趙 明， 劉曉翠， 崔曉雪， 邱祥春， 王 羽，3△， 魏成喜，3△

(1. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)第一臨床醫(yī)院， 2. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)， 3. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥物化學(xué)與藥理學(xué)研究所， 通遼 028000)

miRNA378*表達(dá)對(duì)柯薩奇B3病毒感染乳鼠心肌細(xì)胞凋亡、網(wǎng)腔鈣結(jié)合蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激伴侶蛋白表達(dá)的影響*

趙 明1， 劉曉翠2， 崔曉雪2， 邱祥春1， 王 羽2，3△， 魏成喜2，3△

(1. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)第一臨床醫(yī)院， 2. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)， 3. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥物化學(xué)與藥理學(xué)研究所， 通遼 028000)

目的研究沉默miRNA378*表達(dá)對(duì)柯薩奇B3病毒(CVB3)感染心肌細(xì)胞凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、網(wǎng)腔鈣結(jié)合蛋白(calumenin)影響。方法原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞分為：對(duì)照組(正常細(xì)胞)、柯薩奇病毒感染組(正常細(xì)胞+柯薩奇B3病毒)、miRNA378*沉默對(duì)照組(正常細(xì)胞+柯薩奇B3病毒+轉(zhuǎn)染miRNA378*空質(zhì)粒)、miRNA378*沉默組(正常細(xì)胞+柯薩奇B3病毒+轉(zhuǎn)染miRNA378*沉默質(zhì)粒)，各組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染和感染處理后置37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。檢測(cè)細(xì)胞α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、細(xì)胞凋亡率、網(wǎng)腔鈣結(jié)合蛋白、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路因子激活轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6)、轉(zhuǎn)錄因子C/EBP同源蛋白(CHOP)的表達(dá)。結(jié)果通過(guò)檢測(cè)ɑ-SMA蛋白，證實(shí)分離乳鼠細(xì)胞為心室肌細(xì)胞。TUNEL法檢測(cè)不同組心室細(xì)胞凋亡情況發(fā)現(xiàn)，柯薩奇病毒感染組心室肌細(xì)胞凋亡明顯，與柯薩奇病毒感染組心肌細(xì)胞相比較，miRNA378*沉默組心肌細(xì)胞凋亡細(xì)胞量明顯減少。與柯薩奇病毒感染組比較， Calumenin表達(dá)減少(P<0.01)，而GRP78、ATF6、CHOP表達(dá)增加(P<0.01)。結(jié)論CVB3病毒感染心肌細(xì)胞作用與miRNA378*，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并激活信號(hào)通路因子，心肌細(xì)胞凋亡增加。

心肌細(xì)胞；乳鼠；miRNA378*；柯薩奇B3病毒；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；網(wǎng)腔鈣結(jié)合蛋白 ；凋亡

病毒性心肌炎(viralmyocarditis, VMC)是由病毒(主要由柯薩奇病毒)感染引起的心肌局限性或彌漫性的急性或慢性炎性病變[1]，病變可累及心肌細(xì)胞實(shí)質(zhì)和/或間質(zhì)，導(dǎo)致心肌收縮力減低，射血分?jǐn)?shù)下降甚至無(wú)效射血，最終導(dǎo)致心力衰竭[2]。研究發(fā)現(xiàn)心力衰竭患者心臟中存在心肌細(xì)胞凋亡, 致使存活的心肌工作細(xì)胞數(shù)量減少，心臟射血能力降低，導(dǎo)致心力衰竭[3]。心肌細(xì)胞凋亡途徑眾多，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)通過(guò)其凋亡信號(hào)通路所介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡是新近發(fā)現(xiàn)的凋亡途徑[4]。 網(wǎng)腔鈣結(jié)合蛋白(calumenin)是一種位于心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)中具有調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)作用的鈣離子結(jié)合蛋白。microRNAs (miRNAs)是由內(nèi)源基因編碼的一類長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈分子RNA, 參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控，抑制靶mRNA轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)[5]。文獻(xiàn)報(bào)道：miRNA-378*能夠抑制H9c2心肌細(xì)胞calumenin表達(dá)[6]。但miRNA-378*對(duì)于柯薩奇B組病毒感染的心肌細(xì)胞中的凋亡、calumenin、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其凋亡信號(hào)通路是否具有作用以及是否通過(guò)抑制靶蛋白轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)來(lái)影響心肌細(xì)胞凋亡的整個(gè)通路尚不明確。本實(shí)驗(yàn)擬上調(diào)CVB3病毒感染心肌細(xì)胞miRNA-378*表達(dá)，觀察其對(duì)細(xì)胞凋亡、calumenin、ERS及其信號(hào)通路因子影響，進(jìn)一步揭示病毒性心肌炎并發(fā)心力衰竭發(fā)病機(jī)制，為在臨床工作提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物藥品與儀器

1～3 d Balb/c新生乳鼠購(gòu)置吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心, 許可證號(hào)：scxk(吉)2011-0004； Calumenin antibody購(gòu)于Bioss公司, GRP78 antibody，PERK antibody，P-PERK antibody，eIF2ɑ antibody，ATF4 antibody，CHOP antibody，購(gòu)于Boster公司，內(nèi)參抗體β-actin購(gòu)于wanleibio公司，慢病毒轉(zhuǎn)染miRNA-378*沉默質(zhì)粒由沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技公司合成；柯薩奇B3病毒，Woodruf親心肌株由吉林大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院提供。

1.2 乳鼠心肌細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

將乳鼠心臟放入培養(yǎng)皿中，將清洗后的心臟組織剪碎至1～3 mm3小塊。加入0.1%Ⅱ型膠原酶以及0.1%胰蛋白酶混合液，37℃消化25 min。離心7 min去上清。用PBS重懸沉淀，離心5 min，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，過(guò)200目篩網(wǎng)去除大塊組織。離心去上清后加入1 ml的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，放置到培養(yǎng)板中。2 h差速貼壁法可去除大量的成纖維細(xì)胞，將剩余較純的心肌細(xì)胞放置在培養(yǎng)板。24 h后按實(shí)驗(yàn)內(nèi)容將細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞濃度為5×104cells/ml，置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜，24 h可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.3 免疫組織化學(xué)方法鑒定乳鼠培養(yǎng)心肌細(xì)胞

各組乳鼠培養(yǎng)心肌細(xì)胞進(jìn)行免疫組化鑒定: 0.1%TritonX-100孵育;3%過(guò)氧化氫孵育;血清封閉; 一抗孵育;二抗孵育;辣根酶標(biāo)記;DAB顯色;蘇木素復(fù)染;鏡檢。

1.4 細(xì)胞接種與培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。隔天換液處理，接種密度為70%為宜，便于病毒感染。

1.5 慢病毒轉(zhuǎn)染

(1)準(zhǔn)備病毒：取出4℃保存的病毒，使用前輕輕搖勻。(2)感染目的細(xì)胞：病毒準(zhǔn)備好之后，從培養(yǎng)箱中拿出細(xì)胞開始實(shí)驗(yàn)。(3)使用移液器吸取準(zhǔn)確體積(病毒數(shù)與細(xì)胞數(shù)比值為100∶ 1)的病毒液加入準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基中。(4)在培養(yǎng)基中加入ploybrene(6 μg/ml)來(lái)提高病毒的感染效率。(5)吸去細(xì)胞中剩的培養(yǎng)基，在目的細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞中分別加入計(jì)算好的病毒液。(6)混勻后放于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育過(guò)夜。(7)24 h后將含有慢病毒的培養(yǎng)液更換成正常培養(yǎng)液(含有10%血清的DMEM培養(yǎng)基)，37℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)。

1.6 感染CVB3的乳鼠心肌細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)分組

乳鼠心肌細(xì)胞按照細(xì)胞濃度為5×104cells/ml接種于6孔板，并將其置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，心肌細(xì)胞隨機(jī)分成4組，每組3孔，對(duì)照組(正常細(xì)胞)、柯薩奇病毒感染組(正常細(xì)胞+柯薩奇B3病毒)、miRNA378*沉默對(duì)照組(正常細(xì)胞+柯薩奇B3病毒+轉(zhuǎn)染miRNA378*空質(zhì)粒)、miRNA378*沉默組(正常細(xì)胞+柯薩奇B3病毒+轉(zhuǎn)染miRNA378*沉默質(zhì)粒)。其中兩組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miRNA378*空質(zhì)粒和miRNA378*沉默質(zhì)粒，處理24 h后，取3組細(xì)胞(1組正常細(xì)胞和2組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞)與100 PFU的CVB3共同孵育1 h，棄上清，加入正常培養(yǎng)液作為CVB感染組；設(shè)立細(xì)胞對(duì)照組(僅加入培養(yǎng)液，不進(jìn)行病毒感染)，將4組心肌細(xì)胞在37℃，置于CO2培養(yǎng)箱中3 d。

1.7 TUNEL法檢測(cè)各組心肌細(xì)胞凋亡

各組心肌細(xì)胞經(jīng)過(guò)TUNEL法標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)步驟：透化；PBS漂洗；封閉；滴加TUNEL反應(yīng)液50 μl；保濕、避光、37℃孵育60 min；滴加Converter-POD 50 μl；保濕、37℃孵育30 min；DAB顯色：加DAB底物50 μl；蘇木素復(fù)染；顯微鏡下觀察染色效果，400×鏡下拍照。

1.8Westernblot檢測(cè)各組心肌細(xì)胞calumenin蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激伴侶蛋白GRP78及ATF6、CHOP表達(dá)

各組乳鼠心肌細(xì)胞經(jīng)下列實(shí)驗(yàn)步驟：蛋白質(zhì)抽提；蛋白質(zhì)定量；取15 μl的樣品進(jìn)行SDS-PAGE；轉(zhuǎn)印至PVDF膜；封閉；孵育一抗；孵育二抗；ECL底物發(fā)光；圖像保存。普通抗體的封閉液、一抗孵育液、二抗孵育液為5%脫脂奶粉溶液。檢測(cè)各組心肌細(xì)胞calumenin蛋白(1∶1 000)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78, GRP78)(1∶1 000)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路因子激活轉(zhuǎn)錄因子6(activation transcription factor 6, ATF6)(1∶1 000)、轉(zhuǎn)錄因子C/EBP同源蛋白(transcription factors c/ebp homologue protein，CHOP)(1∶1 000)表達(dá)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 乳鼠心肌細(xì)胞鑒定

培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞經(jīng)免疫組化實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)出心肌細(xì)胞特有的ɑ-SMA蛋白，確定為心室肌細(xì)胞(圖1)

Fig.1Mouse myocardium celle(×400) A： Primary culture observed under microscope; B： Immunocytochemistry of culturing myocardial cell

2.2 心肌細(xì)胞凋亡的比較

用TUNEL 法檢測(cè)對(duì)照組心肌細(xì)胞僅有少量凋亡的細(xì)胞(凋亡率6.83%±0.71%)，柯薩奇病毒感染組心肌細(xì)胞凋亡明顯，凋亡率60.37%±7.20% (P<0.01), 與柯薩奇病毒感染組心肌細(xì)胞相比較，miRNA378*沉默組心肌細(xì)胞凋亡細(xì)胞量明顯減少，凋亡率為46.6%±8.3%(P<0.01，圖2)。

Fig.2Myocardial apoptosis in each group(×200) A： Control group; B： Coxsackie virus B3 infecton group; C： miRNA378*silence control group; D： miRNA378*silence group

2.3心肌細(xì)胞calumenin蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激伴侶蛋白GRP78及ATF6、CHOP表達(dá)

與對(duì)照組相比較，柯薩奇病毒感染組心肌細(xì)胞calumenin蛋白表達(dá)減少(P<0.01)，GRP78、ATF6、CHOP表達(dá)增加(P<0.01)；與柯薩奇病毒感染組相比較，miRNA378*沉默組calumenin蛋白表達(dá)顯著減少(P<0.01)； miRNA378*沉默組GRP78、ATF6、CHOP表達(dá)顯著增加(P<0.01，圖3，表1)。

Fig.3Expression change of Calumenin, GRP78 ATF6 and CHOP A： Control group; B： Coxsackie virus B3 infecton group; C： miRNA378*silence control group; D： miRNA378*silence group; GRP78: Glucose regulated protein 78; ATF-6: Activation transcription factor 6; CHOP: Transcription factors c/ebp homologue protein

GroupCalumeninGRP78 ATF6 CHOP A2265±192880±79753±82673±42B1335±119??1693±141??1355±121??1288±137??C1541±1341625±1331091±117716±126D613±42##2502±315##2611±221##2698±244##

A： Control group; B： Coxsackie virus B3 infecton group; C：miRNA378*silence control group; D： miRNA378*silence group; GRP78: Glucose regulated protein 78; ATF6: Activation transcription factor 6; CHOP: Transcription factors c/ebp homologue protein

**P<0.01vsA group;##P<0.01vsB group

3 討論

心肌細(xì)胞calumenin與RyR2通道及鈣泵(SERCA2a) 相互作用來(lái)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞鈣釋放、回?cái)z與儲(chǔ)存，共同維持鈣循環(huán)穩(wěn)態(tài)[7]。文獻(xiàn)報(bào)道，病毒性心肌炎時(shí)，心肌細(xì)胞calumenin蛋白不但表達(dá)明顯減少，而且與SERCA2a結(jié)合能力減弱，從而使心肌細(xì)胞鈣循環(huán)穩(wěn)態(tài)失衡，心臟功能降低[8]。同時(shí)，病毒性心肌炎又可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)，并激活ERS凋亡信號(hào)通路引起心肌細(xì)胞凋亡，引發(fā)心力衰竭[9]。研究發(fā)現(xiàn)calumenin可以緩解心肌細(xì)胞ERS并減少ERS介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量[10]，重度心力衰竭患者miRNA-378*表達(dá)顯著下降，隨著患者心功能好轉(zhuǎn)，miRNA-378*表達(dá)也明顯增加[11]。

miRNA-378 和miRNA-378*是一個(gè)基因出來(lái)的產(chǎn)物，叫正義鏈和反義鏈 。microrna前體有發(fā)卡結(jié)構(gòu)，在成熟過(guò)程中發(fā)卡結(jié)構(gòu)被剪掉，形成miRNA-378 和miRNA-378*，也叫左臂和右臂。通常正義鏈有功能，反義鏈無(wú)功能被降解。但是近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)反義鏈有時(shí)候有功能，可以協(xié)助正義鏈功能，也可以拮抗正義鏈，或者和正義鏈功能毫無(wú)關(guān)系。本研究根據(jù)上述資料和本課題組研究結(jié)果，提出如下科學(xué)假說(shuō)：柯薩奇B3病毒通過(guò)干預(yù)心肌細(xì)胞miRNA-378*表達(dá)來(lái)影響calumenin表達(dá)，進(jìn)而引起ERS并通過(guò)ERS凋亡信號(hào)通路：ATF6→CHOP介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)在成功培養(yǎng)原代培養(yǎng)乳鼠的心室肌細(xì)胞的基礎(chǔ)上，采用干擾技術(shù)下調(diào)miRNA-378*的表達(dá)，并與CVB3病毒感染處理后的心室肌細(xì)胞。TUNEL檢測(cè)發(fā)現(xiàn)感染CVB3病毒的心室肌細(xì)胞凋亡率提高，而下調(diào)miRNA-378*后，心室肌細(xì)胞的凋亡率有所下降。證明下調(diào)miRNA-378*的表達(dá)可緩解CVB3病毒所致的心室肌細(xì)胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是誘發(fā)凋亡的機(jī)制之一。本研究進(jìn)一步探討miRNA-378*的作用是否與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)，檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子伴侶GRP78及效應(yīng)蛋白ATF6，CHOP，發(fā)現(xiàn)GRP78，ATF6，CHOP在CVB3病毒感染的心室肌細(xì)胞中均上調(diào)，而下調(diào)miRNA-378*后，3個(gè)蛋白表達(dá)量增加。說(shuō)明miRNA-378*緩解心室肌細(xì)胞凋亡不通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路。最后，calumenin蛋白的表達(dá)也進(jìn)行了檢測(cè)，下調(diào)miRNA-378*的心室肌細(xì)胞可提高因感染CVB3病毒而導(dǎo)致的表達(dá)減少。本研究結(jié)果部分揭示miRNA-378*可緩解病毒性心肌炎所致的凋亡，而與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激無(wú)關(guān)，具體作用還需以后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步闡明。

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ThecorrelationresearchonmiRNA378*andcalumenin，endoplasmicreticulumstress，apoptosisinsucklingmousemyocardialcellsinfectedwithcoxsackievirusB3

ZHAO Ming1, LIU Xiao-cui2, CUI Xiao-xue2, QIU Xiang-chun1, WANG Yu2,3△, WEI Cheng-xi2,3△

(1. The Inner-Mongolia National University First Clinical Hospital, 2. The Inner-Mongolia National University, 3. The Inner-Mongolia National University Medical Chemistry and Pharmacology Institute, Tongliao 028000, China)

Objective: To investigate the effects of silencing miRNA378*on apoptosis, endoplasmic reticulum stress and calumenin of cardiomyocyte with coxsackie virus B3 (CVB3) infection.MethodsPrimary cultured suckling mouse myocardium were divided into control group (normal cell), coxsackie virus infection group (normal cell and coxsackie virus B3), miRNA378*control group (normal cell +coxsackie virus B3+miRNA378*empty plasmid), miRNA378*silencing plasmid group(normal cells + coxsackie virus B3 + miRNA378*silencing plasmid). Four groups of cells were transfected, infected and treated in CO2incubator at 37℃. The α-SMA protein, cell apoptosis rate, calumenin, glucose regulated protein 78 (GRP78) , activation transcription factor 6(ATF6) and transcription factors c/ebp homologue protein (CHOP) in endoplasmic reticulum were analyzed.ResultsBy detecting α-SMA protein, the isolated suckling mouse ventricular myocardium were confirmed. TUNEL detection of different groups of ventricular cell apoptosis found that coxsackie virus group of ventricular myocytes apoptosis was significant. Compared with the coxsackie virus infection group of myocardial cells, miRNA378*silencing plasmid expression of cardiomyocyte apoptosis cells significantly reduced(P<0.01). The expressions of GRP78, ATF6 and CHOP were increased compared with those infected by Coxsackie virus infection (P<0.01), while the expressions of calumenin were decreased (P<0.01).ConclusionCVB3 infected myocardial cells effected miRNA378*expression. It can trigger endoplasmic reticulum stress and activates signaling pathway factor and increase myocardial cell apoptosis.

cardiomyocytes; suckling mice; miRNA378*; coxsackie virus B3; endoplasmic reticulum stress; calumenin; apoptosis

R331.3；R-332

A

1000-6834(2017)04-304-04

內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金(2015MS08153)

2016-06-07

2016-11-21

△

Tel: 0475-8314234； E-mail: shen348@126.com； weichengxi1224@163.com

10.12047/j.cjap.5461.2017.074