譚靜，宋欣密，傅曉斌，唐明珠，吳帆，華啟云，李紅亮

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中華蜜蜂化學(xué)感受蛋白CSP1的功能模式分析及亞細(xì)胞定位

譚靜1，宋欣密1，傅曉斌1，唐明珠1，吳帆1，華啟云2，李紅亮1

（1中國計量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/生物計量及檢驗檢疫技術(shù)浙江省重點實驗室，杭州 310018；2金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，浙江金華 321000）

【目的】研究中華蜜蜂（，簡稱中蜂）重組化學(xué)感受蛋白CSP1與不同化學(xué)信息素的結(jié)合功能、模式及其亞細(xì)胞定位，明確觸角特異表達(dá)的CSP1蛋白功能?！痉椒ā繉⒖寺〉闹蟹錁?gòu)建至pET-32a(+)載體并轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)菌中，挑取單克隆菌落接種于LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜后按1%（V/V）進(jìn)行轉(zhuǎn)接，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600≈0.4左右時，加入IPTG至終濃度為1 mmol·L-1后繼續(xù)誘導(dǎo)5 h。將誘導(dǎo)好的CSP1大腸桿菌菌液離心棄上清，再加入細(xì)菌裂解液超聲破碎，離心后上清用鎳柱對CSP1重組蛋白進(jìn)行親和層析純化，再經(jīng)PBS透析液透析后，最終獲得可溶的具有生物活性的CSP1重組蛋白。設(shè)定熒光分光光度計的激發(fā)波長為281 nm，測定競爭性熒光探針1-NPN與CSP1的相互作用，用Scatchard方程計算其解離常數(shù)，再計算獲得CSP1與各種候選化學(xué)信息素的親和力。以CSPMbraA6晶體結(jié)構(gòu)（PDB代碼：1n8v）為模板，通過同源建模和分子對接解析CSP1蛋白與化學(xué)信息素的結(jié)合模式，根據(jù)MolDock Score選出最佳對接模型進(jìn)行作用機(jī)理分析，獲得結(jié)合時配基周圍的CSP1殘基分布以及氫鍵產(chǎn)生情況，以此獲得信息素與CSP1的結(jié)合模式。最后將CSP1免疫注射兔子獲得多克隆抗體，并對中蜂工蜂觸角進(jìn)行低溫固定、脫水和包埋后進(jìn)行超薄切片，然后對樣品切片進(jìn)行免疫膠體金電鏡定位，以解析CSP1在觸角感器中的亞細(xì)胞分布?！窘Y(jié)果】成功誘導(dǎo)獲得可溶性的重組中蜂CSP1蛋白，利用熒光光譜分析1-NPN與CSP1的解離常數(shù)1-NPN為2.1 μmol·L-1，結(jié)合位點數(shù)為0.99，表明結(jié)合時基本以1﹕1結(jié)合，線性相關(guān)系數(shù)為0.9933。在9種化學(xué)信息物質(zhì)中，CSP1與兩種蜜蜂蜂王信息素成分對羥基苯甲酸甲酯(HOB)和9-羰基-2癸烯酸（9-ODA），和植物揮發(fā)物成分3-蒈烯均具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，其中與CSP1親和力最強(qiáng)的對羥基苯甲酸甲酯的[50]和解離常數(shù)D分別達(dá)到10.1和7.68 μmol·L-1。分子對接顯示不同配基與CSP1的結(jié)合分別是通過與CSP1疏水腔中特定氨基酸殘基（或借助于氫鍵）作用結(jié)合。典型的如CSP1與HOB相互作用過程中，預(yù)測主要由8個氨基酸殘基貢獻(xiàn)能量，包括4個疏水性殘基（Phe30、Phe44、Leu70和Phe85），3個極性中性殘基（Tyr26、Tyr27和Ser41）以及1個酸性殘基（Asp40），其中Asp40中兩個羧基上的氧原子分別與HOB苯環(huán)中羥基上的氧原子分別產(chǎn)生一個氫鍵。免疫電鏡定位結(jié)果顯示CSP1主要表達(dá)于板形感器周圍附屬支持細(xì)胞中，少量表達(dá)于感器內(nèi)部，這與氣味結(jié)合蛋白的定位存在明顯區(qū)別?！窘Y(jié)論】中蜂CSP1與兩種蜂王信息素成分和某些植物花香成分具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，集合了信息素結(jié)合蛋白和普通氣味結(jié)合蛋白的功能和相似的作用模式，但其亞細(xì)胞定位與氣味結(jié)合蛋白存在明顯區(qū)別，顯示化學(xué)感受類蛋白生理特征的多樣性。

中華蜜蜂；化學(xué)感受蛋白；配基結(jié)合功能；分子對接；免疫細(xì)胞化學(xué)定位

0 引言

【研究意義】在復(fù)雜的自然環(huán)境中，昆蟲通過其敏銳的化學(xué)通訊系統(tǒng)來識別所處環(huán)境中的各種化學(xué)信息物質(zhì)，并做出反應(yīng)[1]。昆蟲對性信息素以及植物揮發(fā)物的信息識別主要通過嗅覺系統(tǒng)，但是某些昆蟲觸角化學(xué)感受蛋白也被證實能夠感受性信息素及植物揮發(fā)物成分[2-3]。而在昆蟲化學(xué)感受系統(tǒng)中，往往存在著兩類酸性、低分子量的蛋白，即氣味結(jié)合蛋白（odorant- binding proteins，OBPs）和化學(xué)感受蛋白（chemosensory proteins， CSPs），其中根據(jù)功能的差異，OBPs又被分為普通氣味結(jié)合蛋白（general odorant-binding proteins，GOBPs）和信息素結(jié)合蛋白（pheromone- binding proteins，PBPs）[4]，CSPs由于最早發(fā)現(xiàn)于昆蟲化學(xué)感受器官，因此被認(rèn)為與感受化學(xué)信息有關(guān)，故被稱為化學(xué)感受蛋白[5-6]。作為中國的本土蜜蜂，中華蜜蜂（，簡稱中蜂）善于采集零星蜜源，具有靈敏發(fā)達(dá)的嗅覺和化學(xué)感受系統(tǒng)[7]。觸角是蜜蜂重要的嗅覺器官，除了高豐度地表達(dá)OBPs外，筆者團(tuán)隊前期發(fā)現(xiàn)了一個高豐度表達(dá)于工蜂觸角的化學(xué)感受蛋白CSP1[8]，鑒定其是否參與對性信息素及植物揮發(fā)物的化學(xué)感受識別功能，將對于明確觸角獨特CSPs蛋白功能，以及豐富中蜂甚至昆蟲對化學(xué)信息素的化學(xué)感受機(jī)制，都具有重要的理論意義。【前人研究進(jìn)展】OBPs和CSPs廣泛存在于昆蟲的化學(xué)通訊系統(tǒng)中，二者分別含有6個和4個保守的半胱氨酸，分別形成3對和2對二硫鍵。典型的OBPs一般特異表達(dá)于觸角等嗅覺器官，與嗅覺功能相關(guān)；而作為昆蟲化學(xué)通訊系統(tǒng)的重要組成部分，CSPs除具有化學(xué)感受功能外，還具有復(fù)雜的生理功能，如肢體再生[9]、胚胎發(fā)育[10]，甚至型變中的行為調(diào)控[11]等。然而愈來愈多報道證明許多CSPs也體現(xiàn)了與OBPs類似的嗅覺功能和特征，如在苜蓿盲蝽（）[12-13]、西花薊馬（）[14]和煙粉虱（）[15]中，CSPs參與包括驅(qū)避性氣味在內(nèi)的不同寄生植物揮發(fā)物的識別；在沙漠蝗（）[16]、竹節(jié)蟲（）[17]和日本弓背蟻（）[18]中，CSPs也能與昆蟲信息揮發(fā)物高親和力結(jié)合。由于CSP1高豐度地表達(dá)于工蜂觸角，因此CSP1有可能與中蜂的化學(xué)感受和嗅覺生理功能有著密切的聯(lián)系。蜜蜂的化學(xué)感受蛋白家族主要包括6個CSPs，且這些CSPs的表達(dá)部位與表達(dá)時期各不相同，而功能方面則包含了從胚胎發(fā)育、化學(xué)感受信號傳導(dǎo)到角質(zhì)層的合成等[8,19]不同的作用功能。如意大利蜜蜂（，簡稱意蜂）中CSP5主要參與了胚胎表皮生成[10]，CSP3主要與幼蟲信息素中的脂肪酸成分結(jié)合[20]。而中蜂的CSP3則發(fā)現(xiàn)表達(dá)于工蜂觸角B型毛形感器[21]，也可與某些植物揮發(fā)物結(jié)合，因此可能作為中蜂化學(xué)感受系統(tǒng)的一部分，在其搜尋蜜源時作為氣味分子運載體發(fā)揮一定的作用[3]。【本研究切入點】在前期研究中，鑒定了中蜂的一個化學(xué)感受蛋白CSP1[22]，并發(fā)現(xiàn)其高豐度地表達(dá)于工蜂觸角[8]，暗示CSP1很可能與中蜂的嗅覺和化學(xué)感受功能密切相關(guān)。本研究從CSP1的體外功能、作用模式以及亞細(xì)胞定位等3方面對中蜂CSP1基因功能進(jìn)行深入解析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對中蜂的一個觸角高豐度表達(dá)的化學(xué)感受蛋白CSP1進(jìn)行結(jié)合功能和模式分析及亞細(xì)胞定位。包括獲得重組的中蜂CSP1蛋白；利用熒光競爭試驗解析CSP1與各種化學(xué)信息素的結(jié)合功能；通過分子對接解析CSP1與各種化學(xué)信息分子的作用模式及可能起主要作用的氨基酸關(guān)鍵位點；利用免疫電鏡技術(shù)獲得CSP1在工蜂觸角上的亞細(xì)胞定位情況。

1 材料與方法

試驗于2016 年在中國計量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/生物計量及檢驗檢疫技術(shù)浙江省重點實驗室完成。

1.1 試劑與儀器

中蜂CSP1重組蛋白質(zhì)粒pET-32a(+)/CSP1由筆者實驗室保存于大腸桿菌DH5中；凝膠回收和質(zhì)粒提取試劑盒、pMD18-T載體以及實驗所需內(nèi)切酶均購于TaKaRa公司；鎳柱ProteinIsoTMNi2+-NTA Resin購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；Ampicillin、甲醇和各種磷酸鹽等化學(xué)試劑均購自上海生工生物工程股份有限公司；9-ODA（純度＞95 %）為中國科學(xué)院西雙版納植物園文平博士饋贈，其他所有化學(xué)信息素和氣味信息（純度＞97%及以上）均購自上海百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 中蜂CSP1重組蛋白的誘導(dǎo) 將克隆的中蜂[22]構(gòu)建至pET-32a (+)載體中，獲得的pET-32a (+)/CSP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21()感受態(tài)菌中，平板涂布后，挑取單克隆菌落接種于5 mL LB培養(yǎng)基（含氨芐青霉素60 μg·mL-1）中，37℃ 220 r/min 振蕩培養(yǎng)過夜，次日按1%（V/V）接種量轉(zhuǎn)接 200 mL LB培養(yǎng)基（含氨芐青霉素60 μg·mL-1），繼續(xù)培養(yǎng)至 OD600≈ 0.4左右時，向原菌液加入 IPTG 至終濃度為 1 mmol·L-1，30℃ 200 r/min誘導(dǎo)5 h。

1.2.2 中蜂CSP1重組蛋白的純化 將200 mL誘導(dǎo)好的CSP1大腸桿菌菌液，離心棄上清，加入5 mL的細(xì)菌裂解液放置30 min后，超聲破碎15 min，離心后取上清，利用鎳柱對表達(dá)于細(xì)胞裂解上清液內(nèi)的CSP1重組蛋白進(jìn)行親和層析純化，最后經(jīng)過PBS透析液（pH 7.4）透析72 h后，經(jīng)SDS-PAGE鑒定后，最終獲得可溶的具有生物活性的CSP1重組蛋白，利用Bradford法對CSP1重組蛋白濃度進(jìn)行測定和定量，并置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 中蜂CSP1蛋白與1-NPN熒光探針的相互作用 利用RF-5301PC型熒光分光光度計（日本島津公司）研究CSP1與1-NPN的相互作用，測試1-NPN 是否可作為熒光報告子[23]。設(shè)定熒光分光光度計的激發(fā)波長為281 nm，熒光發(fā)射與激發(fā)狹縫寬度為5 nm，掃描范圍為290—500 nm。用PBS緩沖液將CSP1重組蛋白稀釋至1 μmol·L-1，取3 mL于石英比色皿中，并以100 μmol·L-1的 1-NPN 溶液進(jìn)行滴定，每次混勻靜止3 min，記錄蛋白最大熒光發(fā)射波長處的熒光強(qiáng)度。根據(jù)下列Scatchard方程[24]對光譜數(shù)據(jù)線性化：

式中，[D]為總1-NPN濃度，[]為體系中游離1-NPN濃度，為重組蛋白與熒光報告子的結(jié)合常數(shù)，[P]為試驗中CSP1的濃度，為二者結(jié)合位點數(shù)。

1.2.4 中蜂CSP1蛋白的熒光競爭試驗 1-NPN 作為熒光報告子，利用競爭結(jié)合試驗[3]來研究候選配基與中蜂CSP1重組蛋白的解離常數(shù)。測試時將9種不同配基用甲醇配制成濃度為1 mmol·L-1，并分別逐次地加入到CSP1與1-NPN的混合液中，記錄體系最大熒光發(fā)射光譜。根據(jù)以下公式[25]計算各個配基的解離常數(shù)D：

式中，[50]為50%的熒光報告子被替換時候選配基的濃度，[1-NPN]是混合液中游離的1-NPN濃度，1-NPN為CSP1與1-NPN的解離常數(shù)。

1.2.5 中蜂CSP1蛋白與氣味信息的分子對接 CSP1的預(yù)測三維晶體結(jié)構(gòu)是由SWISS-MODEL工作區(qū)[26]基于甘藍(lán)夜蛾（）的CSPMbraA6晶體結(jié)構(gòu)（PDB entry code，1n8v）[27]中預(yù)測獲得。所有信息氣味物質(zhì)的3D結(jié)構(gòu)均是從NCBI的PubChem中下載獲得。利用Molegro Virtual Docker（MVD）4.2軟件將氣味物質(zhì)的3D結(jié)構(gòu)與CSP1蛋白預(yù)測晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行對接，其中根據(jù)MolDock Optimizer和MolDock Score兩項指標(biāo)作為搜索標(biāo)準(zhǔn)和評分依據(jù)[28]。根據(jù)MolDock Score選出最佳對接模型進(jìn)行作用機(jī)理分析，獲得結(jié)合時配基周圍的CSP1殘基分布以及氫鍵產(chǎn)生情況，以此獲得各種氣味信息與CSP1的結(jié)合模式。

1.2.6 中蜂CSP1蛋白的膠體金免疫定位 將純化后的中蜂CSP1重組蛋白按文獻(xiàn)[29]多抗制備方法免疫注射新西蘭大白兔，免疫獲得多克隆抗體。先對中蜂觸角進(jìn)行低溫固定、脫水、滲透、包埋、聚合后進(jìn)行超薄切片，然后對樣品切片進(jìn)行免疫膠體金標(biāo)記：將附有切片的載網(wǎng)置于ddH2O，潤濕5 min；0.01 mol·L-1PBS（含有1% BSA、0.05% TritonX-100、0.05% Tween20 pH 7.4）常溫封閉5 min；CSP1兔抗用0.01 mol·L-1PBS（含有1% BSA、0.05% Tween20 pH 7.4）稀釋50倍，將載網(wǎng)置于稀釋好的抗體上孵育過夜（同時做空白對照）；洗滌之后用稀釋100倍的結(jié)合有金顆粒的二抗標(biāo)記1 h；洗滌后用3%的醋酸雙氧鈾染色5 min，再用檸檬酸鉛染色3 min，最后用濾紙吸干，將載網(wǎng)裝載入日立H-7650型透射電子顯微鏡中觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 重組CSP1蛋白的誘導(dǎo)及純化

將pET-32a (+)/CSP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)菌中，用IPTG誘導(dǎo)CSP1重組表達(dá)，并用鎳柱進(jìn)行純化、經(jīng)PBS透析后最終獲得中蜂CSP1重組蛋白。蛋白誘導(dǎo)和純化后的SDS-PAGE電泳結(jié)果（考染結(jié)果）如圖1所示，泳道1為IPTG誘導(dǎo)前的對照，泳道2為IPTG誘導(dǎo)后結(jié)果，泳道3為純化后的CSP1重組蛋白。由圖1可明顯看出經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的CSP1重組蛋白產(chǎn)生表達(dá)以及純化情況。

M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)protein molecular weight marker；1、2：分別顯示未經(jīng)和經(jīng)過1 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)的含有pET32-CSP1質(zhì)粒的細(xì)菌裂解產(chǎn)物the whole of bacterial lysis proteins including pET32-CSP1 plasmid without and with induction of 1 mmol·L-1 IPTG, respectively；3：純化后的重組CSP1蛋白（圖右側(cè)箭頭所指）The purified recombinant CSP1 protein, which is labelled by an arrow on the right of the figure

2.2 中蜂CSP1與1-NPN報告子的熒光光譜分析

發(fā)射光譜掃描確定CSP1的激發(fā)波長在281 nm，用100 μmol·L-1的1-NPN溶液滴定1 μmol·L-1重組CSP1蛋白溶液，并進(jìn)行熒光掃描，如圖2所示，熒光光譜的多項式擬合以及Scatchard方程線性化擬合的相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到0.9993和0.9933，顯示擬合較好。根據(jù)公式（1），1-NPN與CSP1的解離常數(shù)1-NPN為2.10 μmol·L-1，結(jié)合位點數(shù)為0.99，表明CSP1與1-NPN結(jié)合時基本上為1﹕1結(jié)合，因此1-NPN能夠用于CSP1與候選化學(xué)信息素功能研究時的競爭性熒光報告子。

2.3 中蜂CSP1與不同化學(xué)信息配基的競爭性熒光結(jié)合分析

共選擇了9種化學(xué)信息配基進(jìn)行配基競爭性熒光結(jié)合試驗，如圖3所示，9種配基均能將1-NPN從CSP1的相對熒光值競爭至50%以下，所有配基的解離常數(shù)如表1所示，親和力最強(qiáng)的是兩種蜂王信息素成分對羥基苯甲酸甲酯（HOB）和9-ODA以及植物揮發(fā)物成分3-蒈烯，三者的解離常數(shù)D均＜10 μmol·L-1，其他6種配基與CSP1的解離常數(shù)均＞10 μmol·L-1。

A：不同濃度 1-NPN熒光配基在1 μmol·L-1的重組CSP1 蛋白中的熒光強(qiáng)度Fluorescence intensity of 1 μmol·L-1 recombinant CSP1 protein when different concentrations of 1-NPN added；B：1-NPN與CSP1結(jié)合的Scatchard 方程 Scatchard plot of 1-NPN with CSP1

表1 候選化學(xué)信息素與重組CSP1蛋白的結(jié)合試驗和分子對接

圖3 候選配基與熒光配基1-NPN于重組CSP1蛋白的競爭結(jié)合

2.4 以對羥基苯甲酸甲酯為代表的蛋白與配基作用模式分析

根據(jù)斜紋夜蛾的CSPMbraA6晶體結(jié)構(gòu)（PDB entry code，1n8v），利用SWISS-MODEL預(yù)測獲得CSP1的三維晶體結(jié)構(gòu)。HOB的3D結(jié)構(gòu)在NCBI（注冊碼：7456）中下載獲得。根據(jù)MVD中的MolDock能量得分情況，推測CSP1與HOB的最佳結(jié)合模式?；谠撃Ｐ驼业紺SP1與HOB相互作用過程中能量貢獻(xiàn)主要的8個氨基酸殘基，包括4個疏水性殘基（Phe30、Phe44、Leu70和Phe85），3個極性中性殘基（Tyr26、Tyr27和Ser41）和1個酸性殘基（Asp40）。其中主要有兩個-螺旋結(jié)構(gòu)：含Tyr26、Tyr27和Phe30，以及Asp40、Ser41和Phe44，與其他的兩個氨基酸殘基，共同組成了一個HOB的結(jié)合腔（圖4-A）。且預(yù)測HOB苯環(huán)中羥基上的氧原子分別與CSP1肽鏈中Asp40兩個羧基上的氧原子各產(chǎn)生一個氫鍵（圖4-B藍(lán)色虛線）。

2.5 中蜂CSP1蛋白的膠體金免疫定位

利用膠體金標(biāo)記免疫電鏡定位技術(shù)對中蜂化學(xué)感受蛋白CSP1進(jìn)行了觸角定位，結(jié)果如圖5所示，可以看出大量的金顆粒被標(biāo)記在嗅覺感器的板形感器周圍的附屬組織中（圖5-B、5-C），而對于蜜蜂的主要嗅覺感受器——板形感器內(nèi)部（圖5-D），雖然也有金顆粒的標(biāo)記，但在數(shù)量上明顯低于板形感器周圍的附屬細(xì)胞組織，這也與中蜂的普通氣味結(jié)合蛋白ASP2主要表達(dá)于嗅覺功能的板形感器[30]存在顯著差異，所以筆者認(rèn)為CSP1盡管能與信息素等氣味信息物質(zhì)結(jié)合，但與氣味結(jié)合蛋白的生物特征存在明顯區(qū)別。

A：對羥基苯甲酸甲酯與N端柔性區(qū)域的α螺旋作用。藍(lán)色代表提供疏水相互作用的殘基 HOB interacts with residues located on α-helices as well as N-terminal flexible region. Blue represented the residues that provide hydrophobic interactions；B：CSP1與對羥基苯甲酸甲酯作用過程中的氫鍵The hydrogen bonds of CSP1 interacting with HOB

圖5 基于免疫電鏡的中蜂CSP1觸角板形感器中的的亞細(xì)胞定位

3 討論

在前期研究中，CSP1基因被證實高豐度地表達(dá)于中蜂的工蜂觸角，表明其可能與中蜂的嗅覺功能有關(guān)[8,22]。為進(jìn)一步深入研究CSP1的結(jié)合功能和模式，本研究首先獲得了CSP1的重組蛋白，再利用競爭熒光法研究了基于1-NPN熒光配基的CSP1與9種候選化學(xué)信息素配基的結(jié)合作用。1-NPN是一種常用于研究昆蟲蛋白功能的熒光報告子，已經(jīng)應(yīng)用于多種CSPs的功能研究中[3,15,31]，本試驗中1-NPN與CSP1的D值為2.10 μmol·L-1，與其他昆蟲CSPs相比，如1-NPN與造紙胡蜂（）的CSP以及家蠶（）中CSP4的D值為分別為2.2和4.8 μmol·L-1[32-33]，均高于中蜂CSP1與1-NPN的D，表明CSP1與1-NPN的結(jié)合較強(qiáng)，1-NPN能夠用于CSP1與候選化學(xué)信息素功能研究時的競爭性熒光報告子。

在所有測試的化學(xué)信息素中，CSP1與兩種蜂王信息素成分——對羥基苯甲酸甲酯（HOB）和9-ODA結(jié)合力最強(qiáng)，HOB與9-ODA屬于蜂王上顎腺信息素成分之一[34]，其作用為抑制工蜂卵巢發(fā)育[35]，抑制工蜂培育新蜂王[36]，吸引工蜂聚集到蜂王周圍[37]。這與先前報道的另外兩個中蜂信息素結(jié)合蛋白ASP1[38]和OBP10[39]功能相似，而且CSP1與HOB的親和力要較二者更強(qiáng)，表明CSP1可能在工蜂感受蜂王上顎腺信息素的生殖調(diào)控和社會行為方面甚至較PBPs發(fā)揮著更重要的作用。

此外，本研究選用的5種植物揮發(fā)物成分包括2種烯烴、2種醇類和1種酮類，都是常見的花香味植物性揮發(fā)物[40-43]，均與CSP1具有較強(qiáng)的親和力，說明作為中蜂化學(xué)感受系統(tǒng)中的信息轉(zhuǎn)運蛋白，CSP1可能在中蜂訪花和尋找蜜源植物時作為氣味分子轉(zhuǎn)運載體而發(fā)揮一定的作用。在5種植物揮發(fā)物中CSP1與3-蒈烯親和力最強(qiáng)，由于3-蒈烯不但存在于很多植物花香成分中，還存在于對某些昆蟲如煙粉虱產(chǎn)生驅(qū)避作用的寄主植物中[44]，而煙粉虱CSP1也被證實與3-蒈烯有較強(qiáng)的親和力[15]，不過3-蒈烯是否能對中蜂產(chǎn)生驅(qū)避作用還需要進(jìn)一步研究。此外，-紫羅蘭酮是一種非常易于與各種昆蟲嗅覺相關(guān)蛋白結(jié)合的花香類物質(zhì)[13,45-47]，本研究中CSP1與其也有較強(qiáng)的親和力，解離常數(shù)D為14.84 μmol·L-1，親和力要強(qiáng)于中蜂另外一個化學(xué)感受蛋白CSP3（D為23.07 μmol·L-1[23]），與兩個中蜂信息素結(jié)合蛋白ASP1（D為14.69 μmol·L-1[38]）和OBP10（D為10.20 μmol·L-1[39]）較為接近，而明顯弱于中蜂氣味結(jié)合蛋白ASP2（與-紫羅蘭酮的D為5.14 μmol·L-1[3]），表明CSP1在-紫羅蘭酮這種蜜蜂偏好性氣味的識別和結(jié)合能力強(qiáng)于化學(xué)感受蛋白CSP3，接近信息素結(jié)合蛋白ASP1和OBP10，但不及普通氣味結(jié)合蛋白ASP2。

利用分子對接對CSP1與熒光競爭測試配基進(jìn)行能量預(yù)測（表1），作為蛋白與小分子結(jié)合時的自由能表征值，MolDock得分與熒光結(jié)合結(jié)果基本相符。另外發(fā)現(xiàn)在9種測試化學(xué)信息物質(zhì)中，有5種能與CSP1蛋白間產(chǎn)生氫鍵，且其中4種都與Asp40作用產(chǎn)生氫鍵，暗示Asp40在CSP1與化學(xué)信息素的結(jié)合過程中發(fā)揮著重要作用。在氣味結(jié)合蛋白AcerASP2與配基的結(jié)合過程中，其疏水結(jié)合腔中的Lys74和Lys51殘基也容易與配基產(chǎn)生氫鍵[23]。表明嗅覺相關(guān)蛋白與氣味信息物質(zhì)的結(jié)合很有可能是與信息分子和蛋白結(jié)合腔內(nèi)的某些特定氨基酸殘基間產(chǎn)生氫鍵密切相關(guān)。然而另一方面，3-蒈烯、-松油醇、月桂烯和-紫羅蘭酮等4種物質(zhì)均未與CSP1產(chǎn)生氫鍵，表明氫鍵的作用也是局限性的，還會受到氣味分子整體結(jié)構(gòu)與CSP1疏水內(nèi)腔微結(jié)構(gòu)的其他相互作用的綜合因素影響和限制。

通過免疫膠體金電鏡定位，CSP1主要被標(biāo)記在板形感器的周圍附屬組織；在板形感器內(nèi)部也有少量標(biāo)記。這與中蜂普通氣味結(jié)合蛋白ASP2主要表達(dá)于嗅覺功能的板形感器[30]存在差異顯著。此外，在中蜂化學(xué)感受蛋白CSP3的免疫定位中，幾乎所有的板形感器即嗅覺感器幾乎沒有任何標(biāo)記，但是發(fā)現(xiàn)板形感器周邊的裂縫內(nèi)的淺溝卻被明顯標(biāo)記[21]。因此，CSP1盡管能與蜂王信息素和某些化學(xué)信息物質(zhì)具有較強(qiáng)結(jié)合能力，但與普通氣味結(jié)合蛋白的組織定位存在明顯區(qū)別，與氣味結(jié)合蛋白的作用方式也大相徑庭。

4 結(jié)論

中蜂CSP1與兩種蜜蜂蜂王信息素成分對羥基苯甲酸甲酯（HOB）和9-ODA以及植物揮發(fā)物成分3-蒈烯具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，且與對羥基苯甲酸甲酯親和力最強(qiáng)。而CSP1的膠體金免疫電鏡定位試驗發(fā)現(xiàn)板形感器的內(nèi)部以及周圍附屬組織中均有金顆粒的標(biāo)記，但周圍附屬組織中的金顆粒多于感器內(nèi)部，這與普通氣味結(jié)合蛋白ASP2主要表達(dá)于嗅覺功能的板形感器存在差異，所以筆者認(rèn)為CSP1是一種能與信息素等物質(zhì)識別，但與其他嗅覺基因定位生理特征存在明顯區(qū)別的化學(xué)感受蛋白。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Functional mode and immunocytochemical localization of Chemosensory protein 1 (CSP1) in

TAN Jing1, SONG XinMi1, Fu XiaoBin1, TANG MingZhu1, Wu Fan1, HUA QiYun2, LI HongLiang1

(1College of Life Sciences, China Jiliang University/Zhejiang Provincial Key Laboratory of Biometrology and Inspection & Quarantine, Hangzhou 310018;2)

【Objective】The objective of this study is to research the functional mode with candidate semiochemicals and immunocytochemical localization of the recombinant chemosensory protein1 (CSP1) in Chinese honey bee,. It has an important theoretical significance for clarifying the function of CSP1, which is specifically expressed in antennae, and enriching the chemosensory mechanism of Chinese honey bee to semiochemicals. 【Method】was constructed into the pET-32a (+) vector and transferred into BL21 (DE3) competent. The single positive clone was inoculated on LB medium and cultured overnight (followed by 1% (v/v) transfer to the OD600≈0.4), then added the IPTG with a final concentration of 1 mmol·L-1and continued to be induced for 5 h. The recombinant CSP1 protein existing in the supernatant was purified by Ni2+-NTA affinity chromatography. The soluble recombinant CSP1 protein with biological activity was finally obtained after dialyzed by PBS (pH 7.4). When the excitation wavelength of the fluorescence spectrophotometer was 281 nm, the interaction between the fluorescent probe 1-NPN and CSP1 was determined. The dissociation constant was calculated by Scatchard equation, and the binding affinities of CSP1 with various candidate semiochemicals were also measured. Based on the CSPMbraA6 crystal structure (PDB entry code: 1n8v) as template, the binding model of CSP1 protein and semiochemicals was analyzed by homology modeling and molecular docking. In order to obtain the binding mode of pheromone and CSP1, according to MolDock Score, the best mechanism of the docking model was analyzed, and the hydrogen bonds between the ligand and the CSP1 residues were obtained. Finally, the polyclonal antibody of CSP1 was obtained by immunizing rabbits, and the antennae of worker bee were immobilized at low temperature, dehydrated and embedded. The subcellular distribution of CSP1 on the antennal sections samples were then immunogolded by colloidal gold and finally observed with the electron microscopy. 【Result】 After the soluble recombinant CSP1 protein was successfully induced and purified, the fluorescence quenching assay was used to obtain the dissociation constant1-NPNbetween CSP1 and 1-NPN as 2.1 μmol·L-1. The number of binding siteswas 0.99, indicating the bind ratio of CSP1 and 1-NPN was 1﹕1. In the candidate 9 semiochemicals, CSP1 and two queen pheromone components: p-hydroxybenzoic acid methyl ester (HOB) and (E)-9-Oxodec-2-enoic acid (9-ODA), and plant volatile components, 3-carene had a strong ability to bind, the [50] and dissociation constantDof the most strongly bound HOB was 10.1 and 7.68 μmol·L-1, respectively. The results of molecular docking showed that the binding of various ligands to CSP1 was due to some specific amino acid residues (or by means of the hydrogen bonds) in the hydrophobic cavity of CSP1. Typically, the interaction between CSP1 and HOB is predicted by the contribution of eight amino acid residues, including four hydrophobic residues (Phe30, Phe44, Leu70 and Phe85), three polar neutral residues (Tyr26, Tyr27 and Ser41) and one acidic residue (Asp40). The two hydrogen bonds were produced between the oxygen atoms on the two carboxyl groups in Asp40 and the oxygen atoms on the hydroxyl group in the HOB benzene ring, respectively. The results of immuno-electron microscopy showed that CSP1 was mainly expressed in the ancillary supporting cells around the sensilla placodea, while only slightly expressed in the inner area of sensilla placodea. It was significantly different from the localization of odorant binding proteins.【Conclusion】 CSP1 ofhas a strong ability to bind two queen pheromone components and some plant floral scents, and concentrates the function of pheromone binding protein and general odorant-binding protein. Although their functional modes are similar, there are significant differences in the antennal subcellular localization between CSP1 and odorant-binding proteins, showing the physiological characteristics variation of chemoreceptive proteins.

; chemosensory protein; functional mode; molecular docking; immunocytochemical localization

2017-02-21；接受日期：2017-03-20

國家自然科學(xué)基金（31372254）、金華市農(nóng)業(yè)公益項目（2016-4-001）

譚靜，E-mail：786867455@qq.com。通信作者李紅亮，E-mail：hlli@cjlu.edu.cn