, ,,,,, ,,*

(1.廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,河北廊坊 065000;2.河北省高校食藥用菌應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心,河北廊坊 065000;3.廊坊市食用菌技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北廊坊 065000)

鱗柄小奧德蘑多糖提取工藝的優(yōu)化及抗氧化活性

王晶1,2,3,費(fèi)爽1,孟煜晗1,孫天玉1,侯曉強(qiáng)1,2,3,付亞娟1,2,3,杜娟1,吳智艷1,2,3,*

(1.廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,河北廊坊 065000;2.河北省高校食藥用菌應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心,河北廊坊 065000;3.廊坊市食用菌技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北廊坊 065000)

鱗柄小奧德蘑多糖,正交設(shè)計(jì),抗氧化能力

鱗柄小奧德蘑(Oudemansiellafurfuracea)又名長(zhǎng)根小奧德蘑鱗柄變種(O.radicatavar.furfuracea)或鱗腿長(zhǎng)根金錢菌(Collybiaradicatavar.furfuracea),現(xiàn)為蘑菇目(Agaricales)膨瑚菌科(physalacriaceae)狹義小奧德蘑屬(Oudemansiella)一獨(dú)立種[1]。其味道鮮美,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富,經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高[2],在河北、北京和山東均有人工種植。目前該菌的研究工作主要集中在育種和栽培等方面[3],而有關(guān)鱗柄小奧德蘑多糖提取分離方面未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

1 材料與方法

鱗柄小奧德蘑 廊坊市;DNA提取試劑盒 北京艾德萊生物科技有限公司;實(shí)驗(yàn)中所用其他試劑均為分析純。

MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋 日本SONYA公司;S1000 PCR儀 美國(guó)Bio-Rad公司;Hei-VAp Advantage旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)Heidolph公司;752N紫外分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司;Allegra 25R臺(tái)式高速離心機(jī) 美國(guó)Beckman Coulter公司;HHS電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實(shí)業(yè)科技有限公司;FD-1D-50真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種鑒定 采用ITS-rDNA 序列分子鑒定法進(jìn)行菌種鑒定[10]。蘑菇DNA采用試劑盒提取,瓊脂糖凝膠電泳檢查后,-20 ℃保存?zhèn)溆?。采用真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTA GGTGAA CCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)擴(kuò)增ITS1,5.8 S和ITS2的全序列[10]。PCR反應(yīng)體系25 μL:7.5 μL無(wú)菌超純水,12.5 μL 2×PCR Master,1 μL DNA模板,1 μL ITS 1,1 μL ITS2,2 μL 25 mg/mL BSA),反應(yīng)參數(shù):94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s,55 ℃復(fù)性30 s,72 ℃延伸45 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.2.2 鱗柄小奧德蘑粗多糖的提取 參考張保等[11]方法,并改進(jìn)。鱗柄小奧德蘑子實(shí)體干品粉碎后過(guò)200目篩,稱取樣品1.0 g,添加蒸餾水,水浴浸提,4000 r/min 離心20 min,重復(fù)提取若干次,收集上清液,Sevage(氯仿∶正丁醇=4∶1)試劑除蛋白,重復(fù)幾次,直至中間層無(wú)白色沉淀,蒸餾水透析,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,真空冷凍干燥得鱗柄小奧德蘑子實(shí)體粗多糖。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 選擇料液比、提取溫度、提取時(shí)間及提取次數(shù)4 個(gè)單因素[12]分別進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):料液比設(shè)置1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 (g∶mL)五個(gè)梯度,提取溫度、提取時(shí)間及提取次數(shù)分別是80 ℃、3 h和3次。提取溫度設(shè)置60、70、80、90、100 ℃ 5個(gè)梯度,提取時(shí)間、料液比和提取次數(shù)分別是3 h、1∶30和3次;提取時(shí)間設(shè)置1、2、3、4、5 h 5個(gè)梯度,提取溫度、料液比和提取次數(shù)分別是80 ℃、1∶30和3次;提取次數(shù)設(shè)置1、2、3、4、5次5個(gè)梯度,料液比、提取溫度和提取時(shí)間分別是1∶30、80 ℃和3 h。

大年三十前夕，大雪依然紛紛揚(yáng)揚(yáng)。父親將我們召集到一起，問(wèn)想吃什么，明天是年前最后一次逢集，都給買回來(lái)。

1.2.4 鱗柄小奧德蘑粗多糖提取工藝的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以粗多糖得率為篩選指標(biāo),對(duì)影響鱗柄小奧德蘑多糖提取的四種因素(提取溫度、提取時(shí)間、料液比和提取次數(shù))[12]進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)L9(34),確定提取鱗柄小奧德蘑粗多糖的最佳提取工藝參數(shù)。

1.2.5 多糖含量的測(cè)定方法 采用蒽酮比色法測(cè)定總糖含量(mg/mL),3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定還原糖的含量(mg/mL),多糖含量=總糖含量-還原糖含量[13];多糖得率(%)=提取液中多糖含量/鱗柄小奧德蘑的重量×100。

1.2.6 鱗柄小奧德蘑多糖抗氧化活性的測(cè)定

1.2.6.1 還原能力的測(cè)定 采用普魯士藍(lán)法[14-15]。取不同質(zhì)量濃度(0.25、0.5、1.0、1.5和2.0 mg/mL)的鱗柄小奧德蘑粗多糖溶液1 mL,加入磷酸鹽緩沖溶液(pH6.6)和1%(質(zhì)量體積比)K3[Fe(CN)6]各2.5 mL,混合均勻后,50 ℃中反應(yīng)20 min,再加入2.5 mL 10%(體積分?jǐn)?shù))的三氯乙酸溶液,振蕩混勻后,3000 r/min離心10 min,取上清液5 mL,分別加入蒸餾水5.0 mL和0.1%(質(zhì)量體積比)的FeCl3溶液1.0 mL,混勻后反應(yīng)10 min,利用分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)700 nm下的吸光值(A700),陽(yáng)性對(duì)照為相同質(zhì)量濃度梯度的VC水溶液。每組設(shè)三個(gè)重復(fù)。

1.2.6.2 清除羥基自由基(·OH)能力的測(cè)定 采用水楊酸法[16]。取不同質(zhì)量濃度(0.25、0.5、1.0、2.0和4.0 mg/mL)的鱗柄小奧德蘑粗多糖溶液1 mL,加入9 mmol/L的FeSO4溶液1 mL和9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL,置37 ℃恒溫水浴鍋中,添加8.8 mmol/L的H2O2溶液1 mL,恒溫反應(yīng)30 min,以蒸餾水調(diào)零,利用分光光度計(jì)測(cè)定510 nm波長(zhǎng)下的吸光值(Ax),空白組以1 mL蒸餾水代替樣品溶液,其余處理同上,測(cè)定吸光值(A0);對(duì)照組以1 mL 蒸餾水代替H2O2溶液,其余處理同上,于510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值(Ax0);陽(yáng)性對(duì)照為相同質(zhì)量濃度梯度的VC水溶液。每組設(shè)三個(gè)重復(fù)。清除率計(jì)算公式(1)計(jì)算。

式(1)

式(2)

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果與分析

2.1鱗柄小奧德蘑菌種確定

使用引物ITS1/ITS4對(duì)總DNA進(jìn)行擴(kuò)增,在約800 bp處得到明亮清晰的單一條帶(見(jiàn)圖1)送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序后,與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析,與鱗柄小奧德蘑(Oudemansiellafurfuracea)(GenBank Accession:AF321482.1)相似性為100%[18],因此,本實(shí)驗(yàn)菌種歸屬確定為鱗柄小奧德蘑。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)Fig.1 Agarose gel electrophoresis for PCR product注：1和2,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;M,DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2.2單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 料液比對(duì)鱗柄小奧德蘑粗多糖得率的影響 由圖2可知,料液比在1∶10～1∶30范圍內(nèi),鱗柄小奧德蘑粗多糖的得率差異不顯著(p>0.05),當(dāng)料液比從1∶30降低為1∶40時(shí),粗多糖得率顯著增大(p<0.05),料液比進(jìn)一步降低為1∶50時(shí),粗多糖得率無(wú)顯著變化(p>0.05),由此可得,當(dāng)料液比為1∶40時(shí),浸提液中含有足夠量的溶劑溶解菌體組織中擴(kuò)散出的多糖。由于提取液用量過(guò)低,不利于多糖的浸出[19],而提取液用量過(guò)高,對(duì)多糖的得率無(wú)明顯的增加效果,反會(huì)增加后續(xù)濃縮工藝的負(fù)擔(dān)[20]。因此,選擇1∶40的液料比,提取鱗柄小奧德蘑粗多糖較為合適。

圖2 料液比對(duì)鱗柄小奧德蘑多糖得率的影響Fig.2 Effect of solid/liquid ratio on polysaccharideyields from Oudemansiella furfuracea

2.2.2 提取溫度對(duì)粗多糖得率的影響 由圖3可知,提取溫度為60 ℃時(shí),粗多糖的得率較低,之后隨著溫度的升高,粗多糖的得率大幅度升高(p<0.05),說(shuō)明,隨著提取溫度的升高,多糖分子在水中的擴(kuò)散系數(shù)和溶解度升高,多糖能夠更大程度的擴(kuò)散到提取溶劑中[21]。當(dāng)溫度高于80 ℃后,多糖的得率的增幅減緩,當(dāng)溫度上升為100 ℃時(shí),多糖得率達(dá)到最高,考慮到100 ℃的高溫會(huì)導(dǎo)致溶劑水的沸騰,降低溶劑的體積,故選擇80～90 ℃的提取溫度較為合適。

圖3 溫度對(duì)鱗柄小奧德蘑多糖得率的影響Fig.3 Effect of temperature on polysaccharideyields from Oudemansiella furfuracea

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)粗多糖得率的影響 由圖4可知,提取時(shí)間在1～2 h 內(nèi),鱗柄小奧德蘑粗多糖的得率隨提取時(shí)間的增加而增大(p<0.05),說(shuō)明熱水浸提法中,在一定時(shí)間范圍內(nèi)隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),多糖從細(xì)胞內(nèi)逐漸進(jìn)入浸提液中,導(dǎo)致浸提液中多糖的濃度不斷增加,多糖得率不斷增大,直至細(xì)胞內(nèi)外多糖濃度趨于平衡,浸提液中多糖的得率逐漸趨于穩(wěn)定[22]。因此,鱗柄小奧德蘑粗多糖的提取時(shí)間選擇2 h較為合適。

圖4 提取時(shí)間對(duì)鱗柄小奧德蘑多糖得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on polysaccharideyields from Oudemansiella furfuracea

2.2.4 提取次數(shù)對(duì)粗多糖得率的影響 由圖5 可知,鱗柄小奧德蘑粗多糖的得率隨著提取次數(shù)的增加而增大,原因可能是熱水浸提時(shí),可溶性多糖不斷從蘑菇組織(多糖濃度較高)向熱水(多糖濃度較低)中擴(kuò)散,直至濃度達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡,將多糖的飽和溶液濾出后,連續(xù)多次添加新的熱水,可將組織中含有的多糖組分進(jìn)一步溶出[22],故隨著提取次數(shù)的增加,多糖的得率逐漸增大,但從圖5可發(fā)現(xiàn),當(dāng)提取次數(shù)達(dá)到3 次時(shí),增加提取次數(shù)并沒(méi)有顯著(p<0.05)的增加多糖的得率,而且工作時(shí)間延長(zhǎng),工作量加大[22],故最佳提取次數(shù)選擇為3 次。

圖5 提取次數(shù)對(duì)鱗柄小奧德蘑多糖得率的影響Fig.5 Effect of extraction times on polysaccharideyields from Oudemansiella furfuracea

2.3正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化多糖提取工藝

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,按照四因素三水平進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn),分析提取料液比、提取溫度、提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)鱗柄小奧德蘑粗多糖提取的影響[19],實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。由直觀分析可知,料液比(A)、溫度(B)、時(shí)間(C)和提取次數(shù)(D)四種因素對(duì)鱗柄小奧德蘑粗多糖得率的影響順序?yàn)?A>C>B>D,即料液比>提取時(shí)間>提取溫度>提取次數(shù),最優(yōu)組合為:A2B3C1D3,即提取鱗柄小奧德蘑粗多糖的最佳條件為:料液比1∶40,提取時(shí)間1h,提取溫度90 ℃,提取次數(shù)3 次。但正交表中無(wú)此實(shí)驗(yàn)組合,故追加該組合和第6組(多糖得率最高組)比較,結(jié)果表明,在A2B3C1D3提取條件下,鱗柄小奧德蘑多糖的得率較高,約為8.84%。故鱗柄小奧德蘑粗多糖提取的條件為料液比1∶40 (g/mL),提取時(shí)間1h,提取溫度90 ℃,提取次數(shù)3 次。

表1 鱗柄小奧德蘑多糖提取正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Orthogonal experiment results ofpolysaccharide yields from Oudemansiella furfuracea

2.4鱗柄小奧德蘑抗氧化能力

2.4.1 鱗柄小奧德蘑粗多糖的還原能力 具有還原能力的樣品可將鐵氰化鉀K3[Fe(CN)6]還原成亞鐵氰化鉀K4[Fe(CN)6],亞鐵氰化鉀與FeCl3中的Fe3+形成普魯士藍(lán)Fe4[Fe(CN)6]3。普魯士藍(lán)最大吸收波長(zhǎng)為700 nm,此波長(zhǎng)處吸光值反映普魯士藍(lán)的生成量,吸光值越大,樣品還原能力越強(qiáng)[23-24]。由圖6可知,在0.25～2 mg/mL實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),鱗柄小奧德蘑粗多糖的還原能力隨著多糖質(zhì)量濃度的增加而增大,說(shuō)明鱗柄小奧德蘑粗多糖具有一定的還原能力[25]。

圖6 鱗柄小奧德蘑粗多糖的還原能力Fig.6 Reducing power of crudepolysaccharides from Oudemansiella furfuracea

2.4.2 鱗柄小奧德蘑粗多糖對(duì)羥基自由基(·OH)的清除作用 H2O2與Fe2+通過(guò)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基·OH,后者能與水楊酸反應(yīng)生成在510 nm處有強(qiáng)吸收的有色產(chǎn)物二羥基苯甲酸[26],若反應(yīng)體系中添加具有清除羥自由基功能的被測(cè)樣品,便會(huì)與水楊酸競(jìng)爭(zhēng)·OH,從而使有色產(chǎn)物的生成量減少。510 nm處測(cè)得的吸光度越小,·OH越少,待測(cè)樣品對(duì)羥自由基清除效果越好[23]。

由圖7 可見(jiàn),0.25～1 mg/mL鱗柄小奧德蘑粗多糖對(duì)·OH清除能力較弱;當(dāng)質(zhì)量濃度提高到2 mg/mL和4 mg/mL時(shí),粗多糖對(duì)·OH的清除率顯著提高(p<0.05),為38.63%±9.25%和48.94%±12.32%,說(shuō)明鱗柄小奧德蘑粗多糖對(duì)·OH 的清除能力與多糖質(zhì)量濃度正相關(guān),即隨著粗多糖質(zhì)量濃度的增加,對(duì)·OH 的清除效果隨之增加,高質(zhì)量濃度的鱗柄小奧德蘑粗多糖對(duì)·OH 有著較明顯的清除作用,但與同質(zhì)量濃度的VC相比,清除能力較弱。

圖7 鱗柄小奧德蘑粗多糖對(duì)·OH 的清除作用Fig.7 Effect of crude polysaccharidesfrom Oudemansiella furfuracea on scavenging hydroxyl radicals

圖8 鱗柄小奧德蘑粗多糖對(duì)的清除作用Fig.8 Effect of crude polysaccharides from Oudemansiellafurfuracea on scavenging superoxide anion radicals

3 結(jié)論

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ExtractionandantioxidantactivityofpolysaccharidesfromOudemansiellafurfuracea

WANGJing1,2,3,FEIShuang1,MENGYu-han1,SUNTian-yu1,HOUXiao-qiang1,2,3,FUYa-juan1,2,3,DUJuan1,WUZhi-yan1,2,3,*

(1.College of Life Sciences,Langfang Teachers University,Langfang 065000,China;2.Edible and Medicinal Fungi Research and Development Center of Hebei Universities,Langfang 065000,China;3.Edible Fungi Key Laboratory of Langfang City,Langfang 065000,China)

To investigate the optimum extracting process of polysaccharides fromOudemansiellafurfuraceaand its antioxidant activityinvitro. Extraction process of polysaccharides fromOudemansiellafurfuraceawas optimised by orthogonal test. And the concentration of total sugar and reducing sugar in water extraction was determined by anthrone-sulfuric acid method and DNS method,respectively. The antioxidant properties were tested by prussian blue method,salicylic acid method and pyrogallol method,respectively. The results showed that the impact sequence of the factors on the extraction rate of polysaccharide fromOudemansiellafurfuraceawas as follows:solid-liquid ratio>extraction time>extraction temperature>extraction times. The optimal extraction condition was solid-liquid ratio of 1∶40,extraction time of 1h,extraction temperature of 80 ℃,and extracted three times,and under this conditions,the extraction rates of polysaccharide fromOudemansiellafurfuraceawas 8.84%. In addition,crude polysaccharides fromOudemansiellafurfuraceacould obviously scavenge hydroxyl radicals in a dose-dependent manner(p<0.05),and at the concentration of 4 mg/mL,crude polysaccharides was observed to possess strong free radical-scavenging effects against scavenge hydroxyl radicals,with a value of 48.94%±12.32%. In addition,crude polysaccharides fromOudemansiellafurfuraceahad a certain reducing power lower and its scavenging effects on superoxide anion radical was ineffective. So crude polysaccharides fromOudemansiellafurfuraceahad certain antioxidant activity and could be used for polysaccharide drugs and health food.

polysaccharide fromOudemansiellafurfuracea;orthogonal test;antioxidant activity

TS255.1

B

1002-0306(2017)19-0172-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.19.032

2016-11-11

王晶(1983-),女,博士,講師,研究方向:動(dòng)物細(xì)胞工程和生物活性物質(zhì),E-mail:oucflora@163.com。

*通訊作者:吳智艷(1962-),女,碩士研究生,教授,研究方向:食用菌栽培與深加工,E-mail:lfwuzhiyan@126.com。

河北省高等學(xué)校科學(xué)技術(shù)研究青年基金項(xiàng)目(QN2016019);河北省高校食藥用菌應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心項(xiàng)目(YF201411-321);河北省高等學(xué)校遺傳學(xué)重點(diǎn)發(fā)展學(xué)科項(xiàng)目(201221);廊坊師范學(xué)院微生物學(xué)重點(diǎn)學(xué)科項(xiàng)目(201501);廊坊師范學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201510100036)。