表面改性多孔淀粉的制備及微生物固定化應(yīng)用

周英男，錢斯日古楞，崔曉蕾，冀海龍，王紅英

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表面改性多孔淀粉的制備及微生物固定化應(yīng)用

周英男，錢斯日古楞，崔曉蕾，冀海龍，王紅英

（大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連 116034）

以玉米淀粉為原材料，利用生物酶解法制備多孔淀粉，并以聚乙烯亞胺（PEI）為表面改性劑，以戊二醇（GA）為交聯(lián)劑，對多孔淀粉進(jìn)行交聯(lián)改性。以沉降積為指標(biāo)，優(yōu)化確定多孔淀粉改性的最佳工藝條件。利用Zeta電位儀檢測分析改性多孔淀粉顆粒表面的電荷分布情況，并通過掃描電子顯微鏡觀察改性多孔淀粉的外部形貌。α-淀粉酶和糖化酶的混合比例為1∶4，酶添加量為5%，反應(yīng)體系pH保持6左右，在45℃條件下酶催化反應(yīng)24h時(shí)，可制備出外部形態(tài)完整、表面分布較多孔洞的多孔淀粉。以GA為交聯(lián)劑，用PEI對多孔淀粉表面進(jìn)行改性的最佳條件為：PEI添加量6%，GA添加量5%，35℃條件下攪拌反應(yīng)8h。此條件下制備的改性多孔淀粉，形態(tài)保持完整，沉降積表現(xiàn)最佳，且顆粒表面分布豐富的正電荷，等電點(diǎn)達(dá)到9.8。以表面改性的多孔淀粉為載體，在酸性條件下固定化大腸桿菌，制備了淀粉固定化大腸桿菌。

多孔淀粉；固定化微生物；Zeta電位；表面改性；載體

多孔淀粉是一種變性淀粉，其表層分布諸多孔洞，表面積顯著提高，用做載體時(shí)，其載量明顯提高，因此多孔淀粉是一種良好的吸附劑和微膠囊芯材[1-3]。多孔淀粉無毒、無副作用，且其制備成本低廉，因此在食品、醫(yī)療衛(wèi)生、化妝品、農(nóng)業(yè)和石油化工等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景[4]。淀粉經(jīng)過酶解處理表層形成諸多孔洞時(shí)，一定程度上破壞淀粉顆粒整體結(jié)構(gòu)，致使結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，甚至容易坍塌[5]。用戊二醛（glutaraldehyde，GA）等多功能試劑為交聯(lián)劑，對多孔淀粉進(jìn)行交聯(lián)處理，可以強(qiáng)化淀粉分子中的羥基或淀粉顆粒中形成氫鍵，穩(wěn)定和鞏固多孔淀粉的空間結(jié)構(gòu)。因此經(jīng)交聯(lián)處理，多孔淀粉結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性提高，應(yīng)用范圍擴(kuò)大[6]。聚乙烯亞胺（polyethyleneimine，PEI）又叫聚氮雜環(huán)丙烷，其分子鏈上帶有大量的氨基，顯示強(qiáng)正電荷，與帶負(fù)電的物質(zhì)具有高度親和性，屬于陽離子聚電解質(zhì)。許多研究者進(jìn)行以PEI為主要試劑，對多種載體表面進(jìn)行改性，制備表現(xiàn)正電荷的載體研究[7-9]。

本文以玉米淀粉為原材料，利用酶解法制備多孔淀粉。以PEI為改性劑和GA為交聯(lián)劑，對多孔淀粉表面進(jìn)行改性處理。以沉降積為指標(biāo)，優(yōu)化了多孔淀粉表面改性的最佳工藝條件，并利用Zeta電位儀和掃描電子顯微鏡對其表征進(jìn)行檢測。同時(shí)以表面改性的多孔淀粉為載體，在酸性條件下對大腸桿菌進(jìn)行固定化，制備了固定化大腸桿菌。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

玉米淀粉，市售食用玉米淀粉；α-淀粉酶和糖化酶，諾維信酶制劑公司；大腸桿菌，本實(shí)驗(yàn)室篩選；PEI（分子量為10000左右），上海原葉生物科技有限公司；GA，天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司；PHENOM掃描電子顯微鏡，飛納科學(xué)儀器（上海）有限公司；馬爾文Zeta電位分析儀，廈門名大科技有限公司。

1.2 酶法制備多孔淀粉顆粒

稱取20g玉米淀粉，加入pH為6的磷酸緩沖溶液20mL后，添加α-淀粉酶與糖化酶混合液（其混合比為1∶4）至5%，在50℃條件下攪拌反應(yīng)24h。加入0.5mL 4%的NaOH溶液，終止酶解反應(yīng)。反應(yīng)液在4000r/min條件下離心15min后棄上清液，用去離子水反復(fù)洗滌沉淀物，45℃揮干，得到多孔淀粉[10-13]。用掃描電子顯微鏡觀察多孔淀粉外貌 形態(tài)。

1.3 表面改性多孔淀粉顆粒

準(zhǔn)確稱取10g多孔淀粉，與100mL去離子水混合。加入6% PEI，在35℃條件下攪拌反應(yīng)8h。反應(yīng)液在4000r/min條件下離心15min后，獲得的沉淀移入到100mL 5% GA溶液中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)1h。反應(yīng)完后，反應(yīng)液進(jìn)行抽濾，濾餅用去離子水洗至中性，45℃揮干后得到PEI-多孔淀粉[14]。

1.4 多孔淀粉表面改性條件的優(yōu)化

1.4.1 表面改性PEI用量的確定

通常以沉降積為指標(biāo)，評價(jià)多孔淀粉的交聯(lián)程度。沉降積與交聯(lián)程度具有負(fù)相關(guān)關(guān)系，沉降積越小，交聯(lián)度越好。以沉降積為指標(biāo)，確定最佳的PEI用量[15]。

稱取5份10g的多孔淀粉，懸浮于100mL去離子水中，分別加入4%、5%、6%、7%和8%的PEI，在35℃攪拌反應(yīng)8h。反應(yīng)液在4000r/min下離心15min，獲得的沉淀移入100mL 5%的GA溶液中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)1h。反應(yīng)完后，反應(yīng)液進(jìn)行抽濾，濾餅用去離子水洗至中性，45℃揮發(fā)干燥后得到PEI-多孔淀粉。

稱取10g干燥的PEI-多孔淀粉與50mL去離子水混合，在85℃水浴中緩慢攪拌3min。取出，冷卻后在4000r/min條件下離心2min。取上清液，準(zhǔn)確測量其體積，按以下公式計(jì)算其沉降積。

沉降積=10–(1)

式中，為上清液的體積，mL。

1.4.2 表面改性溫度的確定

稱取5份10g的多孔淀粉，懸浮于100mL去離子水中，加入6% PEI，分別在30℃、35℃、40℃、45℃和50℃條件下攪拌反應(yīng)8h。反應(yīng)液在4000r/min下離心15min，獲得的沉淀移入100mL 5% 的GA溶液中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)1h。反應(yīng)完后，反應(yīng)液進(jìn)行抽濾，濾餅用去離子水洗至中性，45℃揮干后得到PEI-多孔淀粉，測定沉降積。以沉降積為指標(biāo)，確定表面改性最佳溫度。

1.4.3 表面改性時(shí)間的確定

稱取5份10g的多孔淀粉，懸浮于100mL去離子水中，加入6%PEI，在35℃條件下分別攪拌反應(yīng)4h、6h、8h、10h和12h。反應(yīng)液在4000r/min下離心15min，獲得的沉淀移入到100mL 5%的GA溶液中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)1h。反應(yīng)完后，反應(yīng)液進(jìn)行抽濾，濾餅用去離子水洗至中性，45℃揮干后得到PEI-多孔淀粉，測定沉降積。以沉降積為指標(biāo)，確定表面改性最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.4.4 GA添加量的確定

稱取5份10g的多孔淀粉，懸浮于100mL去離子水中，加入6% PEI，在35℃條件下攪拌反應(yīng)8h。反應(yīng)液在4000r/min下離心15min，獲得的沉淀分別移入到100mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%、4%、5%、6%和7%的GA溶液中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)1h。反應(yīng)完后，反應(yīng)液進(jìn)行抽濾，濾餅用去離子水洗至中性，45℃揮干后得到PEI-多孔淀粉。用掃描電子顯微鏡進(jìn)行外貌形態(tài)觀察，確定合成PEI-多孔淀粉的GA最佳添 加量。

1.5 表面改性多孔淀粉的Zeta電位

稱取2g的PEI-多孔淀粉置于燒杯中，加入到100mL去離子水中懸浮，用超聲波分散30min后用注射器緩慢抽取1mL樣品，注入Zeta電位測定儀測量池內(nèi)。開啟Zeta電位測定儀及自動(dòng)滴定系統(tǒng)，校正pH，將儀器測定模式設(shè)為自動(dòng)滴定模式，并將溫度設(shè)定為25℃，自溶液所處的pH起滴定。酸性溶液用0.25mol/L NaOH溶液滴定，終點(diǎn)pH為12，堿性溶液用0.25 mol/L鹽酸溶液滴定。起點(diǎn)pH為3，每隔0.5個(gè)pH自動(dòng)測定一次電位，并作Zeta電位隨pH變化曲線圖[16-18]。

1.6 表面改性多孔淀粉固定化大腸桿菌

從大腸桿菌保藏菌種斜面上取幾環(huán)菌種，接到活化培養(yǎng)基中，37℃、180r/min搖床培養(yǎng)18h。

活化培養(yǎng)基配方為：蛋白胨5g，牛肉膏2.5g，NaCl 2.5g，水500mL，pH 6.2。

5000r/min，5min離心收集活化菌種，用生理鹽水洗凈后，懸浮于0.02mol，pH 6.2的磷酸鹽緩沖液中（菌體懸浮液OD600nm為1.0）。取2份50mL的菌體懸浮液，分別加入1g的多孔淀粉和PEI-多孔淀粉，在25℃下，180r/min條件下震蕩反應(yīng)1h。在1000r/min條件下離心5min，收集沉淀，用0.02mol，pH 6.2緩沖液洗滌至無微生物脫下為止（洗脫液OD600nm值0.01為止），低溫?fù)]干后，在掃描電鏡下觀察和比較多孔淀粉表面微生物分布情況[24-25]。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶法制備多孔淀粉的微觀形態(tài)

將5%的α-淀粉酶與糖化酶混合液（其混合比為1∶4）與一定玉米淀粉混合，在pH為6，反應(yīng)溫度50℃條件下攪拌反應(yīng)24h。用4%的NaOH溶液終止反應(yīng)后離心獲得的沉淀，用去離子水洗至中性，低溫?fù)]干后得到多孔淀粉。用掃描電子顯微鏡觀察多孔淀粉外貌形態(tài)，結(jié)果如圖1。

由圖1可見，淀粉混合酶水解制備的多孔淀粉仍然保持原淀粉的顆粒形態(tài)，表面分布諸多孔洞，且孔洞深度適中，顆粒保持完整。

圖1 多孔淀粉的微觀形態(tài)

2.2 表面改性多孔淀粉制備條件的優(yōu)化

2.2.1 PEI用量的確定

將PEI緩慢加入多孔淀粉改性的反應(yīng)體系中，并通過GA交聯(lián)，抽濾干燥后獲得PEI-多孔淀粉，測定其沉降積。通過比較沉降積，研究PEI 添加量對表面改性多孔淀粉形成的影響。

由圖2可知，PEI 開始添加時(shí)，形成PEI-多孔淀粉的沉降積開始下降，隨著PEI添加量的增加，沉降積繼續(xù)下降，6%時(shí)達(dá)到最低。隨后PEI-多孔淀粉的繼續(xù)添加，沉降積不依PEI 的加入量增加而明顯提高。這是因?yàn)椋琍EI可以對多孔淀粉起到交聯(lián)作用，隨PEI用量增加，多孔淀粉與PEI反應(yīng)增多，交聯(lián)程度增加，因此沉降積會(huì)降低[19-20]。當(dāng)PEI濃度達(dá)到6%時(shí)，反應(yīng)達(dá)到飽和，過量的PEI被洗脫，沉降率保持相對穩(wěn)定，因此，PEI的最適添加量選擇為6%。

2.2.2 表面改性溫度的確定

將PEI緩慢加入到多孔淀粉改性反應(yīng)體系中，在不同溫度下攪拌反應(yīng)8h后，用GA交聯(lián)，抽濾干燥，獲得PEI-多孔淀粉，測定其沉降積。通過比較沉降積，分析多孔淀粉與PEI等分子間反應(yīng)的溫度條件對表面改性多孔淀粉形成的影響。

圖2 PEI用量對PEI-多孔淀粉沉降積的影響

由圖3可知，PEI分子與多孔淀粉間的反應(yīng)由30℃開始時(shí)，隨著溫度的增加其沉降積下降，當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到35℃時(shí)，沉降積變最小，反應(yīng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，沉降積隨之變大。這可能因?yàn)?，在較高反應(yīng)溫度下，PEI分子的運(yùn)動(dòng)增加，不利于在多孔淀粉表面孔洞中有效分配或促使PEI分子從淀粉顆粒表面脫落，或造成淀粉的局部糊化，造成沉降積增 大[21]。因此，PEI表面改性最佳反應(yīng)溫度選定為35℃。

圖3 反應(yīng)溫度對PEI-多孔淀粉沉降積的影響

2.2.3 表面改性時(shí)間的確定

將PEI緩慢加入多孔淀粉改性反應(yīng)體系中，在35℃條件下攪拌不同時(shí)間，用GA交聯(lián)，抽濾干燥后獲得PEI-多孔淀粉，測定其沉降積。通過比較沉降積，分析多孔淀粉與PEI等分子間的反應(yīng)時(shí)間對表面改性多孔淀粉形成的影響。

由圖4可見，PEI分子與多孔淀粉表面分配的反應(yīng)時(shí)間對PEI-多孔淀粉沉降積有一定影響。隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)行，PEI-多孔淀粉沉降積隨之下降，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間接近8h時(shí)，PEI-多孔淀粉沉降積達(dá)到最小。繼續(xù)延長反應(yīng)時(shí)間，PEI-多孔淀粉的沉降積逐漸增大。這可能因?yàn)?，開始反應(yīng)時(shí)，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，PEI充分分配到多孔淀粉表面的孔洞中。但隨著時(shí)間的延長，反應(yīng)體系的弱堿性環(huán)境對交聯(lián)酯鍵產(chǎn)生水解，造成PEI交聯(lián)減小[22]。因此，PEI表面改性最佳反應(yīng)時(shí)間選定為8h左右。

圖4 反應(yīng)時(shí)間對PEI-多孔淀粉沉降積的影響

2.2.4 GA濃度的確定

將一定量的多孔淀粉與PEI混合，在35℃條件下攪拌反應(yīng)8h，抽濾干燥后得到PEI-多孔淀粉。將其移入到100mL不同濃度的GA溶液中，反應(yīng)1h。洗滌，干燥后用掃描電子顯微鏡觀察其形貌，結(jié)果如圖5。

由圖5可見，當(dāng)GA的添加量為3%時(shí)[如圖5(a)]，形成的多孔淀粉顆粒的多數(shù)破損，孔道坍塌。這可能因?yàn)椋?% GA的添加量不足以支撐多孔淀粉顆粒的形狀。當(dāng)GA的添加量達(dá)到5%時(shí)[如圖5(b)]，形成的多孔淀粉顆粒結(jié)構(gòu)完整，表面形成的孔洞大小、數(shù)量均一，且沒出現(xiàn)孔洞坍塌現(xiàn)象。這可能因?yàn)椋?% GA中的醛基，足夠與淀粉羥基間或GA分子本身醛基之間形成化學(xué)鍵，有效支撐和保護(hù)了淀粉顆?？臻g結(jié)構(gòu)。當(dāng)GA的添加量至7%時(shí)[如圖5(c)]，淀粉顆粒雖然完整，形成孔洞沒有塌陷，但過量GA的醛基與相鄰淀粉羥基間形成化學(xué)鍵，促使淀粉顆粒堆積，這將會(huì)影響多孔淀粉的吸附性。因此，GA的最佳用量確定為5%。

2.3 改性多孔淀粉的表面電荷特性

用Zeta電位儀測量PEI改性的多孔淀粉表面電荷特性，進(jìn)而測定其等電點(diǎn)，結(jié)果如圖6。

圖5 GA添加量對PEI-多孔淀粉的影響

圖6 多孔淀粉和PEI-多孔淀粉的等電點(diǎn)

由圖6分析發(fā)現(xiàn)，在pH 3～6的條件下，PEI-多孔淀粉Zeta電位值能夠達(dá)到+35me以上，而多孔淀粉的最高只有+6me左右。在pH 3～9.8范圍內(nèi)，PEI-多孔淀粉均帶正電荷，且強(qiáng)度遠(yuǎn)比多孔淀粉的明顯高。PEI-多孔淀粉的等電點(diǎn)能夠達(dá)到9.8me，而多孔淀粉的只有6.2me。用PEI改性多孔淀粉表面，能夠有效提高多孔淀粉的表面正電荷特性，這利于多孔淀粉的廣泛應(yīng)用。

2.4 改性多孔淀粉固定化大腸桿菌

以PEI-多孔淀粉為載體，在酸性條件下與一定量的大腸桿菌混合，通過它們的正、負(fù)電荷間形成的離子鍵，使大腸桿菌固定到多孔淀粉的表面，制成固定化大腸桿菌，并對其進(jìn)行電鏡掃描，結(jié)果見圖7。

從圖7中可以看出，與多孔淀粉固定化的比較，PEI-多孔淀粉孔洞內(nèi)分布更多的大腸桿菌，說明，采用此法改性多孔淀粉表面，能使聚乙烯亞胺更有效地結(jié)合到淀粉顆粒表面，并在酸性條件下解離形成的正電荷通過離子鍵，與顯負(fù)電荷的大腸桿菌連接，大腸桿菌菌體附著在多孔淀粉表面，形成多孔淀粉固定化微生物。

圖7 多孔淀粉固定化大腸桿菌的掃描電鏡圖

3 結(jié)論

（1）將α-淀粉酶與糖化酶于1∶4混合，按加酶量為5%，在反應(yīng)體系pH為6，反應(yīng)溫度為50℃和酶解時(shí)間24h條件下制得的多孔淀粉，顆粒形態(tài)完整，表面孔洞大小均一。

（2）通過條件優(yōu)化得到，制備PEI-多孔淀粉的最佳工藝條件為，多孔淀粉與PEI的質(zhì)量比為1∶0.06；反應(yīng)溫度為35℃，反應(yīng)時(shí)間為8h；GA的添加量為5%。

（3）通過Zeta電位儀測得，PEI-多孔淀粉的等電點(diǎn)為9.8me，而且其表面明顯分布正電荷，且其強(qiáng)度遠(yuǎn)比多孔淀粉的高，這有利于吸附負(fù)電荷 物質(zhì)。

（4）多孔淀粉作為一種新型的微膠囊芯材、有機(jī)吸附劑[23]，經(jīng)PEI表面改性后，在酸性條件下表現(xiàn)正電荷，與負(fù)電荷微生物通過離子鍵結(jié)合，形成固定化微生物。多孔淀粉固定化益生菌，可以以微生態(tài)制劑形式應(yīng)用于動(dòng)物養(yǎng)殖中。微生物的固定化能使微生物的活性保持或延長。PEI-多孔淀粉同樣在醫(yī)藥、化妝品、食品工業(yè)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用前景。

（5）多孔淀粉表面改性過程中應(yīng)用的戊二醛，通過其與淀粉分子的連接，可增強(qiáng)多孔淀粉分子的空間結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，并提高其使用率和使用范圍。

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Preparation and application of microbe immobilization of the surface modified porous starch

Zhou Yingnan，Qian Siriguleng，CUI Xiaolei，JI Hailong，Wang Hongying

（College of Biologigical Engineering，Dalian Polytechnic Univercity，Dalian 116034，Liaoning，China）

Using corn starch as raw material，the porous starch was prepared by enzymatic hydrolysis. Polyethyleneimine as surface modifier and glutaraldehyde as crosslinking agent were used to modify the surface of porous starch，and the preparation conditions were optimized based on their sedimentation volumes. The charge distribution on the surface of modified porous starch was analyzed by Zeta potential meter，and its external morphology was observed by scanning electron microscope. The results showed that the ideal porous starch was obtained by operating under the conditions as the mixing ratio of α-amylase to glucoamylase，1∶4；the amount of mixture enzyme，5%；the pH of the reaction system，about 6; the enzymatic reaction temperature，45℃ and reaction time，24h. The optimum conditions for the surface modification of porous starch were that the reaction system contained 6% polyethyleneimine，5% glutaraldehyde，and stirred at 35℃ for 8h. The porous starch prepared under those conditions yielded the best shape and more surface charge distribution，and its isoelectric point reached 9.8. The starch immobilized E coli was preparedwhenwere immobilized using the porous starch with the surface modification as the carrier under the acidic condition. .

porous starch；immobilized microorganism；Zeta potential；surface modification；carrier

TS236.9

A

1000–6613（2017）10–3820–06

10.16085/j.issn.1000-6613.2017-0060

2017-01-11；

2017-05-19。

內(nèi)蒙古自治區(qū)科技重大專項(xiàng)項(xiàng)目（222089）。

周英男（1991—），女，碩士研究生。

王紅英，副教授，碩士生導(dǎo)師。E-mail：2002wanghongying@163.com。