鄧 雪，任 路△，冷 雪，張 囡，王 旭

(1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽 110847； 2. 中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽 110122)

【針灸研究】

補(bǔ)腎益腦灸法通過Wnt信號通路影響圍絕經(jīng)期抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)發(fā)生?

鄧 雪1，任 路1△，冷 雪1，張 囡2，王 旭1

(1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽 110847； 2. 中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽 110122)

目的：基于Wnt信號通路觀察補(bǔ)腎益腦灸法對圍絕經(jīng)期抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞分化標(biāo)記物表達(dá)的影響并探討其治療機(jī)制。方法： 60只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、假手術(shù)組、西藥組和艾灸組5組，采用去勢和慢性不可預(yù)見刺激結(jié)合制備圍絕經(jīng)期抑郁癥大鼠模型。連續(xù)治療28 d，觀察大鼠一般情況變化、動(dòng)情周期、體質(zhì)量及糖水消耗實(shí)驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用ELISA法檢測海馬組織中的GFAP、Tuj-1、GSK-3β、β-catenin，RT-PCR法檢測海馬組織中的GSK-3βmRNA、β-catenin mRNA表達(dá)。結(jié)果：造模后其他組較空白組表現(xiàn)出抑郁行為，而治療后抑郁行為好轉(zhuǎn)，西藥組、艾灸組及假手術(shù)組較模型組海馬組織中GFAP、GSK-3β及GSK-3βmRNA的表達(dá)量增加，Tuj-1、β-catenin及β-catenin mRNA表達(dá)量有所減少。結(jié)論：補(bǔ)腎益腦灸法可以通過調(diào)節(jié)海馬Wnt通路GSK-3β、β-catenin的表達(dá)調(diào)控海馬神經(jīng)干細(xì)胞的定向分化，對圍絕經(jīng)期抑郁癥起到治療作用。

補(bǔ)腎益腦灸法；圍絕經(jīng)期抑郁癥；GFAP；Tuj-1；GSK-3β；β-catenin

大量國內(nèi)外臨床流行病學(xué)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，女性圍絕經(jīng)期抑郁癥的發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他生命階段[1-2]?！耙钟舭Y海馬神經(jīng)元再生障礙”假說的提出，是近年來抑郁癥病因?qū)W研究最具突破性的進(jìn)展之一，該假說認(rèn)為抑郁癥的發(fā)生與神經(jīng)可塑性失調(diào)密切相關(guān)[3]?！澳I者主蟄，封藏之本，精之處也”，其藏與干細(xì)胞處于休眠狀態(tài)相關(guān)，只有出現(xiàn)損傷或者刺激時(shí)才會(huì)被激活，而腎精的激活與腎中陽氣的推動(dòng)密切相關(guān)，圍絕經(jīng)期抑郁癥大鼠的治療作用體現(xiàn)在大鼠海馬區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化的調(diào)控方面。為探討神經(jīng)干細(xì)胞定向分化與腎陽推動(dòng)作用之間的聯(lián)系，本實(shí)驗(yàn)擬建立圍絕經(jīng)期抑郁癥大鼠模型,通過艾灸干預(yù)后觀察海馬神經(jīng)干細(xì)胞分化標(biāo)記物GFAP及Tuj-1表達(dá)，觀察神經(jīng)干細(xì)胞分化情況，檢測海馬wnt信號通路關(guān)鍵蛋白GSK-3β、β-catenin蛋白及基因的表達(dá)，探討補(bǔ)腎益腦灸法對圍絕經(jīng)期抑郁癥的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 主要藥品與試劑

10﹪水合氯醛(北京索萊寶股份有限公司),鹽酸氯米帕明片25 mg/片(江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn),生產(chǎn)批號20140104),GFAP、Tuj-1、GSK-3β、β-catenin酶聯(lián)免疫試劑盒(ameko購于上海嵐派生物科技有限公司), 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(ProtoScript? II First Strand cDNA Synthesis Kit NEB，#E6560S)，熒光定量PCR試劑盒(Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix,Agilent， #600838)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用SPF級雌性SD大鼠，日齡56～62 d，體質(zhì)量(200±10) g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供(動(dòng)物合格證號SCXK(京)2012-0001)。實(shí)驗(yàn)過程中對動(dòng)物的處置符合《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定[4]。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器

LEICA DM LS2顯微鏡(德國, Leica公司生產(chǎn)), DFC500數(shù)碼成相軟件(德國, Leica公司), 酶標(biāo)儀(Gnth 52010), 熒光定量PCR儀(Agilent公司)，805-AⅡ型電針治療儀(廣東汕頭市醫(yī)用設(shè)備廠)。

2 方法

2.1 分組

所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)21 d(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室), 按隨機(jī)數(shù)字表法將60只大鼠分為空白組、模型組、假手術(shù)組、西藥組、艾灸組每組各12只。

2.2 模型制備

圍絕經(jīng)期模型的制備[5]：除空白組和假手術(shù)組大鼠外均行雙側(cè)卵巢摘除術(shù)。假手術(shù)組麻醉固定后僅進(jìn)行至拉出卵巢動(dòng)作并不進(jìn)行結(jié)扎切除，后續(xù)手術(shù)操作同摘除卵巢組。

抑郁癥模型的制備：對采用P. Willner[6]傳統(tǒng)慢性不可預(yù)見性刺激造模改良，除空白組外所有大鼠進(jìn)行模型制備，造模21 d，刺激包括夾尾(用止血鉗夾住距大鼠尾尖1 cm處1min)、冰水游泳(4 ℃，5min)、熱應(yīng)激 (45 ℃，5min)、禁食禁水(24 h)、束縛限制行動(dòng)(1 h)、潮濕墊料并傾斜籠子(24 h)和晝夜顛倒(24 h)共7種。每天隨機(jī)選擇1種刺激，每種刺激平均使用3次，2 d之中同一刺激不在相同個(gè)體上重復(fù)執(zhí)行共21 d。

2.3 治療方法

空白組、模型組及假手術(shù)組大鼠正常飼養(yǎng)，不接受刺激。西藥組：使用鹽酸氯米帕明片，將藥片用研缽研碎后溶于0.9%生理鹽水，按20 mg/kg·d-1用量灌胃[7]，每日1次，連續(xù)28 d。艾灸組:穴位定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[8],取雙側(cè)“腎俞” (位于大鼠背部, 第二腰椎下旁開5 mm之兩旁肋間)，頭頂“百會(huì)”(頂骨正中)，雙側(cè)“三陰交”(后肢內(nèi)踝尖直上10 mm)，以上穴區(qū)備皮，在穴位上方2～3 cm處進(jìn)行艾灸(特制直徑約0.6 cm，長12 cm,純艾絨艾條)，每日1次，每次15 min,連續(xù)28 d。

2.4 指標(biāo)檢測

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，除去實(shí)驗(yàn)過程中大鼠死亡情況，各組均取用10只大鼠做相應(yīng)指標(biāo)的檢測。

2.4.1 動(dòng)情周期檢測[9]去勢手術(shù)結(jié)束后休息3 d，在第4、5、6、7、8天逐只進(jìn)行陰道涂片檢查，以不出現(xiàn)動(dòng)情期反應(yīng)(未見成熟脫落細(xì)胞)確定卵巢摘除完全為造模成功。

2.4.2 一般情況觀察 抑郁癥模型復(fù)制過程中，觀察記錄大鼠一般情況包括飲食飲水、活動(dòng)度、精神狀態(tài)、毛色等。

2.4.3 體質(zhì)量測定 分別于抑郁癥模型制備開始前、造模后及治療后測定每只大鼠體質(zhì)量。

2.4.4 糖水偏嗜實(shí)驗(yàn)[10]實(shí)驗(yàn)前，在隔噪音且安靜的房間內(nèi)訓(xùn)練動(dòng)物適應(yīng)含糖飲水，每籠同時(shí)放置2個(gè)水瓶，第1個(gè)24 h 2瓶均裝有1%蔗糖水，隨后的24 h 1個(gè)瓶裝有1%蔗糖水，1個(gè)瓶裝純凈水，為避免場所偏愛，蔗糖水瓶的相關(guān)位置(左或右)在測試時(shí)進(jìn)行變化。在實(shí)驗(yàn)前或?qū)嶒?yàn)中沒有食物和水的剝奪，進(jìn)行動(dòng)物基礎(chǔ)糖水/純水消耗實(shí)驗(yàn)，同時(shí)給予每只大鼠事先定量好的2瓶，1瓶1%蔗糖水，1瓶純水，24 h后取走2瓶并稱重，計(jì)算動(dòng)物的總液體消耗、糖水消耗、純水消耗，糖水偏嗜(糖水偏嗜=糖水消耗/總液體消耗×100%)。

2.4.5 GFAP、Tuj-1、GSK-3β、β-catenin檢測 表1顯示，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后禁食24 h不禁水，用10%水合氯醛麻醉后打開腹腔，剝離腹主動(dòng)脈，用負(fù)壓取血管迅速吸取血液。剪開大鼠顱骨，將海馬從腦組織中分離出來，海馬組織勻漿后加入離心管中放入高速離心機(jī)以3000 r/min離心10 min，吸取上清液，保存在-80℃冰箱中備用。GFAP、Tuj-1、GSK-3β和β-catenin含量的檢測采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)，試劑的配制和操作按試劑盒說明書進(jìn)行。大鼠大腦海馬GSK-3β mRNA、β-catenin mRNA運(yùn)用熒光定量PCR法檢測。用Trizol提取總RNA，CDNA由NEB試劑公司合成，熒光定量PCR反應(yīng)條件：95 ℃， 10 min；40×(95 ℃ 20 s；59 ℃ 20 s；72 ℃ 30 s)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

表1 熒光定量PCR法檢測引物序列

表2 各組大鼠體質(zhì)量及糖水偏愛

注：與空白組比較：※P<0.05；與模型組比較：△P<0.05；與假手術(shù)組比較：#P<0.05

3 結(jié)果

3.1 動(dòng)情周期檢測

圖1 空白組陰道涂片染色(×200)

圖1、2顯示，空白組和假手術(shù)組陰道涂片染色結(jié)果顯示，動(dòng)情前期幾乎全部是有核上皮細(xì)胞，動(dòng)情中期全部是角化上皮細(xì)胞間或有少量上皮細(xì)胞，動(dòng)情后期有白細(xì)胞、角化細(xì)胞和核上皮細(xì)胞，動(dòng)情間期有大量白細(xì)胞及少量上皮細(xì)胞。2組均有周期性動(dòng)情出現(xiàn)，而模型組等無此周期改變，證明去勢模型成功。

圖2 假手術(shù)組陰道涂片染色(×200)

3.2 一般情況觀察

抑郁癥造模結(jié)束后，除空白組外大鼠普遍食欲下降，活動(dòng)度減少，嗜睡倦臥，被毛乏澤蓬松，便質(zhì)大多稀溏，表情淡漠且反應(yīng)遲緩。治療后，艾灸組西藥組上述一般情況明顯改善，模型組、假手術(shù)組一般情況有所好轉(zhuǎn)，但觀察仍差于空白組、西藥組和艾灸組。

3.3 體質(zhì)量及糖水實(shí)驗(yàn)測定

表2顯示，治療前各組大鼠體質(zhì)量及糖水偏嗜其他各組與空白組比較均有下降(P<0.05)，證明抑郁癥造模成功。治療后艾灸組、西藥組與模型組、假手術(shù)組比較均有升高(P<0.05)，證明治療后治療組抑郁情況有所好轉(zhuǎn)。

3.4 各組大鼠海馬組織ELISA法檢測GSK-3β、β-catenin、GFAP及 Tuj-1，RT- PCR法測定GSK-3βmRNA及β-catenin mRNA

表3顯示， 模型組海馬組織中GFAP、GSK-3β及GSK-3β mRNA 含量較空白組減少(P<0.05)，西藥組、艾灸組、假手術(shù)組與模型組比較增加(P<0.05)，艾灸組、西藥組與假手術(shù)組比較減少(P<0.05)。Tuj-1、β-catenin及β-catenin mRNA比較模型組較空白組含量增多(P<0.05)，西藥組、艾灸組、假手術(shù)組與模型組比較減少(P<0.05)，艾灸組、西藥組與假手術(shù)組比較有所增加(P<0.05)。表明治療結(jié)束時(shí)海馬神經(jīng)干細(xì)胞分化情況有所改變，治療組GFAP含量減少，Tuj-1含量增多，wnt信號通路處于激活狀態(tài)。

4 討論

實(shí)驗(yàn)用大鼠預(yù)養(yǎng)至77 d齡以上確保大鼠處于性成熟狀態(tài)[11]，以卵巢摘除與慢性不可預(yù)見性刺激法合并復(fù)制圍絕經(jīng)期抑郁癥動(dòng)物模型[12]。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察到，造模后大鼠一般情況、體質(zhì)量及糖水偏好較空白組明顯減少，合并復(fù)制模型在表面效度、結(jié)構(gòu)效度、預(yù)測效度上均有優(yōu)勢[13]。

表3 神經(jīng)干細(xì)胞分化及wnt信號通路相關(guān)指標(biāo)變化

注：與空白組比較：※P<0.05；與模型組比較：△P<0.05；與假手術(shù)組比較：#P<0.05

《素問·生氣通天論》曰:“陽氣者，若天與日，失其所，則折壽而不彰?！标枤獾男再|(zhì)向上而積極，抑郁癥則表現(xiàn)出 “三低”和“六無”，以陽氣不足表現(xiàn)在外。關(guān)于陽氣虧虛與抑郁癥的探討一向受到重視[14-16]，中醫(yī)基礎(chǔ)理論有陰陽互根互用、陰中求陽、陽中求陰的論斷。腎屬五臟位于下焦,藏精、主骨生髓；腦屬奇恒之腑位置最高,為諸陽之會(huì),主認(rèn)識,一屬陰一屬陽,上下升降互濟(jì),腎精腎水上滋腦髓,腦固攝升提腎氣,相互作用,互生互長。腎虧則腦髓失養(yǎng),神明清竅失靈,腦神不清則腎不氣化,以致百病從生[17-18]。腎陽虛不能推動(dòng)腎精上濟(jì)腦髓，不能推動(dòng)腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞分化，腦海空虛則出現(xiàn)思維遲緩、意志減退等癥狀。補(bǔ)腎益腦灸法恰是針對這種情況的治療方法。本次實(shí)驗(yàn)選取督脈“百會(huì)”、足太陽膀胱經(jīng)“腎俞”，足太陰脾經(jīng)“三陰交”為主要治療穴位。督脈“入屬于腦”，膀胱經(jīng) “上額, 交巔, 從巔入腦絡(luò)”, 本經(jīng)主治神志病?！邦^為諸陽之會(huì)”，“百會(huì)”開竅醒神，升提一身陽氣，善治郁證[19]。 “腎俞”善滋腎精，臨床治療圍絕經(jīng)期抑郁癥累計(jì)頻次居高[20]，“三陰交”為足之三陰交匯互通之穴，重在滋陰，填補(bǔ)腎精，臨床選穴常用。選用灸補(bǔ)方法進(jìn)行治療， 擬探討激發(fā)腎中陽氣對腎精上濟(jì)腦髓及腦內(nèi)干細(xì)胞定向分化的作用及作用機(jī)制。

膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)是星形膠質(zhì)細(xì)胞特有的細(xì)胞骨架蛋白，并被認(rèn)為是星形膠質(zhì)細(xì)胞成熟的標(biāo)志[21]。經(jīng)過抗抑郁治療，GFAP的海馬表達(dá)與神經(jīng)發(fā)生密切相關(guān)[22]。經(jīng)治療后，治療組GFAP分化程度比模型組增高，這可能是電針治療抑郁癥刺激神經(jīng)干細(xì)胞分化的證據(jù)之一。Tuj-1是一種被認(rèn)為參與神經(jīng)元細(xì)胞類型特異性分化的微管蛋白，抑郁癥領(lǐng)域相關(guān)研究也多用Tuj-1的表達(dá)監(jiān)測神經(jīng)干細(xì)胞的增殖及分化水平[23-24]。至于本次試驗(yàn)結(jié)果顯示，Tuj-1在模型組表達(dá)最高，這有可能是機(jī)體代償性變化的結(jié)果。

Wnt信號通路是廣泛存在于真核生物中的一條高度保守的信號通路。β-catenin和GSK-3β是Wnt信號通路的關(guān)鍵信號分子[25]。腎中陽氣對干細(xì)胞定向分化的推動(dòng)作用恰與Wnt信號通路對神經(jīng)干細(xì)胞的調(diào)控非常相似。有關(guān)Wnt信號通路下游分子β-catenin和GSK-3β等在神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化與細(xì)胞命運(yùn)決定等過程中的作用，文獻(xiàn)報(bào)道存在較大差異[26-27]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抗抑郁藥物通過抑制 GSK-3β和增加β-catenin蛋白刺激神經(jīng)發(fā)生對抑郁癥起到治療作用[28-29]。有體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著神經(jīng)細(xì)胞分化的進(jìn)行β-catenin表達(dá)量逐漸減少，而GSK-3β蛋白表達(dá)量逐漸增加，顯示W(wǎng)nt信號通路由活化狀態(tài)逐步走向抑制過程[30]。有研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路狀態(tài)與神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)入定向分化有關(guān)[31]。體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路的狀態(tài)與GFAP的表達(dá)量密切相關(guān)[32-33]。

綜上分析，本研究結(jié)果表明補(bǔ)腎益腦灸法能誘導(dǎo)海馬神經(jīng)干細(xì)胞定向分化，而這可能與Wnt/β-catenin 通路的激活密切相關(guān)。由于 Wnt/β-catenin 信號通路與其他信號通路存在交叉信號，本團(tuán)隊(duì)已在進(jìn)行相關(guān)研究?？傊a(bǔ)腎益腦灸法可以調(diào)節(jié)wnt信號通路關(guān)鍵蛋白GSK-3β、β- catenin及其mRNA的表達(dá)水平，對圍絕經(jīng)期抑郁癥模型大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞定向分化起到良性調(diào)整作用。

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MoxibustionInfluenceTheNeurogenesisofHippocampalinOvariectomizedandChronicUnpredictableMildStressRatsViaWnt/Beta-cateninSignalingPathway

DENG Xue1, REN Lu1△, LENG Xue1, ZHANG Nan2, WANG Xu1

(1.LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shenyang110847; 2.ChineseMedicalSciencesUniversity,Shenyang110122,China)

Objective: To observe the expression of neural stem cell differentiation markers on Wnt signaling pathway in perimenopausal depressive rat’s hippocampus; to explore the mechanism of moxibustion treatment for nourishing “Kidney - Brain System”.Methods： 60 rats were randomly divided into five groups: a normal group, a model group, a sham operation group, a western medicine group, and a suspended moxibustion(SM) group. A perimenopausal depressive rat’s model was made by castration and chronic unpredictable stress combination. The treatments were for 28 days. The general condition of rats, the rat’s estrous cycle, the weight of rats, and sugar consumption experiment of rats were observed. GFAP, Tuj-1, GSK-3 beta and beta-catenin in rat’s hippocampus tissue were detected by Elisa. RT-PCR method was used to detect the expression of GSK-3βmRNA and β-catenin mRNA in the rat’s hippocampus.Results: After modeling, except the normal group, the depressive behavior of all other groups was showed , however, after treatment，the depressive behavior of rats was dramatically reduced. Compared with the model group, the expression of GSK-3, GSK-3, mRNA and GFAP in the rat’s hippocampus of western medicine group, moxibustion group and sham operation group was increased, Tuj-1, beta -catenin and beta mRNA -catenin expression was reduced. Conclusion: Moxibustion treatment could nourish “Kidney - Brain System” through changing the expression of GSK-3β and β-catenin on Wnt signaling pathway in perimenopausal depressive rat’s hippocampal and through regulating the directional differentiation of neural stem cells in the hippocampus. Moxibustion has effect on the treatment of perimenopausal depression.

Bushen Yinao moxibustion; Perimenopausal depression; GFAP; Tuj-1 GSK-3β; β-catenin

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81373718)-基于“腎腦相濟(jì)”理論探討電針誘導(dǎo)腦海馬內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞分化治療圍絕經(jīng)期抑郁癥的作用;國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)項(xiàng)目(2010CB530401973)-中醫(yī)“腎精命火”臟象理論相關(guān)疾病與證候的研究;國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81503273)-黃連素促進(jìn)海馬神經(jīng)發(fā)生治療糖尿病腦病認(rèn)知障礙的機(jī)制研究;遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計(jì)劃項(xiàng)目(LR2014027)-基于“腎腦相濟(jì)”理論探討電針對更年期抑郁癥cAMP/PKA-CREB-BDNF信號通路的調(diào)節(jié)作用;中醫(yī)臟象理論及應(yīng)用國家教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

鄧 雪(1986-),女,山東淄博人,醫(yī)學(xué)博士，從事針刺機(jī)理的現(xiàn)代研究。

任 路(1966-),女，教授，醫(yī)學(xué)博士，博士研究生導(dǎo)師，從事針灸治療心身疾病的機(jī)制研究，Tel:13700016613,E-mail:inzyxkc@sina.com。

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1006-3250(2017)09-1288-04

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