馬春玲，李思含，趙東芳，李廣碩，馬睿憶，孫磊

(河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 河北省微生物多樣性研究與應(yīng)用重點實驗室，河北 保定 071002)

可產(chǎn)木聚糖酶的蕙蘭根內(nèi)生細(xì)菌的篩選與鑒定

馬春玲，李思含，趙東芳，李廣碩，馬睿憶，孫磊

(河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 河北省微生物多樣性研究與應(yīng)用重點實驗室，河北 保定 071002)

為了獲得可產(chǎn)木聚糖酶的功能菌，通過剛果紅染色法對592株蕙蘭(Cymbidiumfaberi)根內(nèi)生細(xì)菌進行初篩，DNS法對初篩獲得的菌株進行復(fù)篩，并通過形態(tài)學(xué)、生理生化特性、(G+C)的物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)及16S rRNA基因序列分析對菌株進行初步鑒定.結(jié)果篩選出31株可產(chǎn)木聚糖酶的菌株，占篩選總菌株數(shù)量的5.23%，其中7株產(chǎn)酶活性較強；復(fù)篩結(jié)果顯示菌株6hRe76產(chǎn)木聚糖酶活力最高，其發(fā)酵液木聚糖酶酶活為57.15 U/mL，初步鑒定該菌株為克里布所類芽胞桿菌(Paenibacilluskribbensis).該研究為木聚糖酶的生產(chǎn)提供了潛在的新資源.

木聚糖酶；類芽孢桿菌；內(nèi)生細(xì)菌

木聚糖是半纖維素的主要成分，也是自然界中僅次于纖維素的第2大類可再生的生物物質(zhì)，可以被降解為有用的產(chǎn)物[1].木聚糖主要存在于植物細(xì)胞的細(xì)胞壁和中膠層[2]，其基本分子結(jié)構(gòu)是D-木糖殘基通過β-1,4-糖苷鍵相連構(gòu)成線性分子主鏈，主鏈上帶有乙酰基、阿拉伯糖殘基[3].木聚糖完全水解需要多種酶相互結(jié)合才能完成，起主要作用的包括內(nèi)切-β-1,4-木聚糖酶(EC3.2.1.8)和β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)等[4].木聚糖酶隨機水解β-1,4-糖苷鍵產(chǎn)生低聚木糖和少量木糖，然后β-木糖苷酶進一步水解低聚木糖釋放木糖殘基[5].從半纖維素中獲取低聚木糖、木糖的有效途徑就是通過木聚糖酶的水解，木聚糖酶已經(jīng)在飼料、造紙及食品[6]等行業(yè)得到了廣泛應(yīng)用.因此對木聚糖酶的研究對于可再生資源的有效利用具有重要意義.

許多微生物包括細(xì)菌、真菌和酵母都能產(chǎn)生不同類型的木聚糖酶.植物內(nèi)生細(xì)菌指能在健康植物組織內(nèi)棲居而對植物無實質(zhì)性危害的細(xì)菌，其中一部分還能使植物受益，并與植物建立和諧聯(lián)合關(guān)系的微生物，植物內(nèi)生細(xì)菌具有多種重要的功能，如促生、生防、促進植物修復(fù)等[7]，同時內(nèi)生細(xì)菌還能分泌抗菌、抗病毒、抗癌及酶等多種活性物質(zhì)[8].植物內(nèi)生細(xì)菌作為活性物質(zhì)的重要來源日益受到人們的重視.

本研究主要以植物內(nèi)生細(xì)菌為材料篩選獲得可產(chǎn)木聚糖酶的功能菌株，以期獲得可產(chǎn)木聚糖酶的新資源.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 內(nèi)生細(xì)菌

分離自蕙蘭的592株根內(nèi)生細(xì)菌.

1.1.2 培養(yǎng)基

1)菌種純化培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)：蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，NaCl 10.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌30 min.

2)初篩培養(yǎng)基[9]：玉米芯木聚糖10.0 g，酵母粉0.3 g，(NH4)2SO45.0 g，K2HPO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaCl 5.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.4，121 ℃滅菌30 min.

3)產(chǎn)酶培養(yǎng)基[10]：麩皮40.0 g，蛋白胨5.0 g，K2HPO45.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌30 min.

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的初篩

將實驗室保藏的592株蕙蘭根內(nèi)生細(xì)菌活化后點接至以玉米芯木聚糖為碳源的初篩培養(yǎng)基平板上，30 ℃培養(yǎng)2 d，然后用剛果紅對初篩平板染色，觀察并記錄透明圈的大小[11].

1.2.2 菌種的復(fù)篩

將初篩得到的菌株接種于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h獲得種子液，再以10%的接種量接種于液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r/min，搖床振蕩培養(yǎng)24 h，然后吸取發(fā)酵液， 4 000 r/min離心10 min，其上清液即為粗酶液，用于測定木聚糖酶活力.

1.2.3 木聚糖酶活力測定

木聚糖酶活力測定采用DNS法[12].木聚糖酶活力單位：以木糖為標(biāo)準(zhǔn)，每min產(chǎn)生1 μmoL木糖所需酶量定義為1個酶活力單位(U).計算公式為U=N×G/(V×t×m)，式中N為酶液稀釋倍數(shù)，G為酶解溶液木糖含量，V為加酶量，t為酶解時間，m為木聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù).

1.2.4 菌株的鑒定

1)產(chǎn)酶菌株的16S rRNA基因序列分析采用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物27f[13](5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)和1492r[14](5-GGTTACCTTGTTACG ACTT-3)對其進行擴增.反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min.PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后由北京寶銳通生物技術(shù)有限公司測序，測序結(jié)果提交EzTaxon數(shù)據(jù)庫(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon/identify)進行序列比對，選取同源性較高的序列用鄰接法(neighbor-joining method)[15]進行分析，采用Mega7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

2)菌落形態(tài)觀察和生理生化鑒定：在平板培養(yǎng)基上觀察菌落形態(tài)、顏色，對培養(yǎng)24 h的菌株進行革蘭氏染色和鞭毛染色，并對該菌進行接觸酶實驗、氧化酶實驗、VP實驗及甲基紅實驗[16]，同時進行Biolog實驗.

3)產(chǎn)酶菌株(G+C)的物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)測定：采用HPLC法[17]測定菌株基因組(G+C)的物質(zhì)的量分?jǐn)?shù).

2 結(jié)果

2.1 初篩結(jié)果

利用剛果紅對592株蕙蘭根內(nèi)生細(xì)菌染色，比較透明圈大小，進行木聚糖酶產(chǎn)生菌的篩選，結(jié)果見表1.共篩選出可產(chǎn)木聚糖酶的功能菌31株，占篩選總菌株數(shù)量的5.23%；其中7株為功能較強菌株，占功能菌株數(shù)量的22.6%.根據(jù)初篩結(jié)果，選定菌株6hRe76、6hRe1、N58-1、T58-1、ahR29、hRa12、ahR12進行復(fù)篩.

表1 部分木聚糖酶產(chǎn)生菌株的水解圈直徑與菌落直徑的比值Tab.1 Hydrolysis circle diameter to colony diameter ratio of xylanase-producing strains

2.2 復(fù)篩結(jié)果

利用DNS法對選定的7株細(xì)菌進行發(fā)酵產(chǎn)酶測定，實驗結(jié)果如表2所示.其中木聚糖酶活力最高的是培養(yǎng)1 d后的菌株6hRe76的發(fā)酵液，其酶活性為57.15 U/mL.此菌株為篩選到的可產(chǎn)木聚糖酶的功能菌株，對其進行鑒定.

表2 復(fù)篩菌株木聚糖酶活力測定結(jié)果Tab.2 Xylanase activity determination results of secondary screening strains

2.3 菌株鑒定結(jié)果

2.3.1 菌株6hRe76的16S rRNA基因序列分析

將菌株6hRe76的16S rRNA基因序列提交GenBank，序列登錄號為(MF359544).在 EZTaxon 數(shù)據(jù)庫中作比對分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1).如圖1所示，菌株6hRe76與克里布所類芽胞桿菌(Paenibacilluskribbensis)(AF391123)在同一個分支中，序列相似性為99%.根據(jù)此結(jié)果,菌株6hRe76可初步鑒定歸屬于類芽孢桿菌屬.

括號內(nèi)數(shù)字為GenBank 登錄號；分支數(shù)表示1 000次Bootstrap 重抽樣分析的支持百分比；圖例0.005為遺傳距離.圖1 鄰接法構(gòu)建菌株6hRe76及其相關(guān)菌株16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA gene sequences of strain 6hRe76 and related strains by neighbor-joining method

2.3.2 菌落形態(tài)特征觀察

菌株6hRe76在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d，菌落表面光滑,半透明,微黃色,邊緣不規(guī)則.革蘭氏染色可變(圖2)，周生鞭毛(圖3).

a.革蘭氏陰性(培養(yǎng)2 d的染色結(jié)果)；b.革蘭氏陽性(培養(yǎng)7 d的染色結(jié)果).圖2 革蘭氏染色結(jié)果(1 000×)Fig.2 Result of Gram staining(1 000×)

圖3 鞭毛染色結(jié)果(1 000×)Fig.3 Result of flagellum staining(1 000×)

2.3.3 菌株生理生化特征測定

菌株6hRe76呈氧化酶陰性,接觸酶陽性,甲基紅反應(yīng)陰性,VP實驗結(jié)果陽性.該菌與克里布所類芽孢桿菌的菌落形態(tài)特征、革蘭氏染色特征及接觸酶等生理生化特征一致.

Biolog測定結(jié)果顯示,菌株6hRe76可利用的糖類包括D-麥芽糖、D-海藻糖、D-纖維二糖等,氨基酸的種類包括D-天冬氨酸、L-天冬氨酸、L-絲氨酸,羧酸及酯和脂肪酸包括氨基乙酰-L-脯氨酸、D-半乳糖醛酸等.在pH5、pH6、10 g/L NaCl條件下可生長,能夠利用乳酸鈉、鹽酸胍、亞碲酸鉀.

2.3.4 菌株6hRe76的(G+C)的物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)

通過HPLC法測得菌株6hRe76的(G+C)的物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)為47.10%，類芽孢桿菌屬的(G+C)的物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)為45%～54%.

根據(jù)形態(tài)特征、生理生化特征、(G+C)的物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)及16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析，菌株6hRe76被鑒定為克里布所類芽胞桿菌(Paenibacilluskribbensis).

3 討論

木聚糖酶在自然界廣泛存在，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)幾十個屬的100多個種的微生物可產(chǎn)木聚糖酶.目前報道較多的高產(chǎn)木聚糖酶的是真菌[18]和芽孢桿菌屬的細(xì)菌[19].真菌所產(chǎn)木聚糖酶的活性高于細(xì)菌，但是細(xì)菌所產(chǎn)木聚糖酶的耐堿性及耐熱性要優(yōu)于真菌[20].類芽孢桿菌屬目前至少包含202個種(LPSN,http://www.bacterio.net/)，類芽孢桿菌屬的細(xì)菌具有多種生物活性，也已發(fā)現(xiàn)多種類芽胞桿菌具有產(chǎn)木聚糖酶的能力，如Paenibacilluscurdlanolyticus[21]、Paenibacillusterrae[22]、Paenibacilluscampinasensis[23]、Paenibacillusfavisporus[24]等.本研究從592株植物內(nèi)生細(xì)菌中篩選到1株可產(chǎn)木聚糖酶的菌株6hRe76，經(jīng)鑒定為克里布所類芽胞桿菌，為木聚糖酶產(chǎn)生菌提供了新資源.

[1] COLLINS T,GERDAY C,FELLER G.Xylanases,xylanases families and extremophilic xylanases[J].FEMS Microbiol Rev,2005,29: 3-23.DOI:10.1016/j.femsre.2004.06.005.

[2] SALEH A M,RASHAD R A.Partial purification and characterization of xylanases fromAspergillusawamoriandAspergillusphoenicis[J].African Journal of Microbiology Research,2012,6(23):5025-5034.

[3] SQUINA F M,MORT A J,DECKER S R,et al.Xylan decomposition byAspergillusclavatusendo-xylanase[J].Protein Expres Purif,2009,68(1): 65-71.DOI: 10.1016/j.pep.2009.06.014.

[4] FANG T J,LIAO B C,LEE S C.Enhanced production of xylanase byAspergilluscarneusM34 in solid-state fermentation with agricultural waste using statistical approach[J].New Biotechnol,2010,27(1): 25-32.DOI:10.1016/j.nbt.2009.09.008.

[5] FANG H Y,CHANG S M,HSIEH M C,et al.Production,optimization growth conditions and properties of the xylanase fromAspergilluscarneusM34[J].J Mol Catal B-Enzyme,2007,49(16): 36-42.DOI:10.1016/j.molcatb.2007.08.002.

[6] 柏文琴， 王欽宏，馬延和，等.嗜熱和嗜堿木聚糖酶研究進展[J].生物工程學(xué)報，2014，30(6): 828-837.DOI: 10.13345/j.cjb.140172.

BAI W Q,WANG Q H,MA Y H,et al.Progress in the thermophilic and alkalophilic xylanases[J].Chin J Biotech,2014,30(6): 828-837.DOI: 10.13345/j.cjb.140172.

[7] RYAN R P,GERMAINE K,FRANKS A,et al.Bacterial endophytes: recent developments and applications[J].FEMS Microbiol Lett,2008,278:1-9.DOI:10.1111/j.1574-6968.2007.00918.x.

[8] STAIEK A,WOERDENBAG H J,KAYSER O.Endophytes: exploiting biodiversity for the improvement of natural product-based drug discovery[J].J Plant Interact，2008,3:75-93.DOI: 10.1080/17429140801886293.

[9] 王雪鵬.高產(chǎn)木聚糖酶芽孢桿菌的選育及產(chǎn)酶的研究[D].青島：中國海洋大學(xué)，2004.

WANG X P.Studies on the breeding of xylanase overproduction strain and the conditions of xylanase production fromBacillussp.[D]Qingdao:Ocean University of China,2004.

[10] 包怡紅,李雪龍,楊傳平.類芽孢桿菌木聚糖酶產(chǎn)生菌株的篩選及其產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008,36(9): 70-73.DOI:10.13759/j.cnki.dlxb.2008.09.006.

BAO Y H,LI X L,YANG C P.Screening experiment of xylanase-producingPanibacillussp.and optimization of production culture conditions[J].Journal of Northeast Forestry University,2008,36(9):70-73.DOI:10.13759/j.cnki.dlxb.2008.09.006.

[11] GOWDHAMAN D,MANASWINI V S,JAYANTHI V,et al.A comparison of plate assay methods for detecting extracellular cellulase and xylanase activity[J].International Journal of Biological Macromolecules,2014,64: 90-98.

[12] BAILEY M J,BIELY P,POUTANEN K.Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity[J].J Biotechnol,1992,23(3): 257-270.

[13] EDWARDS U,ROGALL T,BLACKER H,et al.Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes: characterization of a gene coding for 16S ribosomal RNA[J].Nucleic Acids Research,1989,17:7843-7853.DOI:10.1093/nar/17.19.7843.

[14] LANE D J.Nucleic acid techniques in bacterial systematics[M].New York:John Wiley &Sons,1991:115-175.

[15] SAITOU N,NEI M.The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees[J].Molecular Biology Evolution,1987,4: 406-425.

[16] 東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京：科學(xué)出版社.2001：62-63，349-398.

[17] MESBAH M,PREMACHANDRAN U,WHITMAN W B.Precise measurement of G+C content of deoxyribonucleic acid by high performance liquid chromatography[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,1989,39: 159-167.DOI:10.1099/00207713-39-2-159.

[18] POLIZELIM,RIZZATTIS,MONTI R,et al.Xylanases from fungi: properties and industrial applications[J].Appl Microbiol Biotechnol,2005,67: 577-591.DOI: 10.1007/s00253-005-1904-7.

[19] 劉巍，范樹田，李心治.地衣芽抱桿菌H-1的鑒定及其產(chǎn)木聚糖酶性質(zhì)的研究[J].工業(yè)微生物，1996，26(4): 11-15.

[20] 孫曉霞，謝響明，吳玉英，等.白色鏈霉菌產(chǎn)木聚糖酶規(guī)律及其耐熱耐堿性的初步研究[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2005，27(3):72-75.

SUN X X,XIE X M,WU Y Y,et al.Introduction of xylanase fromStrepoymycesalbusand analysis of hermostability and alkali-tolerance[J].Journal of Beijing Forestry University,2005,27(3):72-75.

[21] SERMSATHANASWADI J,BARAMEE S,TACHAAPAIKOON C,et al.The family 22 carbohydrate -binding module of bifunctional xylanase/β-glucanase Xyn10E fromPaenibacilluscurdlanolyticusB-6 has an important role in lignocellulose degradation[J].Enzyme Microb Technol,2017,96: 75-84.DOI: 10.1016/j.enzmictec.

[22] KIM D R,LIM H K,LEE K I,et al.Identification of a novel cellulose-binding domain within the endo-β-1,4-xylanase KRICT PX-3 fromPaenibacillusterraeHPL-003[J].Enzyme Microb Technol,2016,11 (93-94):166-173.

[23] LIU Y,HUANG L,LI W,et al.Studies on properties of the xylanbinding domain and linker sequence of xylanase XynG11 fromPaenibacilluscampinasensisG11[J].J Ind Microbiol Biotechnol,2015,42(12):1591-1599.DOI: 10.1007/s10295-015-1698-2.

[24] PADILHA I Q,VALENZUELA S V,GRISI T C,et al.A glucuronoxylan-specific xylanase from a newPaenibacillusfavisporusstrain isolated from tropical soil of Brazil[J].Int Microbiol,2014,17(3):175-184.DOI: 10.2436/20.1501.01.220.

(責(zé)任編輯：趙藏賞)

Screeningandidentificationofxylanase-producingendophyticbacteriaofCymbidiumfaberiroots

MAChunling,LISihan,ZHAODongfang,LIGuangshuo,MARuiyi,SUNLei

(1.Key Laboratory of Microbial Diversity Research and Application of Hebei Province,College of Life Sciences,Hebei University,Baoding 071002,China)

In order to obtain the xylanase-producing functional strains,592 endophytic bacteria fromCymbidiumfaberiroots were screened by using the method of Kongo red dye according to the size of hydrolyzed circle.The xylanase activity of strains screened was re-screened by DNS.The xylanase-producing strain was identified based on its morphological,physiological and biochemical characteristics,mole fraction of (G+C)and 16S rRNA gene sequence analysis.The results showed that 31 xylanase-producing strains were obtained,which account for 5.23% of the total strains.Seven strains with high xylanase yields were screened through DNS method.Strain 6hRe76 with the highest enzyme activity was obtained,of which the activity of xylanase was 57.15 U/ mL.The strain 6hRe76 was identified asPaenibacilluskribbensis.The research provided the new source for xylanase production.

xylanase;Paenibacillus;endophytic bacteria

Q939.13

A

1000-1565(2017)05-0518-05

10.3969/j.issn.1000-1565.2017.05.011

2017-06-22

國家自然科學(xué)基金資助項目(31100002)；河北省生物工程重點學(xué)科經(jīng)費資助項目；河北大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目(2016063)

馬春玲(1992—)，女，河北邢臺人，河北大學(xué)碩士研究生，主要從事微生物資源開發(fā)研究.E-mail: 799169587@qq.com

孫磊(1971—)，女，河北唐山人，河北大學(xué)教授，博士，主要從事環(huán)境微生物學(xué)研究.E-mail: sunlei1018@126.com