點(diǎn)菲律賓蛤仔的抗氧化酶系統(tǒng)和生物轉(zhuǎn)化酶活性的變化，分析探討PFOA脅迫過程中菲律賓蛤仔SOD、CAT、POD、EROD、GST和LPO含量等一系列生理生化指標(biāo)，為PFOA在海洋中污染監(jiān)測和環(huán)境毒理學(xué)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

儀器：可見分光光度計(jì)(V1800，尤尼柯(上海)儀器有限公司)，酶標(biāo)儀(iMark 168-1130，美國Bio-Rad公司)，臺式高速冷凍離心機(jī)(Neofuge 15R，上海力康生物醫(yī)療科技控股有限公司)，電熱恒溫水浴鍋(HWS-26，上海圣科儀器設(shè)備有限公司)，勻漿機(jī)(T18，德國IKA集團(tuán))。

試劑：全氟辛酸(C8HF15O2)，純度為AR級(Sigma公司，美國)。SOD、CAT、GST、LPO、EROD、POD酶活力測試盒和蛋白質(zhì)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。其他試劑均為分析純，購自中國國藥有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

成體蛤仔殼長(3.5±0.14) cm，殼寬(2.0±0.22) cm，采集于山東省青島市水產(chǎn)品批發(fā)市場，實(shí)驗(yàn)開始前于實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)中所用到的海水均采集于遠(yuǎn)離工業(yè)和生活區(qū)的近海海域，屬于Ⅰ類海水。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法1.3.1 曝毒實(shí)驗(yàn)

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)PFOA對菲律賓蛤仔的暴露濃度，設(shè)置3個(gè)濃度組：0.2、2、20 μg·L-1，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行組，曝毒水體為3 L。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)投放40只菲律賓蛤仔。飼養(yǎng)期間溫度保持在20～25 ℃，鹽度25‰～30‰，pH 7.7～8.5。連續(xù)充氧，24 h更換1次實(shí)驗(yàn)海水，每日正常投放綠藻粉，投放量占菲律賓蛤仔體重的0.6‰。

1.3.2 樣品的制備及測定

實(shí)驗(yàn)分別于第1、3、6、10、15、21天取樣，每組取8個(gè)菲律賓蛤仔整只研磨，稱取這8個(gè)個(gè)體的5 g組織樣，加入預(yù)冷的貝類生理鹽水[26](0.02 mol·L-1HEPES緩沖液，0.4 mol·L-1NaCl，0.1 mol·L-1MgSO4，0.01 mol·L-1KCl，0.01 mol·L-1CaCl2，pH 7.4)，勻漿機(jī)勻漿，4 ℃下2 500 r·min-1離心10 min后立即取上清液，凍存于-80 ℃，留待蛋白質(zhì)含量和SOD、CAT、POD等一些酶活力測定。勻漿比例為組織質(zhì)量(g)∶貝類生理鹽水體積(mL)=1∶9。酶的活性測定均按照試劑盒說明書進(jìn)行，蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)比色法測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行處理，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(X ± SD)表示。采用SPSS 22.0軟件中的單因素方差分析法(One-Way ANOVA)進(jìn)行差異分析，用Turkey法比較組間數(shù)據(jù)的差異。各濃度組與空白對照組差異顯著(P < 0.05)表示為a，差異顯著(P < 0.01)表示為b，未標(biāo)注則表示與空白對照組無顯著性差異(P > 0.05)。

抑制率和誘導(dǎo)率的計(jì)算公式為：抑制率(%) = (1 - 濃度組酶活性/對照組酶活性)×100%，誘導(dǎo)率(%) =(濃度組酶活性/對照組酶活性)×100%。

表1 方差齊性檢驗(yàn)Table 1 Homogeneity test of variances

注：SOD, CAT, POD, LPO, EROD, GST表示超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶、脂質(zhì)過氧化物、7-乙氧基異吩噁唑酮脫乙基酶、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶。

Note: SOD, CAT, POD, LPO, EROD, GST stand for superoxide dismutase, catalase, peroxidase, lipid peroxidation, 7-ethoxy-resorufin-o-deethylase, glutathione S-transferase.

2 結(jié)果(Results)

2.1 方差齊性分析

表1為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)方差齊性分析結(jié)果。P > 0.05說明方差相等，P < 0.05說明為非等方差。方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果表明，數(shù)據(jù)方差大部分為等方差，方差齊性較好。

2.2 PFOA對菲律賓蛤仔組織SOD的影響

PFOA脅迫下菲律賓蛤仔SOD變化見圖1。在脅迫第1天，0.2和2 μg·L-1濃度組SOD酶活即被誘導(dǎo)，且與對照組相比，具有顯著差異(P < 0.01)，誘導(dǎo)率分別為128%和115.22%；隨著脅迫時(shí)間的延長，在第6天時(shí)，各個(gè)處理組的SOD活性迅速下降，被顯著抑制(P < 0.01)，抑制率分別為24.38%、37.94%和33.69%；第10天，除20 μg·L-1濃度組被顯著誘導(dǎo)外(P < 0.01)，其余濃度組依然處于抑制狀態(tài)；第15天，與對照組相比，除0.2 μg·L-1濃度組SOD酶活性被顯著抑制外，其余濃度組均顯著提高；而0.2 μg·L-1濃度組則在第21天被再次誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率為113.6%，其余濃度組卻被顯著抑制。

圖1 全氟辛酸(PFOA)對菲律賓蛤仔SOD活性的影響注：a 顯著差異(P < 0. 05)，b 顯著差異(P < 0. 01)，下同。Fig. 1 Effects of perfluorooctanoic acid (PFOA) on the SOD activity of R. philippinarumNote: a. significant difference (P < 0. 05); b. significant difference (P < 0. 01). The same case in the following figures.

2.3 PFOA對菲律賓蛤仔組織CAT的影響

PFOA脅迫下菲律賓蛤仔CAT變化見圖2。對照組菲律賓蛤仔抗氧化酶活性在所檢測時(shí)間范圍內(nèi)未出現(xiàn)顯著變化(P > 0.05)。CAT活性在PFOA作用下的響應(yīng)特征較為敏感，在0.2和2 μg·L-1PFOA作用下，菲律賓蛤仔CAT活性在脅迫初期始終處于誘導(dǎo)狀態(tài)(P < 0.01)，且隨著脅迫天數(shù)的增加，誘導(dǎo)得越明顯。0.2 μg·L-1濃度組的CAT活性在第15天達(dá)到頂峰后，CAT活力開始顯著降低，至21 d時(shí)活力明顯低于對照組；2 μg·L-1濃度組的CAT活性至第6天達(dá)到活力最高峰后逐漸降低，在第21天時(shí)活力又顯著高于對照組。20 μg·L-1濃度組的CAT活性在脅迫期間基本處于抑制狀態(tài)，僅在第6天活性得到誘導(dǎo)，與脅迫時(shí)間之間并無明顯對應(yīng)關(guān)系。

2.4 PFOA對菲律賓蛤仔組織POD的影響

PFOA脅迫下菲律賓蛤仔組織POD變化見圖3。0.2和2 μg·L-1濃度組在脅迫初期一直處于顯著誘導(dǎo)狀態(tài)(P < 0.01)，但0.2 μg·L-1濃度組在第6天時(shí)活性開始下降，但仍處于誘導(dǎo)狀態(tài)，至第15天后活性又開始上升；而2 μg·L-1濃度組在第6天時(shí)活性得到顯著抑制(P < 0.01)，在第15天活性得到再次誘導(dǎo)后，21 d時(shí)重新變?yōu)橐种茽顟B(tài)；20 μg·L-1濃度組與其他2組相比，POD活力抑制得更為顯著，基本一直處于抑制狀態(tài)。

圖2 PFOA對菲律賓蛤仔CAT活性的影響Fig. 2 Effects of PFOA on the CAT activity of R. philippinarum

圖3 PFOA對菲律賓蛤仔POD活性的影響Fig. 3 Effects of PFOA on the POD activity of R. philippinarum

2.5 PFOA對菲律賓蛤仔組織LPO的影響

PFOA脅迫下菲律賓蛤仔組織LPO含量變化見圖4。與對照組相比，各個(gè)濃度組的LPO含量在前15 d一直處于降低狀態(tài)，在第10天時(shí)最低；0.2 μg·L-1濃度組的LPO含量在第15天時(shí)開始上升，但仍明顯低于對照組，直至第21天時(shí)LPO含量明顯升高；而2和20 μg·L-1濃度組的LPO含量在第15天顯著增加，與對照組相比差異顯著(P < 0.01)；第21天時(shí)，20 μg·L-1濃度組的LPO含量與對照組無顯著差異。

2.6 PFOA對菲律賓蛤仔組織EROD的影響

PFOA脅迫下菲律賓蛤仔組織EROD變化見圖5。在整個(gè)PFOA暴露階段，不同濃度組EROD活性均顯著高于對照組。EROD活力在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間與濃度組的暴露濃度成正比，濃度越高，EROD的活力越高。2、20 μg·L-1濃度組的EROD活力分別從第10天開始緩慢降低，但與對照組相比仍然處于誘導(dǎo)狀態(tài)。

圖4 PFOA對菲律賓蛤仔LPO含量的影響Fig. 4 Effects of PFOA on the LPO content of R. philippinarum

圖5 PFOA對菲律賓蛤仔EROD活性的影響Fig. 5 Effects of PFOA on the EROD activity in the tissues of R. philippinarum

2.7 PFOA對菲律賓蛤仔組織GST的影響

PFOA脅迫下菲律賓蛤仔組織GST變化見圖6。與對照組相比，0.2 μg·L-1濃度組在脅迫前期GST的活性變化不大，直至第15天時(shí)活性才被顯著誘導(dǎo)，后又開始下降被抑制；2和20 μg·L-1濃度組的GST活性在脅迫初期被顯著誘導(dǎo)(P < 0.01)，隨著脅迫時(shí)間的延長，在第6天時(shí)活性開始下降，至第15天時(shí)跌至谷底。

圖6 PFOA對菲律賓蛤仔GST酶活性的影響Fig. 6 Effects of PFOA on the GST activity of R. philippinarum

3 討論(Discussion)

3.1 PFOA脅迫下菲律賓蛤仔體內(nèi)抗氧化酶活性及LPO含量的變化

生物體通過不斷產(chǎn)生和清除自由基來保持動態(tài)平衡，其中SOD、CAT和POD是典型的清除氧自由基的抗氧化酶，LPO是脂質(zhì)自由基的產(chǎn)物之一，它們已被廣泛用于指示生物遭受污損的程度。本次研究發(fā)現(xiàn)，菲律賓蛤仔在PFOA脅迫后，各指標(biāo)與對照組相比均有受誘導(dǎo)或抑制的顯著變化。SOD通過催化·O2-產(chǎn)生歧化反應(yīng)生成H2O2，是唯一一種以自由基為底物的抗氧化酶，它的活性決定了清除·O2-的能力。有研究表明，生物體的SOD活性往往會在受到輕度污染或者短時(shí)間脅迫時(shí)升高；而受到重度污染或者長時(shí)間脅迫時(shí)又會降低，致使活性氧自由基大量積累在生物體內(nèi)，使其受到氧化損傷[27]，Stebbing[28]把這種現(xiàn)象定義為生物的“毒物興奮效應(yīng)”。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在0.2 μg·L-1PFOA濃度組脅迫下，SOD活性首先被顯著誘導(dǎo)，隨著脅迫時(shí)間的延長，所有濃度組的SOD活性顯著被抑制。王賀威等[29]研究了PFOS脅迫對翡翠貽貝抗氧化酶的影響，結(jié)果顯示，PFOS能夠在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)抗氧化酶的活性，但隨著脅迫時(shí)間的推移，抗氧化酶的活性表現(xiàn)出明顯的被抑制趨勢；于慶云等[30]研究了鎘和鉛對菲律賓蛤仔脂質(zhì)過氧化及抗氧化酶活性的影響，也證實(shí)了以上觀點(diǎn)。同時(shí)有研究表明，SOD活性在脅迫初期的提高可能是一種對外界環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng)，是為了平衡活性氧的水平從而更好地適應(yīng)環(huán)境[31]。不過，20 μg·L-1PFOA濃度組在脅迫初期時(shí)被顯著抑制，到第10天時(shí)活性顯著升高，這表明了活性氧物質(zhì)對機(jī)體造成的損傷尚未對細(xì)胞造成嚴(yán)重傷害，而脅迫15 d之后SOD活性再次下降，表明未被及時(shí)清除的活性氧物種對抗氧化酶系統(tǒng)已經(jīng)造成了破壞，這與楊濤等[15]在研究苯并(b)熒蒽對翡翠貽貝內(nèi)臟團(tuán)抗氧化酶活性及脂質(zhì)過氧化物含量脅迫時(shí)所得的結(jié)果相似。

POD也是一種抗氧化酶，廣泛分布于生物體內(nèi)的過氧物酶體中，是一類含鐵的金屬酶類，通過降解污染物在代謝等過程中形成的過氧化物(如酚、胺等)來減輕其毒性，防止膜脂過氧化或脫酯反應(yīng)被活性氧自由基啟動，保護(hù)生物體細(xì)胞生物膜[36]。由于POD和CAT具有相同的輔基鐵卟啉及相似的催化機(jī)制，因此也可使H2O2分解，與CAT、SOD共同組成了生物體內(nèi)的活性氧防御系統(tǒng)，可以清除超氧自由基、H2O2和過氧化物，以及阻止或減少·OH的形成[37]。已有研究表明，POD活性維持在一定的水平，可以將機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的過多自由基去除，維持機(jī)體的自由基處于一個(gè)平衡的狀態(tài)，防止自由基對機(jī)體產(chǎn)生傷害，維持一個(gè)正常的生理活動[38-40]。在本研究中，POD與CAT在脅迫前期活力變化幾近相同，這可能因?yàn)镻OD和CAT具有相似的作用機(jī)理；但在脅迫6 d后POD與CAT的活性變化出現(xiàn)差異，2 μg·L-1PFOA濃度組的POD活性一直處于抑制狀態(tài)，在第15天又得到顯著抑制，而CAT的活性卻由誘導(dǎo)變?yōu)橐种茽顟B(tài)。究其原因可能是它們催化H2O2的方式不同，POD通過催化H2O2分解其他底物來消耗H2O2，而CAT是直接催化分解H2O2[41]，因此可以看出經(jīng)過長時(shí)間的PFOA脅迫后，中、高濃度組的POD活性遠(yuǎn)低于低濃度組。孫云之等[19]研究了PFOS對無齒蚌鰓的保護(hù)酶系的影響，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的SOD、CAT活性明顯高于對照組，且隨著暴露時(shí)間的延長逐漸升高，而POD的活性變化則比較復(fù)雜，這也可以證明POD雖然與CAT具有相似的作用機(jī)理，但是作用方式未必相同。

一旦生物體內(nèi)不斷產(chǎn)生和蓄積的自由基超過了機(jī)體可以清除的范圍，則會產(chǎn)生氧化壓力[42-44]，因此過多的自由基攻擊生物膜生成LPO，它可以通過改變生物膜的結(jié)構(gòu)，減少細(xì)胞膜的流動性，細(xì)胞膜由此產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化損傷。因此，不僅機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度可用LPO的含量判定，同時(shí)自由基的產(chǎn)生、生物活性及其抗氧化能力的強(qiáng)弱也可間接由LPO反映[45]。本研究中，在短時(shí)間或低濃度PFOA脅迫下，SOD、CAT和POD活性均表現(xiàn)為升高，LPO含量顯著減少，說明在該條件下，·O2-能有效被SOD歧化，同時(shí)H2O2被CAT和POD有效分解，這3種酶協(xié)同作用，不僅消除了活性氧物種，同時(shí)使脂質(zhì)過氧化作用明顯降低[19]。隨著時(shí)間的推移，抗氧化酶活性伴隨著生物受到高濃度或長時(shí)間污染物的脅迫時(shí)，通常會降低，20 μg·L-1濃度組的SOD活性在第6天達(dá)到最低點(diǎn)，CAT活性在脅迫期間基本處于抑制狀態(tài)，POD的活力也在逐漸遞減，在第21天降到最低。這說明PFOA的積累導(dǎo)致了一些組織的氧化損傷，未被及時(shí)清除的活性氧物種對抗氧化酶系統(tǒng)造成了破壞，造成細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)的破裂，活性氧含量大量積聚，此時(shí)各濃度組LPO含量均達(dá)到峰值，生物體處在較嚴(yán)重的中毒狀態(tài)。楊濤等[15]研究了苯并(b)熒蒽對翡翠貽貝內(nèi)臟團(tuán)抗氧化酶活性及脂質(zhì)過氧化物含量的變化，結(jié)果顯示，高濃度組的苯并(b)熒蒽實(shí)驗(yàn)組LPO含量在暴露15 d后顯著升高，與本研究結(jié)果基本一致，即由于抗氧化酶的活性被PFOA抑制，因此引起生物體脂質(zhì)過氧化，造成了機(jī)體組織和細(xì)胞的氧化損傷[44]。

3.2 PFOA脅迫下菲律賓蛤仔體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化酶活性的變化

EROD是存在于細(xì)胞膜上依賴細(xì)胞色素P450的重要生物轉(zhuǎn)化酶，它的活性與污染物的毒性效應(yīng)呈顯著正相關(guān)，可以作為監(jiān)測一些有機(jī)污染物的指標(biāo)，以探討污染物對機(jī)體的損害程度[46]。有研究表明，在一些有機(jī)污染物的影響下，雙殼貝類、對蝦和魚類通過大幅度的提高其自身組織的EROD活性進(jìn)行代謝解毒[34-35,38-39]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，與對照組相比，其他各濃度組的EROD活力都被明顯激活，并且激活程度和PFOA的濃度呈正比關(guān)系，與先前的研究相似。這表明菲律賓蛤仔在PFOA的脅迫下受到較為顯著的影響，應(yīng)激反應(yīng)比較明顯，同時(shí)也說明機(jī)體通過提升EROD的活性來應(yīng)對污染物帶來的影響。而中高濃度組的EROD活力在脅迫后期略有下降，這可能是由于PFOA的積累導(dǎo)致生物體產(chǎn)生耐受效應(yīng)，使EROD的活性提升有限。

GST是II相代謝酶家族的一員，當(dāng)污染物進(jìn)入生物體內(nèi)，經(jīng)過I相代謝形成中間產(chǎn)物，同時(shí)大量的活性氧物質(zhì)由此產(chǎn)生[17]，而GST可催化GSH與這些活性氧物質(zhì)結(jié)合，使之變成親水性的物質(zhì)排出機(jī)體外，從而達(dá)到解毒的效果，因此在污染物的影響下也會呈現(xiàn)激活的現(xiàn)象[47-49]。但是也有研究發(fā)現(xiàn)，GST的活性會隨著污染物濃度的升高或者種類的不同呈現(xiàn)被抑制的情況[50-51]，其解毒功能也會下降。本實(shí)驗(yàn)中，2和20 μg·L-1PFOA濃度組GST活性出現(xiàn)明顯激活現(xiàn)象，說明在PFOA脅迫下，機(jī)體短期可以提升GST的活性來進(jìn)行防御性解毒，以代謝相Ⅰ過程中產(chǎn)生的一級代謝物，而隨著脅迫時(shí)間的延長，GST的活性逐漸被抑制。這可能是由于生物體無法及時(shí)代謝在組織內(nèi)不斷積累的代謝物，從而導(dǎo)致GST酶受到傷害，機(jī)體則處于致毒損傷狀態(tài)，有研究認(rèn)為這也與污染物的代謝受到其他抗氧化系統(tǒng)的酶活性變化的影響有一定關(guān)系[52-53]。

本實(shí)驗(yàn)中菲律賓蛤仔組織抗氧化酶和生物轉(zhuǎn)化酶的活性發(fā)生變化，說明菲律賓蛤仔對PFOA不同脅迫階段產(chǎn)生響應(yīng)。隨著PFOA濃度的升高，菲律賓蛤仔組織的SOD、CAT、POD活性均呈現(xiàn)先促后抑的特點(diǎn)，LPO含量在脅迫期間先減少再增加，而EROD和GST活性則逐漸升高或降低，PFOA對菲律賓蛤仔已顯示出較明顯的毒性效應(yīng)，表明其對PFOA具有高敏感性，在濃度為0.2 μg·L-1時(shí)機(jī)體即可受到顯著的損傷。然而酶活性的變化受到多種因素制約，是一個(gè)動態(tài)的過程，這些因素可以是污染物種類和濃度，也可以是實(shí)驗(yàn)生物、環(huán)境條件等；LPO含量也可能隨著時(shí)間升高[29]。因此，在考慮利用生理生化指標(biāo)監(jiān)測環(huán)境中的PFOA時(shí)需要考慮多方面的條件和因素，不能僅依據(jù)某一種酶的活性，而是應(yīng)該將幾種酶甚至其他的生物標(biāo)志物結(jié)合起來分析，篩選出最合理最具指示性的生物和指標(biāo)[54]。本研究結(jié)果顯示，SOD、CAT、POD、EROD、GST活性和LPO含量非常敏感，雖然它們的變化規(guī)律并不一致，但均可在一定程度上反映出PFOA帶來的氧化脅迫的影響，因此可以將抗氧化酶系統(tǒng)(SOD、CAT、POD)與生物轉(zhuǎn)化酶(EROD、GST)、LPO含量結(jié)合起來一起指示早期海洋PFOA污染。

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◆

TheEffectsofPerfluorooctanoicAcid(PFOA)onEnzymeActivitiesinRuditapesphilippinarum

Liu Zhiyu1,2, Zhai Yuxiu1, Yao Lin1, Jiang Yanhua1, Li Fengling1,*，Wang Lianzhu1, Shang Derong1, Yang Yuanhao3, Guo Mengmeng1, Tan Zhijun1

1. Key Laboratory of Testing and Evaluation for Aquatic Product Safety and Quality, Ministry of Agriculture, Yellow Sea Fishery Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China2. Wuxi Fisheries College, Nanjing Agricultural University, Wuxi 214182, China3. Shanxi Fisheries Institute, Yellow River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Xi’an 710086, China

10.7524/AJE.1673-5897.20170113001

2017-01-13錄用日期2017-03-13

1673-5897(2017)3-695-10

X171.5

A

李風(fēng)鈴(1980—)，女，海洋生物學(xué)博士，助理研究員，主要研究方向?yàn)楹Ｑ笊锒纠韺W(xué)。

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2014DQ025)；國家科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)(2014FY230100)；陜西省水利科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015SLKJ-22)

劉芝余(1991-)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)楹Ｑ笊锒纠韺W(xué)，E-mail: 15195986641@163.com

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: lifl@ysfri.ac.cn

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Liu Z Y, Zhai Y X, Yao L, et al. The effects of perfluorooctanoic acid (PFOA) on enzyme activities in Ruditapes philippinarum [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(3): 695-704 (in Chinese)