王玲娜，孫希芳，張芳，張永清

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.山東醫(yī)藥技師學(xué)院，山東 泰安 271016)

金銀花貯藏過程中的美拉德反應(yīng)

王玲娜1，孫希芳2，張芳1，張永清1

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.山東醫(yī)藥技師學(xué)院，山東 泰安 271016)

為了探索金銀花貯藏過程中的變色機(jī)理，為合理貯藏提供理論依據(jù)，在45、55、65、75℃條件下進(jìn)行加速貨架測試試驗，用色差儀測定金銀花貯藏過程中的顏色參數(shù)，紫外可見分光光度計測定游離氨基酸、還原糖等成分含量，HPLC法測定5-羥甲基糠醛(5-HMF)含量，并對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果表明，隨貯藏時間延長和溫度升高，金銀花暗度值和色差值增加，褐變指數(shù)增大，提示金銀花在貯藏過程中發(fā)生褐變生成了有色物質(zhì)；金銀花提取液A420nm值穩(wěn)定上升，說明褐變生成的有色物質(zhì)為類黑素；氨基酸和還原糖含量隨貯藏時間延長逐漸降低，且水提液pH值在貯藏過程中顯著下降，說明氨基酸和還原糖可能為褐變的初始反應(yīng)物；5-HMF不斷積累，且溫度每升高10℃，褐變反應(yīng)加快3～5倍，說明5-HMF可能為褐變反應(yīng)的中間產(chǎn)物，5-HMF生成量和褐變速度密切相關(guān)。金銀花貯藏過程中顏色參數(shù)、氨基酸、還原糖、pH值、A420nm值及5-HMF的動態(tài)變化，說明發(fā)生了美拉德反應(yīng)，這是發(fā)生褐變的機(jī)理之一。

金銀花；貯藏；褐變；美拉德反應(yīng)

AbstractTo explore the color-changing mechanism ofLoniceraejaponicaeFlos during storage and provide theoretical bases for its reasonable storage, the mechanism of maillard reaction was studied with colorimeter measuring the color changes, UV-Vis detecting the contents of amino acid and reducing sugar, high performance liquid chromatography (HPLC) determining the content of 5-HMF during storage under the condition of 45, 55, 65, 75℃ by accelerated shelf life testing (ASLT) method, and the obtained data were analyzed. The results showed that the dark degree value, color difference value and the browning index ofLonicereajaponicaeFlos increased with the storage time prolonging and the temperature rising, which showed that browning reaction occurred in the process of storage and non-ferrous material was produced. The A420nmvalue ofLonicereajaponicaeFlos extracts rose stably, which showed that the non-ferrous material was class melanin. With the storage time extension, the contents of amino acid and reducing sugar reduced, and the pH value of aqueous solution decreased significantly, which showed that amino acid and reducing sugar might be the initial reactants ofLonicereajaponicaeFlos during browning reaction. The content of 5-HMF was gradually accumulated, and the browning reaction sped up 3～5 times with every increase of 10℃. It showed that 5-HMF might be the intermediate product of browning reaction, and the generation of 5-HMF and browning rate was closely related. We could confirm that maillard reaction happened in the process of storage ofLonicereajaponicaeFlos through dynamic changes of the color parameters, the contents of amino acid and reducing sugar, pH value, A420nmand 5-HMF, which was the mechanism of browning reaction.

KeywordsLoniceraejaponicaeFlos; Storage; Browning reaction; Maillard reaction

金銀花為忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或初開的花，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效[1]，為常用大宗中藥材之一。國家醫(yī)藥管理局和衛(wèi)生部對其商品質(zhì)量制定了四級標(biāo)準(zhǔn)，其中外觀色澤是判斷金銀花商品等級的主要指標(biāo)之一[2]。在干燥加工及貯藏過程中，因受各種不良因素影響，金銀花往往發(fā)生褐變，導(dǎo)致藥材品質(zhì)下降[3]。引起褐變的因素很多，包括酶促褐變、非酶褐變等。目前，人們關(guān)注較多的是酶促褐變[4，5]，而對金銀花的非酶褐變知之甚少。非酶褐變是指由各種非酶原因引起的化學(xué)反應(yīng)而造成的褐變，根據(jù)反應(yīng)機(jī)制分為抗壞血酸反應(yīng)、焦糖化反應(yīng)和美拉德反應(yīng)。干燥金銀花抗壞血酸含量很低，焦糖化褐變溫度要達(dá)100℃以上，因此推斷金銀花貯存過程中的非酶褐變可能源自美拉德反應(yīng)，但尚未得到驗證。

美拉德反應(yīng)是奶粉、脫水蔬菜、果脯變質(zhì)的重要原因，廣泛發(fā)生在食品、藥品貯藏過程中[6]，其經(jīng)典反應(yīng)途徑是還原糖與胺反應(yīng)，該反應(yīng)可引起初始反應(yīng)物pH值變化[7]，生成的5-羥甲基糠醛(5-HMF)經(jīng)進(jìn)一步縮合、聚合形成復(fù)雜高分子色素而發(fā)生褐變。生成的色素主要為類黑素類物質(zhì)，該類物質(zhì)在420 nm波長下有紫外吸收，可通過測定A420nm值判斷所生成的有色物質(zhì)是否為類黑素[8]。同時，美拉德反應(yīng)的中間生成物5-HMF的積累與褐變速度密切相關(guān)，因此可將金銀花貯藏過程中5-HMF的含量變化作為預(yù)測褐變速度的重要指標(biāo)之一[9]。Kroh[10]認(rèn)為褐變在大于55℃的條件下反應(yīng)速度較快。因此，本試驗在45、55、65、75℃條件下進(jìn)行貨架加速試驗，測定金銀花在貯藏過程中的顏色參數(shù)、pH值、A420nm、氨基酸、還原糖、5-HMF等的變化情況，旨在探索金銀花貯藏過程中是否有美拉德反應(yīng)發(fā)生，為合理貯藏提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

金銀花藥材購自河北省巨鹿縣，樣品經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)張永清教授鑒定，確認(rèn)為忍冬科植物忍冬LoniceraejaponicaThunb.的干燥花蕾。

試劑：葡萄糖，3,5-二硝基水楊酸，NaOH，酒石酸鉀鈉，苯酚，亞硫酸鈉，亮氨酸，茚三酮，正丁醇，正丙醇，乙二醇，無水乙酸鈉，抗壞血酸等。

儀器：Agilent1260 HPLC系統(tǒng)(包括G1311C四元泵、G1329B自動進(jìn)樣器、G1315D二極管陣列檢測器、G1316A柱溫箱和Agilent Chem Station工作站，美國安捷倫公司)，WF30色差儀(深圳iWAVE公司)，PL203電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)，KQ-500DE 型超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)，UV-5800型紫外可見分光光度計(上海元析有限公司)，F(xiàn)E20型pH計(梅特勒-托利多上海儀器有限公司)等。

1.2方法

1.2.1 樣品處理 將同一批次金銀花樣品隨機(jī)分成四份，每份約500 g，分別于45、55、65、75℃(±1.5℃)恒溫干燥箱中放置，且于放置0、48、96、168、240、312 h時取樣，放涼后以小型粉碎機(jī)粉碎，過2 mm孔徑篩，置干燥器中備用。

1.2.2 pH值及顏色參數(shù)測定 精密稱取樣品粉末0.5 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，加入蒸餾水25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率100 W，頻率100 Hz)30 min，放冷，再稱定重量，用蒸餾水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心(4 000 r/min)10 min，取上清液測其pH值及420 nm下的吸光度A。

將金銀花樣品裝在色差儀配套的小黑盒內(nèi)，鋪滿盒底，用色差計測量顏色參數(shù)a*、b*、L*。測定光源選用內(nèi)置D65標(biāo)準(zhǔn)光源，窗口直徑8 mm，觀測角度10°。重復(fù)測量10次。用暗度值(100-L*)、與基準(zhǔn)值對比的絕對變化值ΔE*和褐變指數(shù)BI分析。計算公式如下：

ΔE*=(L*2+Δa*2+Δb*2)1/2；

BI=100(x-0.31)/0.17；

x=(a*+1.75L*)/(5.645L*+a*-3.012b*)。

1.2.3 游離氨基酸含量測定

①溶液配制

茚三酮溶液：稱取茚三酮試劑0.6 g，精密加入正丙醇15 mL，攪拌溶解后加入正丁醇30 mL、乙二醇60 mL，最后加入pH值為5.4的乙酸-乙酸鈉緩沖液9 mL，混勻即得。

乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH值5.4)：稱取乙酸鈉54.4 g置100 mL無氨蒸餾水中，加熱至沸騰，使體積蒸發(fā)至60 mL左右。冷卻后加冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至5.4即得。

無氨蒸餾水：每1 000 mL普通蒸餾水中加入5%氫氧化鈉溶液25 mL，加熱煮沸1 h即得。

抗壞血酸溶液：稱取50 mg抗壞血酸，用無氨蒸餾水定容至50 mL即得。

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液：稱取干燥的亮氨酸對照品0.047 g，用10%異丙醇定容至100 mL，取此溶液5 mL，無氨蒸餾水定容至50 mL，即得5 μg/mL氨基氮標(biāo)準(zhǔn)溶液。

②標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密量取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，用無氨蒸餾水補(bǔ)足至2 mL，加入3 mL茚三酮溶液，0.1 mL抗壞血酸溶液，沸水浴加熱15 min，冷卻振搖，加60%乙醇定容至20 mL，混勻后，在570 nm下測定吸光度，以氨基酸濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，經(jīng)線性回歸處理，得回歸方程：A=232.57C-0.3406，R2=0.9970。

③樣品游離氨基酸含量測定

樣品溶液制備：精密稱取樣品粉末0.1 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入10%乙酸5 mL，超聲5 min，再加入25 mL無氨蒸餾水，80℃水浴20 min，過濾即得。

游離氨基酸含量測定：取樣品溶液1 mL，準(zhǔn)確加入1 mL無氨蒸餾水、3 mL茚三酮溶液、0.1 mL抗壞血酸溶液，100℃水浴加熱15 min，取出冷卻，振搖，用60%乙醇定容至20 mL，于570 nm處測定吸光度。

1.2.4 還原糖含量測定

①溶液配制

二硝基水楊酸溶液：精密稱取3,5-二硝基水楊酸6.3 g，溶于蒸餾水中，加熱，依次加入酒石酸鉀鈉182 g，氫氧化鈉21 g，苯酚5 g，亞硫酸鈉5 g，攪拌至完全溶解，冷卻后用蒸餾水定容至1 000 mL，貯于棕色瓶中備用。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：將葡萄糖烘干至恒重，精確稱量100 mg，用蒸餾水溶解，并定容至100 mL，配制成1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

②標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分別置于25 mL具塞試管中，用蒸餾水補(bǔ)至2 mL，加入二硝基水楊酸溶液1.5 mL，混勻后，沸水浴5 min，取出后立即冷卻，再以蒸餾水定容至25 mL，混合均勻?？瞻渍{(diào)零，在540 nm處測定吸光度。以葡萄糖含量C為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，得回歸方程：

C=0.4687A-0.0049，R2=0.9994。

③樣品還原糖含量測定

樣品溶液制備：精確稱取0.1 g樣品粉末，置于50 mL具塞錐形瓶中，準(zhǔn)確加入25 mL蒸餾水，超聲提取30 min，過濾，即得。

還原糖含量測定：準(zhǔn)確吸取2 mL樣品溶液，加入1.5 mL二硝基水楊酸溶液，沸水浴5 min，取出后立即冷卻，用蒸餾水定容至25 mL，540 nm處測定吸光度。

1.2.5 5-HMF含量測定

①溶液配制

5-HMF對照品溶液：精密稱定5-HMF對照品適量，用甲醇溶解，配制成濃度為6.96 μg/mL的儲備液。

供試品溶液：取樣品粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加50%甲醇25 mL，超聲提取30 min，取出放冷，補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心，上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

②色譜條件

Agilent ZorBax SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相1%甲酸溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～5 min,5% B；5～15 min,5%～10%B；15～25 min,10%B；25～40 min,10%～25%B；40～44 min,25%～35%B；44～45 min,35%～50%B；45～50 min,50%～55% B；50～55 min,55%～100%B；55～60 min,100% B)；流速1.0 mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量20 μL；檢測波長284 nm。在此條件下，對照品溶液和供試品溶液色譜圖見圖1。

A.對照品；B.供試品

圖1對照品和供試品284 nm下HPLC色譜圖

③方法學(xué)考察

對照品溶液和供試品溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線建立：吸取上述對照品溶液2、5、10、20、40 μL，按上述色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積，以對照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，其峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：Y=8235.3X-2.0489，R2=0.9999，線性范圍為1.392～27.840 μg。

精密度試驗：精密吸取對照品溶液10 μL，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積的積分值，結(jié)果其RSD<3%，表明該方法具有較好的精密度。

穩(wěn)定性試驗：精密吸取供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣20 μL，測定峰面積的積分值，結(jié)果RSD<3%，表明供試品溶液中上述幾種成分在24 h內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。

重復(fù)性試驗：精密稱取同一樣品6份，每份0.5 g，按1.2.5項下供試品溶液配制方法進(jìn)行提取處理后，各精密進(jìn)樣20 μL，測定含量，結(jié)果RSD<3%，表明本方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：精密稱取已知含量的樣品5份，每份0.25 g，精密加入對照品適量，按供試品溶液的制備方法制備并分析，計算回收率為100.68%。

④樣品含量測定

分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20 μL，按上述色譜條件進(jìn)行測定，計算其中5-HMF含量。

2 結(jié)果與分析

2.1不同溫度貯藏過程中金銀花pH值的變化

金銀花貯藏過程中溶液pH值的變化情況如圖2所示。隨著貯藏時間的延長，溫度的升高，整個金銀花溶液pH值呈下降趨勢。下降速率與溫度呈正相關(guān)，即溫度越高，下降速率越大(75℃>65℃>55℃>45℃)。

圖2 金銀花貯藏過程中pH值的變化情況

2.2不同溫度貯藏過程中金銀花的顏色變化及A420nm值

金銀花貯藏過程中的暗度值、色差值、褐變指數(shù)、A420nm值變化情況如圖3—圖6所示。隨著貯藏時間的延長和溫度的升高，金銀花暗度值100-L*、褐變指數(shù)BI呈上升趨勢，與貯藏前的色差值也逐漸增大，說明金銀花在貯藏過程中發(fā)生了褐變反應(yīng)。用分光光度法測定金銀花提取液在420 nm下的吸光度作為褐變值，確定褐變程度的差異，結(jié)果表明，在金銀花貯藏過程中A420nm值上升，褐變程度加深，溫度越高，變化越顯著。

圖3金銀花貯藏過程中暗度值變化情況

圖4 金銀花貯藏過程中色差值變化情況

圖5 金銀花貯藏過程中BI值的變化情況

圖6 金銀花貯藏過程中A420nm值的變化情況

2.3不同溫度貯藏過程中金銀花氨基酸含量的變化

金銀花貯藏過程中的氨基酸含量變化情況如圖7所示。隨貯藏時間的延長和溫度的增高，氨基酸含量整體呈下降趨勢，且下降速率隨貯藏溫度的升高而升高，同時貯藏312 h時，75℃處理的氨基酸含量不足45℃處理的一半。

2.4不同溫度貯藏過程中金銀花還原糖含量的變化

金銀花貯藏過程中還原糖含量變化情況如圖8所示。隨貯藏時間的延長和溫度的升高，還原糖含量整體呈下降趨勢，且下降速率隨貯藏溫度的升高而升高。

圖7 金銀花貯藏過程中氨基酸含量的變化情況

圖8 金銀花貯藏過程中還原糖含量的變化情況

2.5 5-HMF含量變化

由圖9可知，金銀花在45℃下5-HMF含量緩慢升高，312 h后增加了1.27倍，55℃ 312 h后增加了7.6倍，65℃ 312 h后增加了22.5倍，75℃ 312 h后增加了112.1倍。貯藏溫度每升高10℃，反應(yīng)速度加快3～5倍，312 h后，75℃貯藏下的5-HMF含量是45℃下的49.81倍。

圖9 金銀花貯藏過程中5-HMF含量的變化情況

3 討論與結(jié)論

3.1 金銀花在貯藏過程中，隨著貯藏時間的延長和溫度的升高，藥材顏色加深，暗度和褐變指數(shù)增大，表明在貯藏過程中發(fā)生了褐變反應(yīng)且有有色成分生成。同時，隨著金銀花褐變程度加重，金銀花提取液的A420nm值穩(wěn)定增加，說明金銀花在貯藏過程中，生成的有色成分為類黑素。

3.2 在金銀花貯藏過程中，隨著金銀花褐變程度加深，氨基酸和還原糖含量顯著減少，說明二者可能為褐變過程中的初始反應(yīng)物。同時，金銀花水提液pH值在貯藏過程中逐漸減小，其原因可能是由于氨基酸生成甲酸、乙酸所致[6]。

3.3 在金銀花貯藏過程中，隨著金銀花褐變程度加深，中間產(chǎn)物5-HMF逐漸積累，且溫度每升高10℃，褐變反應(yīng)加快3～5倍，說明5-HMF可能為褐變反應(yīng)的中間生成物，且5-HMF生成量和褐變速度密切相關(guān)。

3.4 綜上所述，在金銀花貯藏過程中，隨著時間延長，溫度升高，金銀花發(fā)生了褐變反應(yīng)，生成了有色物質(zhì)類黑素和中間產(chǎn)物5-HMF，且初始反應(yīng)物為氨基酸和還原糖，從而證實金銀花褐變過程中發(fā)生了美拉德反應(yīng)。

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ResearchonMaillardReactionduringStorageofLoniceraejaponicaeFlos

Wang Lingna1, Sun Xifang2, Zhang Fang1, Zhang Yongqing1

(1.CollegeofPharmacy,ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250355,China； 2.ShandongMedicineTechnicianCollege,Taian271016,China)

10.14083/j.issn.1001-4942.2017.09.016

2017-03-08

國家科技支撐計劃項目“金銀花規(guī)范化種植基地優(yōu)化升級及系列產(chǎn)品綜合開發(fā)研究”(2011BAI06B01)；山東省自主創(chuàng)新專項“金銀花資源高值產(chǎn)品開發(fā)與質(zhì)量控制技術(shù)研究”(2013CXC20401)；山東省重點研發(fā)計劃項目(2016GGB14409)；國家中醫(yī)藥標(biāo)準(zhǔn)化項目“金銀花標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)”(2YB2H-Y-SD-32)

王玲娜(1990—)，女，陜西延安人，在讀博士研究生，研究方向為中藥資源及其質(zhì)量控制。E-mail:wanglingna88@163.com

張永清(1962—)，男，山東平邑人，博士，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥資源及其質(zhì)量控制研究。E-mail:zyq622003@126.com

S567.7+90.3

A

1001-4942(2017)09-0082-06