N乙酰半胱氨酸保護(hù)下給藥釓二乙三胺五乙酸后慢性腎衰大鼠的尿液代謝組學(xué)研究

萬傳玲 薛蓉++湛游洋 李曉晶 裴奉奎

摘要N乙酰半胱氨酸（NAC）有減輕造影劑引發(fā)腎損傷的作用，但其作用機(jī)制尚未明確。本研究采用基于1H NMR的代謝組學(xué)方法，結(jié)合正交偏最小二乘法判別分析（OPLSDA），在NAC保護(hù)下對慢性腎衰大鼠給藥造影劑釓二乙三胺五乙酸（GdDTPA）， 通過分析大鼠尿液中內(nèi)源性代謝物的變化，研究了NAC對慢性腎衰大鼠的保護(hù)機(jī)制。結(jié)果表明，慢性腎衰大鼠能量代謝、尿素循環(huán)等代謝通路發(fā)生紊亂。給藥GdDTPA后，大鼠尿液中膽堿、N氧三甲胺、鄰羥基苯乙酸苯酯、對羥基苯乙酸苯酯、馬尿酸、甘氨酸、煙酸、?；撬釡p少，尿囊素增加； 而在NAC保護(hù)下相關(guān)代謝產(chǎn)物向模型組的恢復(fù)，說明NAC對GdDTPA引發(fā)的大鼠腸道細(xì)菌代謝、肝線粒體代謝、犬尿氨酸代謝紊亂及氧化損傷具有一定修復(fù)作用。NAC對尿素循環(huán)代謝的改善可能減輕大鼠體內(nèi)的腎損傷，而其對細(xì)胞中谷胱甘肽的補(bǔ)充可能減輕GdDTPA造成的氧化損傷。

[KH*3/4D][HTH]關(guān)鍵詞代謝組學(xué)；核磁共振；慢性腎衰；釓二乙三胺五乙酸；N乙酰半胱氨酸

1引 言

磁共振成像（Magnetic resonance imaging， MRI）是當(dāng)前臨床診斷中最有力的檢測手段之一[1，2]，為提高成像對比度，超過30%的MRI診斷需要使用造影劑。釓造影劑（Gadoliniumbased contrast agents， GBCAs）在人體內(nèi)具有較高的熱力學(xué)和動力學(xué)穩(wěn)定性，且易于排出體外，是目前臨床應(yīng)用最廣泛的造影劑[3]。2006年， Grobner提出腎源性系統(tǒng)性纖維化（Nephrogenic systemic fibrosis， NSF）的發(fā)生可能與腎衰患者在MRI診斷時使用釓造影劑有關(guān)[4]，釓造影劑的安全性問題再次得到關(guān)注。NSF與釓造影劑的相關(guān)性研究有很多，但其發(fā)病機(jī)理尚未明確，且診斷后尚無有效的治療方法[5]，因此NSF的早期發(fā)現(xiàn)與預(yù)防至關(guān)重要。

N乙酰半胱氨酸（Nacetylcysteine， NAC）是合成谷胱甘肽的前體，最早應(yīng)用于囊胞性纖維癥的治療，但近年來對其抗氧化性的研究越來越廣泛，更值得注意的是NAC有減輕造影劑引發(fā)腎損傷的作用[6]，但其作用機(jī)制尚未明確。代謝組學(xué)[7]是通過考察生物體系受刺激或擾動后代謝產(chǎn)物的變化，系統(tǒng)研究生物體系代謝途徑的一種技術(shù)，目前廣泛應(yīng)用于藥物研發(fā)、疾病診斷、食品化學(xué)、微生物學(xué)、植物生物學(xué)及環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域[8～9]。因此機(jī)體在NAC保護(hù)下注射釓造影劑后，對其進(jìn)行代謝組學(xué)研究，將對NSF的早期發(fā)現(xiàn)與預(yù)防起到重要作用。

為了研究NAC對釓造影劑引發(fā)損傷的保護(hù)機(jī)制，本研究選擇臨床應(yīng)用最廣泛的GdDTPA作為研究對象，采用基于1H NMR的代謝組學(xué)方法，對NAC保護(hù)下給藥GdDTPA前后慢性腎衰（Chronic renal failure， CRF） 大鼠尿液中的內(nèi)源性代謝物進(jìn)行分析，同時結(jié)合單變量分析，找出GdDTPA及NAC影響的潛在特征代謝物，從代謝角度初步闡述了NAC對造影劑引發(fā)損傷的保護(hù)機(jī)制。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

尿液的1H NMR實驗均在AV 600 型核磁共振譜儀（德國布魯克公司）上進(jìn)行，質(zhì)子共振頻率為600.13 MHz，采用預(yù)飽和方法壓制水峰采集信號，采樣溫度298 K，F(xiàn)ID采集次數(shù)64，數(shù)據(jù)點32 K，延遲時間2 s，采樣時間2.4773 s，譜寬6613.8 Hz。生化指標(biāo)在A6 半自動生化分析儀（北京松上技術(shù)有限公司）上進(jìn)行。組織病理學(xué)檢查在OlympusBX51光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）上進(jìn)行。

重水（D2O，99.9%氘代，美國劍橋同位素實驗室）； 3（三甲基硅基）氘代丙酸鈉（TSP，98%氘代）、N乙酰半胱氨酸、腺嘌呤均購于美國SigmaAldrich公司； 馬根維顯（GdDTPA，0.5 mol/L，德國拜耳先靈醫(yī)藥股份有限公司）； 血清尿素氮、肌酐試劑盒（長春匯力生物技術(shù)有限公司）。

2.2動物實驗

取40只成年雄性SD大鼠（吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動物實驗中心），自由攝食飲水，隨機(jī)分為4組：對照組（Control group， n=8）、慢性腎衰組（CRF group， n=16）、GdDTPA組（CRFGd group， n=8）、NAC組（CRFGdNAC group， n=8）。

實驗第1～21天，慢性腎衰組、GdDTPA組、NAC組按照劑量200 mg/kg體重灌胃給藥腺嘌呤造慢性腎衰（CRF）模型[10]，對照組灌胃蒸餾水；第22～31天，NAC組將飲用水替換為600 mg/L NAC溶液（劑量參考文獻(xiàn)[13～14]、大鼠進(jìn)水量及體重）；第24天，GdDTPA組、NAC組按照劑量2 mmol/kg體重尾靜脈注射給藥GdDTPA（劑量參考大鼠GdDTPA的半致死量[11]及文獻(xiàn)[12]）。

實驗第22天、31天均收集4組尿液；實驗第22天處死8只慢性腎衰組大鼠，實驗第31天處死對照組、慢性腎衰組、GdDTPA組、NAC組大鼠，收集血液；4℃，4000 r/min 離心10 min，取上層清液即為血清。尿液及血清均置于

Symbolm@@ 80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3核磁樣品制備與數(shù)據(jù)處理

樣品檢測前于4℃融化，取400 μL尿液與200 μL磷酸鹽緩沖液（0.25 mol/L，pH 7.4，20% D2O，1 mmol/L TSP）混合，靜置10 min，4℃，8000 r/min離心10 min，取上層清液550 μL于核磁管中測試。

核磁譜圖使用MestReC軟件（www.mestrec.com）進(jìn)行相位調(diào)整和基線校正，以TSP（δ =0.000）為內(nèi)標(biāo)。在δ 9.500～0.200范圍內(nèi)，譜圖按δ=0.005分段積分，去除水峰（δ=5.320～4.340）及尿素峰（δ=6.200～5.450）。概率商歸一化（PQN）后所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCAP 11.0（Umetrics，Sweden），進(jìn)行OPLSDA分析，OPLSDA模型進(jìn)行CVANOVA（Cross validationanalysis of variance）驗證（p<0.05）。endprint

2.4血清的生化指標(biāo)檢測及腎臟的組織病理學(xué)檢查

血清的尿素氮（Blood urea nitrogen， BUN）、肌酐（Creatinine， Cr）在松上 A6 半自動生化分析儀上按照試劑盒方法（尿酶靛藍(lán)法、苦味酸法）測試。

將處死的大鼠腎臟迅速取出， 用生理鹽水沖洗，10%福爾馬林固定后石蠟包埋，切片厚度3 μm，蘇木素伊紅（Hematoxylineosin， HE）染色，光學(xué)顯微鏡進(jìn)行組織病理學(xué)觀察，攝片。

3結(jié)果與討論

3.1血清生化指標(biāo)及腎臟組織切片光鏡圖的分析

大鼠血清中尿素氮及肌酐的含量見表1。從表1可見，慢性腎衰模型建立后（實驗第22天），大鼠血清中尿素氮、肌酐顯著性增加，說明慢性腎衰模型已經(jīng)成功建立。實驗第31天，慢性腎衰組血清中尿素氮、肌酐仍顯著增加，說明建立的模型穩(wěn)定。GdDTPA 給藥7天后，GdDTPA組與慢性腎衰組相比尿

素

氮、肌酐均顯著性增加，說明GdDTPA會對大鼠腎臟造成一定損傷。而NAC組與GdDTPA組相比，

血清中尿素氮、肌酐減少，說明給藥GdDTPA時，NAC對大鼠腎臟有一定保護(hù)作用。

腎臟組織切片光鏡圖（圖1）顯示，與對照組相比， 慢性腎衰組（第22和31天）大鼠腎小球基底膜增厚、系膜細(xì)胞增生，細(xì)胞外基質(zhì)增多，腎間質(zhì)中可見纖維化、多見輕度中性粒細(xì)胞滲出與浸潤，腎小管多灶性萎縮與消失，部分代償性擴(kuò)張，鏡下多見腺嘌呤體內(nèi)氧化產(chǎn)物2，8二羥基腺嘌呤結(jié)晶周圍單核與巨噬細(xì)胞呈結(jié)節(jié)狀病變。GdDTPA組結(jié)節(jié)狀病變及腎小管內(nèi)炎細(xì)胞彌漫浸潤加劇，可能是GdDTPA影響腎臟功能，導(dǎo)致大量腺嘌呤體內(nèi)代謝產(chǎn)物不易從腎臟排泄到體外，而留在腎內(nèi)形成大量結(jié)晶物質(zhì)，導(dǎo)致腎臟損傷程度的加劇。NAC組與GdDTPA組相比結(jié)節(jié)狀病變及腎間質(zhì)炎癥浸潤的程度有減輕，可見腎臟內(nèi)出現(xiàn)管型，腎臟排泄代謝產(chǎn)物的功能有所提高。

3.2尿液的1H NMR譜圖

尿液是最易于收集的生物體液，其組成及代謝物的濃度受機(jī)體各系統(tǒng)功能狀態(tài)的直接影響，能夠及時有效地反映機(jī)體的代謝變化。圖2為對照組、慢性腎衰組、GdDTPA組和NAC組尿液的1H NMR 譜圖，參考文獻(xiàn)[15～17]進(jìn)行譜峰歸屬。從圖2可見，大鼠尿液主成分有短鏈脂肪酸（α羥基正丁酸、α羥基正戊酸）、糖酵解產(chǎn)物（乳酸、乙酸、丙酮酸、丙氨酸）、膽堿、三羧酸循環(huán)中間體（檸檬酸、順烏頭酸、α酮戊二酸、琥珀酸、延胡索酸、蘋果酸）、有機(jī)酸（鄰羥基苯乙酸苯酯、對羥基苯乙酸苯酯、苯乙酰甘氨酸、甲基丙二酸）、代謝中間產(chǎn)物（N乙酰谷氨酸、甘氨酸、二甲基甘氨酸）、代謝終產(chǎn)物（肌酐、?；撬帷⒓姿?、N氧三甲胺、二甲胺、馬尿酸、尿囊素、N甲基煙堿、煙酸）等。

α羥基正丁酸： αhydroxynbutyrate （αHB）； α羥基正戊酸： αhydroxynvalerate （αHV）； 甲基丙二酸： Methylmalonate； 乳酸： Lactate； 丙氨酸： Alanine； 乙酸： Acetate； 乙酰胺： Acetamide； N乙酰谷氨酸： Nacetylglutamate； 丙酮酸： Pyruvate； 琥珀酸： Succinate； α酮戊二酸： αketoglutarate； 檸檬酸： Citrate； 二甲胺： Dimethylamine； 二甲基甘氨酸： Dimethylglycine； 肌酐： Creatinine； 順烏頭酸： cisAconitate； 膽堿： Choline； N氧三甲胺： Trimethylamine Noxide （TMAO）； ?；撬幔?Taurine； 甘氨酸： Glycine； 鄰羥基苯乙酸苯酯： oHydroxyphenylacetate （oHPA）； 苯乙酰甘氨酸： Phenylacetylglycine （PAG）； 對羥基苯乙酸苯酯： pHydroxyphenylacetate （pHPA）； 馬尿酸： Hippurate； 蘋果酸： Malate； 尿囊素： Allantoin； 尿素： Urea； 延胡索酸： Fumarate； 甲酸： Formate； 煙酸： Nicotinate； N甲基煙堿： Nmethylnicotinamide.

3.3潛在特征代謝物篩選

為了找出慢性腎衰組與對照組、GdDTPA組與慢性腎衰組、NAC組與GdDTPA組之間對分類貢獻(xiàn)最大的潛在特征代謝物，分別對各組的1H NMR譜圖數(shù)據(jù)進(jìn)行OPLSDA分析，得到的得分圖和相關(guān)系數(shù)載荷圖見圖3。如OPLSDA得分圖所示，對照組與慢性腎衰組（圖3A，3B）、慢性腎衰組與GdDTPA組（圖3C）、GdDTPA組與NAC組（圖3D）均可明顯區(qū)分。

篩選出對組間分類做出顯著性貢獻(xiàn)（Variable importance in projection，VIP>1，p<0.05）的代謝物，對其1H NMR譜圖積分面積進(jìn)行單變量分析，結(jié)果見圖4。從圖4A可見，慢性腎衰組與對照組相比αHB、 乳酸、 丙氨酸、 丙酮酸、 琥珀酸、 α酮戊二酸、 檸檬酸、 二甲胺、 二甲基甘氨酸、 順烏頭酸、 TMAO、 甘氨酸、 oHPA、 PAG、 延胡索酸顯著性增加，而N乙酰谷氨酸、肌酸酐、?；撬帷熕犸@著性減少，乙酸先增加后減少，馬尿酸先減少后增加。從圖4B可見，GdDTPA組與慢性腎衰組相比αHB、牛磺酸、馬尿酸顯著性減少；NAC組與GdDTPA組相比αHB、αHV、乳酸、丙氨酸、順烏頭酸、?；撬帷⒏拾彼?、oHPA、pHPA、煙酸顯著性增加，而馬尿酸、尿囊素、延胡索酸顯著性減少。

3.4特征代謝物生物學(xué)分析

慢性腎衰模型建立后，腎小管和腎小球受損，過濾能力下降，尿肌酐顯著性減少，這與文獻(xiàn)[18]的研究結(jié)果一致。糖酵解相關(guān)產(chǎn)物（乳酸，丙酮酸，丙氨酸，乙酸）、三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物（檸檬酸，順烏頭酸，α酮戊二酸，琥珀酸，延胡索酸）、短鏈脂肪酸（αHB）的顯著性增加說明慢性腎衰組大鼠能量代謝發(fā)生紊亂。NAC組糖酵解相關(guān)產(chǎn)物（乳酸、丙氨酸）也顯著性增加，說明NAC對糖代謝造成影響。短鏈脂肪酸是腸道細(xì)菌的發(fā)酵產(chǎn)物，主要來自大腸內(nèi)碳水化合物和蛋白質(zhì)的降解，是腸道上皮細(xì)胞能量的重要來源。膽堿被腸道細(xì)菌分解為三甲胺，隨后在肝臟中代謝產(chǎn)生TMAO。腎衰模型大鼠給藥GdDTPA后，尿液中短鏈脂肪酸（αHB、αHV）、膽堿、TMAO減少，說明GdDTPA引起大鼠腸道細(xì)菌代謝紊亂，而NAC組αHB、αHV、膽堿、TMAO增加，說明在NAC保護(hù)下，腸道細(xì)菌代謝紊亂得到一定程度減緩。芳香酸經(jīng)腸道菌群代謝產(chǎn)生苯甲酸，苯甲酸在肝臟中生成馬尿酸[19]，腎衰模型大鼠給藥GdDTPA后，尿液中馬尿酸減少，說明腸道菌群與芳香酸代謝之間的平衡受到干擾，而在NAC影響下馬尿酸進(jìn)一步減少，此代謝過程紊亂并未得到改善，其原因需要進(jìn)一步探索。endprint

文獻(xiàn)[20]報道釓會造成細(xì)胞內(nèi)活性氧的累積，進(jìn)而形成氧化壓力，可能會對線粒體造成損傷。牛磺酸是機(jī)體內(nèi)的抗氧化劑，GdDTPA組大鼠尿液中牛磺酸顯著性減少，可能是GdDTPA對機(jī)體造成氧化損傷，這也與氧化壓力指示性物質(zhì)尿囊素的增加一致，而NAC組牛磺酸的顯著性增加以及尿囊素的顯著性減少，說明給藥NAC后大鼠抗氧化能力顯著性增強(qiáng)，這可能與NAC對細(xì)胞中谷胱甘肽的補(bǔ)充有關(guān)[21]，谷胱甘肽是一種重要的細(xì)胞內(nèi)抗氧化劑，它能夠限制氧化壓力影響，保護(hù)細(xì)胞中脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA等重要成分。PAG、oHPA、pHPA在肝線粒體中由甘氨酸形成，GdDTPA組oHPA、pHPA、甘氨酸減少，可能是GdDTPA對肝臟線粒體代謝造成影響，而NAC組oHPA、pHPA、甘氨酸的顯著性增加說明給藥GdDTPA時，NAC對肝線粒體具有一定保護(hù)作用。

N乙酰谷氨酸由谷氨酸產(chǎn)生，是尿素循環(huán)的限速酶，慢性腎衰組N乙酰谷氨酸顯著性減少，這與慢性腎衰組大鼠血清尿素氮的顯著性增加（與對照組相比，p<0.05）一致[22]。而NAC組N乙酰谷氨酸的增加說明NAC對造模過程中的尿素循環(huán)紊亂具有一定修復(fù)作用。GdDTPA組血清中尿素氮含量顯著性增加（與慢性腎衰組對比，p<0.05），而NAC組血清中尿素氮向慢性腎衰組恢復(fù)，說明NAC可能減緩大鼠體內(nèi)腎損傷。

煙酸由色氨酸通過犬尿氨酸代謝通路產(chǎn)生[23]，其顯著性減少說明慢性腎衰模型建立后此通路受到抑制。給藥GdDTPA后，煙酸繼續(xù)減少，而在NAC組，煙酸顯著性增加，說明NAC對犬尿氨酸代謝通路具有保護(hù)作用。

4結(jié) 論

采用1H NMR方法對NAC保護(hù)下給藥GdDTPA前后慢性腎衰大鼠尿液中的內(nèi)源性代謝物進(jìn)行分析。慢性腎衰造成大鼠體內(nèi)能量代謝、尿素循環(huán)及犬尿氨酸等代謝通路發(fā)生紊亂。GdDTPA引發(fā)大鼠尿液中膽堿、TMAO、oHPA、pHPA、馬尿酸、甘氨酸、煙酸、牛磺酸減少，尿囊素增加。而在NAC保護(hù)下給藥GdDTPA，大鼠尿液中相關(guān)代謝物向慢性腎衰組恢復(fù)，說明NAC對GdDTPA引發(fā)的腸道細(xì)菌代謝、肝線粒體代謝、犬尿氨酸代謝及氧化損傷具有一定保護(hù)作用。NAC對尿素循環(huán)代謝的改善可能減輕大鼠的腎損傷，而其對細(xì)胞中谷胱甘肽的補(bǔ)充可能減輕GdDTPA造成的氧化損傷。

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Urinary Metabonomic Study on NAcetylcysteineProtected Rats with

Chronic Renal Failure from GdDiethylenetriamine

Pentaacetic Acid Administration

WAN ChuanLing1，2， XUE Rong1， ZHAN YouYang1，2， LI XiaoJing*1， PEI FengKui1

1（Changchun Institute of Applied Chemistry Chinese Academy of Sciences， Changchun 130022， China）

2（University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China）

AbstractNAcetylcysteine （NAC） protects rats administrated with gadoliniumbased contrast agents from renal injury， however， the underlying mechanisms remain unclear. A 1H NMRbased metabolomics approach coupled with OPLSDA （orthogonal projection to latent structure with discriminant analysis） was used to analyze the effect of NAC on urinary metabolic changes for Chronic Renal Failure Rats administrated with GdDTPA （GdDiethylenetriamine pentaacetic acid）. Combined with univariate analysis of integral area， the significantly changed metabolites were selected to screen out the potential metabolic disturbances that induced by GdDTPA and NAC. These researches may attribute to study of the protective effect of NAC from renal failure induced by gadoliniumbased contrast agents. The disturbance of energy metabolism， urea cycle and kynurenine metabolism were observed from the CRF group. GdDTPA caused the reduction of urinary choline， TMAO， oHPA， pHPA， hippurate， glycine， nicotinate and taurine accompanied with the elevation of allantoin. Metabonomic recovery in the NAC group was observed， which implied that NAC protects rats with chronic renal failure from GdDTPA induced disturbances of gut microbiota metabolism， liver mitochondria metabolism and kynurenine metabolism. The replenishment of glutathione in cells and the recovery of urea cycle that caused by NAC may protect rats from oxidative damage and renal injury.

KeywordsMetabonomics； Nuclear magnetic resonance； Chronic renal failure； Gddiethylenetriamine pentaacetic acid； NAcetylcysteine

（Received 17 April 2017； accepted 20 June 2017）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No.21305134）.endprint