雞源腸炎沙門氏菌快速檢測(cè)方法的建立及其分離株的耐藥性分析

范忠軍，許保疆，翟崇凱，郁 川，王歡莉

(1.鹽城師范學(xué)院 海洋與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224002； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 鄭州 450002； 3.河南科技大學(xué) 動(dòng)物疫病與公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽 471003)

雞源腸炎沙門氏菌快速檢測(cè)方法的建立及其分離株的耐藥性分析

范忠軍1，許保疆2，翟崇凱3，郁 川3，王歡莉1

(1.鹽城師范學(xué)院 海洋與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224002； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 鄭州 450002； 3.河南科技大學(xué) 動(dòng)物疫病與公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽 471003)

為探討雞源腸炎沙門氏菌的耐藥機(jī)制，參照GenBank中腸炎沙門氏菌特異性序列sdfⅠ 設(shè)計(jì)引物，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立雞源腸炎沙門氏菌的PCR檢測(cè)方法，用建立的檢測(cè)方法對(duì)臨床樣品分離株進(jìn)行檢測(cè)，并應(yīng)用K-B紙片擴(kuò)散法和PCR方法檢測(cè)分離株對(duì)22種藥物的敏感性和耐藥基因的分布情況。結(jié)果顯示，建立的檢測(cè)方法可有效擴(kuò)增出203 bp的目的基因，DNA最低檢出量為100 pg/μL，菌液最低檢出濃度為4×103cfu/mL，PCR方法檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)檢測(cè)方法的符合率為100%；藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，56株雞源腸炎沙門氏菌分離株對(duì)22種抗生素表現(xiàn)出不同程度的耐藥性，其中對(duì)青霉素(98.21%)和紅霉素(96.43%)的耐藥性最高；耐藥基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，tetA、aph(3′)-Ⅱa、blaCMY-2、cat1和sul1的檢出率較高，均大于50%?？梢?，建立的PCR方法可有效檢測(cè)雞源腸炎沙門氏菌，雞源腸炎沙門氏菌分離株耐藥性嚴(yán)重，耐藥基因廣泛存在于耐藥菌株中。

雞; 腸炎沙門氏菌； 檢測(cè)； 藥敏試驗(yàn)； 耐藥基因

沙門氏菌是一種重要的人獸共患病病原菌，在自然界分布廣泛，血清分型多，有2 500多種血清型，其中腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌有較為重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義[1-2]。腸炎沙門氏菌有較強(qiáng)的體外生存能力，其主要宿主是家禽，不僅可以感染家禽發(fā)生胃腸炎，也可通過污染肉蛋產(chǎn)品引起食物中毒[3-6]。近年來，腸炎沙門氏菌漸漸超越鼠傷寒沙門氏菌成為流行的優(yōu)勢(shì)血清型菌株[2]。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的大型化和集約化以及抗生素藥物的濫用，腸炎沙門氏菌耐藥性日趨嚴(yán)重，動(dòng)物的感染率和發(fā)病率也逐漸上升，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益和人類健康[7-9]。

傳統(tǒng)凝集試驗(yàn)檢測(cè)雞源腸炎沙門氏菌費(fèi)時(shí)費(fèi)力，敏感性和特異性均不高。此外，雞源腸炎沙門氏菌常與雞白痢、鼠傷寒沙門氏菌發(fā)生交叉反應(yīng)，而且感染雞源腸炎沙門氏菌的癥狀和病變與感染雞白痢沙門氏菌極為相似，在生產(chǎn)中常常把雞源腸炎沙門氏菌感染誤診為雞白痢[10-14]。因此，建立雞源腸炎沙門氏菌快速、特異性檢測(cè)方法具有重要的公共衛(wèi)生意義[15-16]。本研究根據(jù)Agron等[17]篩選出的腸炎沙門氏菌種特異sdfⅠ 序列設(shè)計(jì)引物，建立檢測(cè)雞源腸炎沙門氏菌的PCR方法，同時(shí)對(duì)臨床雞源腸炎沙門氏菌分離株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，并對(duì)5類常見抗生素的相關(guān)耐藥基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，旨在為確定雞源腸炎沙門氏菌耐藥基因的分布及其耐藥機(jī)制的研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1供試菌株

雞白痢沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株C79-13、豬霍亂沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株C78-1、鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株SL1344及大腸桿菌ATCC 25922購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；雞源腸炎沙門氏菌、雞源鼠傷寒沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌、雞源大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、巴氏桿菌以及采自豫西地區(qū)的75份雞血清樣品均由河南科技大學(xué)動(dòng)物疫病與公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2主要試劑

TaqDNA 聚合酶、dNTPs、10×PCR Buffer、DNA Marker 購(gòu)自TaKaRa公司；22種抗生素藥敏紙片、微量生化管、麥康凱培養(yǎng)基、SS 培養(yǎng)基等購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物購(gòu)自英國(guó)OXOID 公司；沙門氏菌診斷血清購(gòu)自寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司。

1.3細(xì)菌基因組DNA的提取與測(cè)定

按照試劑盒說明書分別提取雞源腸炎沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、雞源大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、巴氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)株或分離株的基因組DNA，測(cè)定并計(jì)算基因組DNA的濃度和純度，于-20 ℃保存。

1.4檢測(cè)種特異基因序列sdfⅠ的PCR方法的建立

1.4.1 引物的設(shè)計(jì)合成 根據(jù)腸炎沙門氏菌特異基因序列sdfⅠ (登錄號(hào)：AF370707.1)，應(yīng)用軟件Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)引物，上游引物P1：5′-AGAGGCGGTTTGATGTGGTTGGT-3′；下游引物P2：5′-GAAGGTGGTGGCTGGCGAATGGT-3′；預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度為203 bp。引物由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

1.4.2 擴(kuò)增體系及程序 通過對(duì)退火溫度、引物濃度等條件的優(yōu)化，最終確定反應(yīng)體系為：10×PCR Buffer 2.5 μL，Mg2+1.5 μL，dNTPs 1 μL，TaqDNA 聚合酶(5 U/μL) 0.3 μL，DNA 模板1 μL，上、下游引物(25 μmol/L)各1 μL，加滅菌超純水補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，將陽性條帶切膠回收，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.5PCR特異性和敏感性檢測(cè)

1.5.1 PCR特異性檢測(cè) 分別提取雞源腸炎沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、雞源大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、巴氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)株及分離株的基因組DNA，按上述擴(kuò)增體系及程序進(jìn)行PCR，以超純水為陰性對(duì)照，測(cè)定建立的PCR檢測(cè)方法的特異性。

1.5.2 檢測(cè)菌液敏感性試驗(yàn) 用滅菌超純水將雞源腸炎沙門氏菌菌液10倍梯度分別稀釋至4×106、4×105、4×104、4×103、4×102、4×101、4×100cfu/mL，以超純水為陰性對(duì)照，取1 μL作為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。

1.5.3 檢測(cè)DNA敏感性檢測(cè) 提取雞源腸炎沙門氏菌基因組DNA，用滅菌超純水分別將DNA模板稀釋至100 ng/μL、50 ng/μL、10 ng/μL、1 ng/μL、500 pg/μL、100 pg/μL、50 pg/μL、10 pg/μL，取1 μL作為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增并電泳檢測(cè)。

1.6臨床樣品的檢測(cè)

對(duì)采自豫西地區(qū)的75份臨床樣品進(jìn)行雞源腸炎沙門氏菌的分離鑒定[18]，同時(shí)對(duì)分離菌株用上述建立的PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.7雞源腸炎沙門氏菌分離株藥敏試驗(yàn)

用K-B紙片擴(kuò)散法測(cè)定雞源腸炎沙門氏菌分離株對(duì)抗生素的敏感性，以大腸桿菌ATCC 25922為藥敏質(zhì)控菌株。用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌環(huán)的直徑，抑菌環(huán)的邊緣以肉眼見不到細(xì)菌明顯生長(zhǎng)為限，然后根據(jù)抑菌環(huán)直徑大小判斷細(xì)菌的藥物敏感性。

1.8耐藥基因的PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank中登錄的相關(guān)抗生素耐藥基因序列，參照文獻(xiàn)[19-21]，設(shè)計(jì)14對(duì)引物(表1)，分別用于擴(kuò)增四環(huán)素類的5種耐藥基因、氨基糖苷類的2種耐藥基因、β-內(nèi)酰胺類3種耐藥基因、氯霉素類1種耐藥基因和磺胺類3種耐藥基因。PCR反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，Mg2+1.5 μL，dNTPs 1 μL，TaqDNA 聚合酶(5 U/μL) 0.3 μL，DNA 模板1 μL，上、下游引物各1 μL，滅菌超純水補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，退火溫度(表1)退火 30 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

表1 耐藥基因PCR擴(kuò)增的引物序列

1.9臨床樣品耐藥基因的序列分析

將擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果與GenBank中的相應(yīng)耐藥基因序列進(jìn)行同源性比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1雞源腸炎沙門氏菌sdfⅠ序列的PCR特異性檢測(cè)結(jié)果

雞源腸炎沙門氏菌能夠擴(kuò)增出約200 bp大小的特異性條帶，而其他血清型的沙門氏菌、大腸桿菌、巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌以及陰性對(duì)照均無條帶出現(xiàn)(圖1)。將陽性條帶切膠回收后進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增條帶的序列(203 bp)與目的基因序列的同源性為100%。表明本研究建立的PCR檢測(cè)方法可以對(duì)腸炎沙門氏菌進(jìn)行擴(kuò)增，且有較強(qiáng)特異性。

M.DNA Marker; 1.陰性對(duì)照; 2.雞源腸炎沙門氏菌; 3.豬霍亂沙門氏菌; 4.雞白痢沙門氏菌; 5.鼠傷寒沙門氏菌; 6.雞源大腸桿菌; 7.巴氏桿菌; 8.金黃色葡萄球菌圖1 PCR的特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.2雞源腸炎沙門氏菌sdfⅠ序列的PCR敏感性檢測(cè)結(jié)果

分別以10倍梯度稀釋的雞源腸炎沙門氏菌菌液和不同質(zhì)量濃度基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，雞源腸炎沙門氏菌菌液最低檢出濃度為4×103cfu/mL(圖2)，基因組DNA最低檢出量為100 pg/μL(圖3)。

M.DNA Marker; 1—7.菌液濃度分別為4×106、 4×105、4×104、4×103、4×102、4×101、4×100 cfu/mL 圖2 PCR的菌液敏感性試驗(yàn)結(jié)果

M.DNA Marker; 1—8.模板含量分別為100 ng/μL、50 ng/μL、 10 ng/μL、1 ng/μL、500 pg/μL、100 pg/μL、50 pg/μL、10 pg/μL圖3 PCR的DNA敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.3雞源腸炎沙門氏菌臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果

用建立的PCR方法對(duì)75份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，其中 56株腸炎沙門氏菌分離株sdfⅠ 基因的PCR鑒定結(jié)果為陽性，非腸炎沙門氏菌的PCR鑒定結(jié)果均為陰性，特別是與腸炎沙門氏菌極易混淆的雞白痢沙門氏菌和雞傷寒沙門氏菌的PCR鑒定結(jié)果也均為陰性?？梢姡狙芯拷⒌碾u源腸炎沙門氏菌特異性PCR檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)方法一致。

2.4雞源腸炎沙門氏菌分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，56株雞源腸炎沙門氏菌分離株對(duì)22種抗生素表現(xiàn)出不同程度的耐藥性，其中對(duì)青霉素(98.21%)和紅霉素(96.43%)的耐藥性最高，對(duì)阿奇霉素(67.86%)、氨芐西林(57.14%)、復(fù)方新諾明(53.57%)、磺胺甲惡唑(50.00%)的耐藥性其次，對(duì)亞胺培南和多黏菌素B有著較高的敏感性。同時(shí)腸炎沙門氏菌對(duì)同一類藥物中不同藥物的耐藥性也存在較大的差異。在頭孢類藥物中，耐藥率依次為頭孢噻肟(37.50%)、頭孢唑啉(17.86%)、頭孢曲松(14.29%)。在喹諾酮類藥物中，耐藥率依次為環(huán)丙沙星(21.43%)、諾氟沙星(16.07%)、氧氟沙星(12.5%)和萘啶酸(8.93%)。

此外，根據(jù)每株腸炎沙門氏菌分離株的抗生素敏感性發(fā)現(xiàn)，雞源腸炎沙門氏菌分離株多重耐藥性十分嚴(yán)重，大部分菌株以多重耐藥為主，最多的耐18種抗生素；4～8重耐藥菌株最多，有44株，占78.57%；10～14重耐藥菌株有7株(12.5%)；16重和18重耐藥菌株各有1株(1.79%)。

表2 56株雞源腸炎沙門氏菌分離株對(duì)22種抗生素的敏感性試驗(yàn)結(jié)果

注：括號(hào)內(nèi)數(shù)字表示對(duì)應(yīng)判定標(biāo)準(zhǔn)下檢測(cè)出的菌株數(shù)。R表示細(xì)菌對(duì)某種抗菌藥耐藥；I表示細(xì)菌對(duì)抗菌藥中度敏感；S表示細(xì)菌對(duì)抗菌藥敏感。

2.5雞源腸炎沙門氏菌分離株耐藥基因的檢測(cè)結(jié)果

由表3可知，四環(huán)素類耐藥菌株tetA(54.84%)、tetX(41.94%)耐藥基因的檢出率較高，tetC耐藥基因檢出率為6.45%，未檢測(cè)出tetM耐藥基因；氨基糖苷類耐藥菌株中aph(3′)-Ⅱa耐藥基因的檢出率(52.94%)高于aadA1基因(35.29%)；β-內(nèi)酰胺類耐藥基因的檢出率最高，其中blaCMY-2基因的檢出率(63.63%)明顯高于blaTEM-1基因(29.09%)；氯霉素類耐藥菌株中cat1基因的檢出率為71.42%；磺胺類耐藥菌株中耐藥基因sul1、sul2、sul3的檢出率分別為53.33%、36.67%、23.33%，其中，耐藥基因sul1和sul2在4個(gè)菌株中同時(shí)存在。測(cè)序結(jié)果表明，各分離株耐藥基因序列與參照株序列具有高度的同源性。耐藥基因tetA、aph(3′)-Ⅱa、blaCMY-2、cat1和sul1的檢出率均大于50%。

表3 含耐藥基因的菌株數(shù)與耐藥菌株數(shù)的關(guān)系

3 結(jié)論與討論

影響食品安全的沙門氏菌主要血清型是腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌，其中腸炎沙門氏菌是目前流行的優(yōu)勢(shì)血清型。雞源腸炎沙門氏菌傳統(tǒng)血清學(xué)檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，敏感性和特異性均不高，常與雞白痢、鼠傷寒沙門氏菌發(fā)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)假陽性結(jié)果。為了能夠客觀、準(zhǔn)確、快速地鑒定腸炎沙門氏菌，許多學(xué)者對(duì)腸炎沙門氏菌不同基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增和檢測(cè)，尋找腸炎沙門氏菌的特異性基因，但這些基因均不能特異地檢測(cè)腸炎沙門氏菌[4]。直到Agron等[17]通過抑制消減雜交法(subtractive hybridization)篩選出腸炎沙門氏菌的種特異序列sdfⅠ ，才為建立腸炎沙門氏菌的PCR檢測(cè)方法提供了科學(xué)依據(jù)。本試驗(yàn)根據(jù)腸炎沙門氏菌sdfⅠ 序列設(shè)計(jì)引物，建立雞源腸炎沙門氏菌的PCR 檢測(cè)方法。試驗(yàn)結(jié)果表明，建立的PCR 檢測(cè)方法具有較高的可靠性、特異性和敏感性，能有效避免假陽性結(jié)果的出現(xiàn)而提高檢測(cè)準(zhǔn)確率。同時(shí)，該P(yáng)CR方法可大大縮短檢測(cè)時(shí)間，可用于臨床上雞源腸炎沙門氏菌的快速檢測(cè)及分子流行病學(xué)調(diào)查。

對(duì)56株雞源腸炎沙門氏菌臨床分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，分離株對(duì)青霉素、紅霉素、氨芐西林、阿奇霉素、磺胺甲惡唑、復(fù)方新諾明6種抗生素有很高的耐藥性，對(duì)亞胺培南和多黏菌素B有一定的敏感性。由于臨床上對(duì)某些抗生素的禁用和控制，分離菌株對(duì)氯霉素(73.21%)、痢特靈(53.57%)和萘啶酸(78.57%)的敏感率較高，說明加強(qiáng)獸藥的管理對(duì)于減少耐藥性具有一定意義。本研究還發(fā)現(xiàn)，雞源腸炎沙門氏菌分離株的多重耐藥現(xiàn)象也十分嚴(yán)重，大部分菌株以4重以上耐藥為主，4～8重耐藥菌株最多，有的菌株可耐18種抗生素。因此，臨床上一定要合理使用抗生素，嚴(yán)格控制抗生素使用類型和周期，減輕對(duì)細(xì)菌的選擇性壓力，降低細(xì)菌耐藥發(fā)生概率。

檢測(cè)細(xì)菌耐藥基因的PCR方法比藥敏試驗(yàn)快速、可靠，而且能監(jiān)測(cè)到細(xì)菌的隱性耐藥性。本研究對(duì)56株腸炎沙門氏菌分離株進(jìn)行了四環(huán)素類、氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類、氯霉素類和磺胺類5大類藥物常見耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，大部分分離株的耐藥表型與耐藥基因的分布相符合，少部分耐藥基因與耐藥表型的分布不一致。有部分菌株的耐藥表型中未能檢測(cè)到相應(yīng)的耐藥基因如tetM和blaNDM-1，其耐藥機(jī)制有待進(jìn)一步研究。也有少數(shù)菌株能夠檢測(cè)到耐藥基因，但卻未表現(xiàn)出相應(yīng)的耐藥表型，這可能是因?yàn)樵撃退幓蛱幱诔聊瑺顟B(tài)或者受到其他因素的抑制。另外，部分同類耐藥表型的菌株含有2種及以上相關(guān)的耐藥基因，這可能與細(xì)菌耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移有關(guān)[22]。

綜上，本研究建立的腸炎沙門氏菌PCR檢測(cè)方法可用于臨床上雞源腸炎沙門氏菌的快速檢測(cè)，同時(shí)可對(duì)分離的56株雞源腸炎沙門氏菌進(jìn)行耐藥性分析，這對(duì)雞源腸炎沙門氏菌的流行病學(xué)調(diào)查以及預(yù)防控制均具有重要的臨床意義。

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Establishment of Rapid Detection Method ofSalmonellaenteritidisand Drug Resistance Analysis of Isolates from Chickens

FAN Zhongjun1,XU Baojiang2,ZHAI Chongkai3,YU Chuan3,WANG Huanli1

(1.School of Marine and Biological Engineering,Yancheng Teachers University,Yancheng 224002,China; 2.Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China; 3.The Key Lab of Animal Disease and Public Security,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

To further investigate the mechanism of antibiotic resistance ofSalmonellaenteritidis(S.enteritidis),the specific primers were designed,based onsdfⅠ ofS.enteritidisfrom the GenBank.A PCR method forS.enteritidisdetection was developed after optimizing reaction conditions,and used for detection of clinicalS.enteritidisisolated from chickens.The isolates were evaluated for antimicrobial sensitivity by K-B disc diffusion method against 22 antimicrobial drugs and the resistance genes of the isolates were detected by PCR.Electrophoresis showed that 203 bp fragment was detected,and the PCR assay could detect 100 pg/μL of DNA sensitivity,and 4×103cfu/mL of the bacteria sensitivity,respectively.Compared with the traditional serological assay,the coincidence rate of the PCR for the isolates were 100%.The results of drug sensitive test showed that 56 isolates were resistance to the 22 antimicrobial agents in some degree,and penicillin(98.21%) and erythromycin(96.43%) were the highest.Test of resistance genes exhibited that the detectable rate of genetetA,aph(3′)-Ⅱa,blaCMY-2,cat1 andsul1 was higher(more than 50%).In conclusion,the developed PCR assay was more specific,sensitive and rapid for the detection ofS.enteritidis,and was able to be used for the rapid identification ofS.enteritidisand epidemiological investigation.The resistance analysis results showed that the problem of resistance was serious,and resistance genes were widely existed in the resistant strains.

chicken;Salmonellaenteritidis; detection; drug sensitive test; resistance gene

S855.1

A

1004-3268(2017)10-0137-06

2017-05-16

鹽城市農(nóng)業(yè)科技指導(dǎo)性計(jì)劃項(xiàng)目(YKN2013014)；鹽城師范學(xué)院博士科研基金項(xiàng)目(12YSYJB0116)

范忠軍(1978-)，江蘇鹽城人，講師，博士，主要從事禽類疾病預(yù)防與控制研究。E-mail:fzj811@126.com