林松挺　陳正義　鐘文洲

[摘要] 目的 研究HBx轉(zhuǎn)染對肝癌細(xì)胞株Bel-7404增殖、細(xì)胞周期以及多藥耐藥的影響，并探討HBx轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)肝癌多藥耐藥發(fā)生的可能機(jī)制。 方法 選用人肝癌Bel-7404細(xì)胞株進(jìn)行轉(zhuǎn)染，根據(jù)HBx轉(zhuǎn)染情況將細(xì)胞分為三組，分別為轉(zhuǎn)染HBx細(xì)胞組（Bel-7404-HBx組）、轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞組（Bel-7404-con組）和空白細(xì)胞組（Bel-7404組）；實(shí)時(shí)定量PCR檢測各組細(xì)胞中HBx RNA的表達(dá)。Western blot法檢測各組細(xì)胞中HBx、Notch-1和多藥耐藥蛋白（MRP）的表達(dá)，CCK-8法檢測各組細(xì)胞增殖活性和多藥耐性，流式分析儀檢測各組細(xì)胞生長周期。 結(jié)果 PCR擴(kuò)增凝膠電泳顯示Bel-7404-HBx組有HBx片段出現(xiàn)，而其他兩組未見HBx mRNA的表達(dá)；Western bolt結(jié)果顯示在Bel-7404-HBx組處有蛋白條帶（即HBx蛋白），而Bel-7404組和Bel-7404-con組未見表達(dá)。與Bel-7404組和Bel-7404-con組比較，Bel-7404-HBx組細(xì)胞增殖顯著加快（P < 0.05）；與Bel-7404組和Bel-7404-con組比較，Notch-1和MRP在Bel-7404-HBx組的蛋白表達(dá)增加；細(xì)胞周期結(jié)果顯示，與Bel-7404組和Bel-7404-con組比較，Bel-7404-HBx組G0/G1期細(xì)胞顯著減少（P < 0.05），S期顯著增加（P < 0.01），G2/M期變化不大（P > 0.05）；多藥耐藥實(shí)驗(yàn)顯示，與Bel-7404組和Bel-7404-con組比較，絲裂霉素、阿霉素、5-氟尿嘧啶、順鉑和奧沙利鉑在Bel-7404-HBx組中耐藥指數(shù)明顯增加（P < 0.05或P < 0.01）。 結(jié)論 轉(zhuǎn)染HBx的Bel-7404細(xì)胞可能通過誘導(dǎo)Notch-1與MRP的過表達(dá)，最終導(dǎo)致肝癌細(xì)胞株Bel-7404增殖能力增強(qiáng)和多藥耐藥的發(fā)生。

[關(guān)鍵詞] HBx；肝癌細(xì)胞株；Bel-7404；Notch信號通路；多藥耐藥蛋白；多藥耐藥

[中圖分類號] R735.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）09（c）-0016-05

[Abstract] Objective To study the effects of HBx transfection on proliferation， cell cycle， and multidrug resistance of hepatocellular carcinoma cell line Bel-7404， and to investigate the possible mechanism of HBx transfection in inducing the multidrug resistance of liver cancer. Methods Human hepatocellular carcinoma cell line Bel-7404 was transfected， and the cells were divided into three groups according to the transfection conditions， which were transfected HBx cell group （Bel-7404-HBx group）， transfected cell group with empty vector （Bel-7404-con group） and blank cells group （Bel-7404 group）. The expression of HBx RNA in all groups was detected by real-time PCR. The expression of HBx， Notch-1 and multi-drug resistance protein （MRP） in all groups was detected by Western blot， the cell proliferation activity and multidrug resistance in all groups were determined by CCK-8， and the cell growth cycle was analyzed by flow cytometer. Results PCR amplified gel electrophoresis showed that HBx fragments were detected in Bel-7404-HBx group， while no HBx mRNA expression could be found in the other two groups； Western blot indicated that the protein band （HBx protein） was detected in the Bel-7404-HBx group， while no expression was found in Bel-7404 group and Bel-7404-con group. Furthermore， compared with Bel-7404 group and Bel-7404-con group， the cell proliferation in Bel-7404-HBx group was increased significantly （P < 0.05）； compared with Bel-7404 group and Bel-7404-con group， the protein expression of Notch-1 and MRP in Bel-7404-HBx group was increased significantly； the results of cell cycle showed that， compared with Bel-7404 group and Bel-7404-con group， the number of cells in G0/G1 phase was decreased significantly （P < 0.05）， which was significantly increased in S phase （P < 0.01）， while there was no significant differences in G2/M phase （P > 0.05）； multidrug resistance experiments showed that， compared with Bel-7404 group and Bel-7404-con group， the resistance index of Mitomycin， Adriamycin， 5-Fluorouracil， Cisplatin and Oxaliplatin in the Bel-7404-HBx group was increased significantly （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Bel-7404 cells transfected by HBx may induce overexpression of Notch-1 and MRP， leading to the increase of multiplication capacity of hepatocellular carcinoma cell line Bel-7404 and the occurrence of multidrug resistance.endprint

[Key words] HBx； Hepatocellular carcinoma cell line； Bel-7404； Notch signaling pathway； Multi-drug resistance protein； Multidrug resistance

傳統(tǒng)意義上的化療對肝癌的治療雖然取得了一定的療效，但是具有較大的毒副作用，其潛在引起了腫瘤細(xì)胞的耐藥性，并引發(fā)腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散與轉(zhuǎn)移[1]。多藥耐藥是影響化療療效以及導(dǎo)致患者死亡的主要原因[2]。肝癌對化療藥物相對不敏感，對其如何發(fā)生多藥耐藥的機(jī)制仍不清楚，因此尋找多藥耐藥的原因尤為關(guān)鍵。HBx由HBV基因組編碼，具有多種調(diào)控功能，能激活多個(gè)與腫瘤侵襲相關(guān)的原癌基因及轉(zhuǎn)錄因子，是肝細(xì)胞癌發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[3-5]。Notch信號通路是一個(gè)重要的高度保守的細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其作用廣泛。最近的研究表明，Notch信號通路不僅對胚胎期腎臟的發(fā)育起至關(guān)重要的作用，而且參與多種腫瘤疾病的發(fā)生和發(fā)展[6]，Notch通路能夠通過血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）促進(jìn)腫瘤血管的發(fā)生，從而參與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長[7]，多藥耐藥蛋白（MRP）的過表達(dá)是肝癌產(chǎn)生多藥耐藥（MDR）的重要機(jī)制[8-9]。本研究采用基因轉(zhuǎn)染的方法將HBx基因轉(zhuǎn)入肝癌Bel-7404細(xì)胞中，觀察HBx對Bel-7404細(xì)胞中Notch信號通路和MRP表達(dá)的影響，并探討轉(zhuǎn)染對肝癌細(xì)胞增殖和多藥耐藥的影響及其可能的作用機(jī)制，為Bel-7404的防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人肝癌Bel-7404細(xì)胞株購自中科院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫，本所傳代保存，置于37℃、5%CO2、含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基（Thermo Fisher Scientific，MA，USA）的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2 試劑

DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)液（美國Gibco公司，批號：12100046）；DMEMF12（美國Gibco公司，批號：12400 024）；HBSS緩沖液（上海研卉生物技術(shù)有限公司，批號：BS0101）；FcR阻斷劑、寡核苷酸引物根據(jù)HBx基因的序列自行設(shè)計(jì)引物，由長沙贏潤生物公司合成；Trizol裂解液（美國賽默飛世爾科技，批號：15596026）；Taqman MicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國賽默飛世爾科技，批號：4366596）；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒（美國賽默飛世爾科技，批號：722255）；Annexin-V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（上海前塵生物科技有限公司，批號：40302ES20），B27補(bǔ)充劑（美國GIBCO，批號：17504-044）；CCK-8試劑盒（上海鈺博，批號：YB1198）；小牛血清（北京索萊寶公司，批號：01-045）；胰蛋白酶（北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司，批號：HB-0103-01）；RPMI-1640培養(yǎng)基（美國GIBCO公司，批號：11875-093）。

1.3 方法

1.3.1 重組X質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌Bel-7404細(xì)胞 Bel-7404細(xì)胞生長于含10%胎牛血清的DMEN中，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法分別將重組x質(zhì)粒、未重組x質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入Bel-7404細(xì)胞中，命名為轉(zhuǎn)染HBx細(xì)胞組（Bel-7404-HBx組）、轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞組（Bel-7404-con組）和空白細(xì)胞組（Bel-7404組），具體步驟如下：選取對數(shù)生長期Bel-7404細(xì)胞，胰酶消化接種于直徑25 cm培養(yǎng)瓶，細(xì)胞數(shù)為1×106/L，6 h后細(xì)胞即可貼壁，繼而進(jìn)行轉(zhuǎn)染。37℃預(yù)熱的無血清培養(yǎng)基加入DNA 5 μg、Trans Fast Reagent 15 μL，立即渦旋混勻，室溫下靜置10～15 min。小心移出培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基，稍渦旋混勻脂質(zhì)體/DNA混合物，輕輕加入培養(yǎng)瓶中，37℃孵育24 h，輕輕加入含血清的培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基）4 mL，不必移去脂質(zhì)體/DNA混合物，37℃繼續(xù)孵育48 h。

1.3.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測HBx mRNA的表達(dá) TRIzol試劑提取并收集處于對數(shù)生長期的三組肝癌Bel-7404細(xì)胞的HBx mRNA，RNA的完整性利用1%的瓊脂糖變性凝膠電泳進(jìn)行檢測，RNA的純度和濃度利用紫外可見分光光度計(jì)檢測；在70℃（10 min）、冰育（2 min）、42℃（60 min）、70℃（10 min）反應(yīng)條件下，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA；在95℃（5 s）、60℃（20 s）、72℃（5 s）的反應(yīng)條件下進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，40個(gè)循環(huán)，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。

1.3.3 Western blot法檢測肝癌Bel-7404細(xì)胞中HBx、Notch-1和MRP的表達(dá) 轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組進(jìn)行細(xì)胞總蛋白的提取，通過Bradford的方法調(diào)整相同的蛋白濃度后，進(jìn)行電泳獲得根據(jù)分子量分離的蛋白條帶，根據(jù)Pierce公司W(wǎng)estern blot顯像試劑盒的指導(dǎo)說明來進(jìn)行，蛋白的NC膜電轉(zhuǎn)，進(jìn)行蛋白封閉和一抗結(jié)合，一抗結(jié)合后洗脫，再進(jìn)行二抗孵育標(biāo)記兔抗大鼠的多克隆抗體。ECL試劑盒顯色后，暗室發(fā)光拍照，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行系統(tǒng)軟件分析。

1.3.4 CCK8法檢測細(xì)胞增殖活性 取三組細(xì)胞以1×106/L接種于96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)48 h后每孔加入10 μL CCK8試劑，4 h后在450 nm波長下檢測各孔OD值，重復(fù)3次取均值。以O(shè)D值為縱坐標(biāo)、時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.3.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 收集轉(zhuǎn)染48 h后的三組細(xì)胞，用冷PBS洗滌細(xì)胞后加入體積分?jǐn)?shù)70%冷乙醇固定過夜。用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，采用Cell Quet軟件分析細(xì)胞周期分布情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 各組細(xì)胞耐藥性檢測 將三組處于對數(shù)生長的Bel-7404細(xì)胞制成濃度為1×106/L的細(xì)胞懸液，每孔100 μL，接種于96孔板，每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔。孵育24 h后，換用濃度為0.5、1、2.5、5、10、25、50、100 μmol/L絲裂霉素、阿霉素培養(yǎng)液，0.5、1、2.5、5、10、25、50、100、250、500 μmol/L 5-氟尿嘧啶、順鉑、奧沙利鉑培養(yǎng)液。孵育48 h后，去除含藥液，每孔加100 μL不含藥培養(yǎng)基和10 μL CCK-8，設(shè)空白孔。孵育2 h后，酶標(biāo)儀測吸光度值，設(shè)a為加藥組的吸光度，b為不加藥細(xì)胞組的吸光度，c為無細(xì)胞的空白組的吸光度，藥物對細(xì)胞的抑制率（%）=1-[（a-c）/（b-c）]×100%。計(jì)算5種藥物抑制率為50%的濃度（IC50）和耐藥指數(shù)（RI），RI=耐藥細(xì)胞IC50/親本細(xì)胞IC50。endprint

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HBx mRNA的表達(dá)

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，可見Bel-7404-HBx組有目的片段出現(xiàn)，而其他兩組未見HBx mRNA的表達(dá)。見圖1。

2.2 HBx蛋白的表達(dá)

Western bolt結(jié)果顯示，在Bel-7404-HBx組處有蛋白條帶（即HBx蛋白），而Bel-7404組和Bel-7404-con組未見表達(dá)。Notch-1和MRP在三組中的表達(dá)不同，在Bel-7404-HBx組的蛋白條帶最大，Bel-7404-con組次之，Bel-7404組最小。見圖2。

2.3 轉(zhuǎn)染HBx后各組細(xì)胞的生長曲線

與Bel-7404組和Bel-7404-con組比較，Bel-7404-HBx組細(xì)胞增殖顯著加快（P < 0.05或P < 0.01）。見圖3。

2.4 轉(zhuǎn)染HBx后細(xì)胞周期變化

與Bel-7404組和Bel-7404-con組比較，Bel-7404-HBx組G0/G1期細(xì)胞顯著減少（P < 0.05），S期顯著增加（P < 0.01），G2/M期變化不大（P > 0.05）。見表1。

2.5 耐藥性比較

與Bel-7404組和Bel-7404-con組比較，5種藥物在Bel-7404-HBx組中耐藥指數(shù)增加明顯（P < 0.05或P < 0.01），意味著Bel-7404-HBx組耐藥性增強(qiáng)，對且多種化療藥物產(chǎn)生耐藥。見表2。

3 討論

HBV慢性感染是世界范圍內(nèi)原發(fā)性肝細(xì)胞癌的主要發(fā)病原因之一[10]，HBx基因致肝細(xì)胞癌發(fā)生的機(jī)制是目前研究的熱點(diǎn)。HBx基因存在于HBV基因的第4個(gè)閱讀框，具有強(qiáng)大的生物學(xué)功能，包括轉(zhuǎn)錄反式激活病毒基因組和宿主細(xì)胞基因、增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合特性、抑制p53蛋白活性、參與細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑和細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)等。這些功能可能與肝細(xì)胞癌的發(fā)生具有密切的關(guān)系[11]。研究發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞組織中HBx呈彌漫性表達(dá)。一些體內(nèi)及體外研究也發(fā)現(xiàn)HBx可誘導(dǎo)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化甚至參與癌變發(fā)生[12-13]。因此，觀察HBx對體外細(xì)胞增殖的影響，可為進(jìn)一步研究HBx致肝細(xì)胞癌的發(fā)生機(jī)制提供依據(jù)和線索。

Notch信號在腫瘤的發(fā)生和演進(jìn)過程中有重要作用，紊亂的Notch信號不僅能夠直接引起腫瘤的發(fā)生，而且可通過與其他多條信號通路的交互作用，以間接的方式最終誘導(dǎo)腫瘤的形成[14]，在很多組織腫瘤的發(fā)生過程中均出現(xiàn)了Notch信號通路的異常，Notch信號的激活可通過促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑肝癌細(xì)胞凋亡活化的Notch-1，通過增強(qiáng)CDK2和CycIinD的活性而促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)程[15]。本研究中利用qPCR檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染的Bel-7404細(xì)胞內(nèi)HBx的RNA和蛋白表達(dá)明顯，這意味著轉(zhuǎn)染Bel-7404細(xì)胞后構(gòu)建過表達(dá)HBx的肝癌細(xì)胞成功。本研究還發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染HBx的人肝癌Bel-7404細(xì)胞中的Notch-1蛋白表達(dá)明顯高于Bel-7404組和Bel-7404-con組，提示Bel-7404細(xì)胞中HBx的過表達(dá)誘導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)Notch-1表達(dá)水平的增加，造成細(xì)胞內(nèi)Notch信號通路的紊亂。同時(shí)細(xì)胞增殖和周期檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染HBx后細(xì)胞增殖能力顯著提高，細(xì)胞生長周期S期增加，提示Notch-1的活化誘導(dǎo)了Bel-7404細(xì)胞增殖的發(fā)生。

腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞治療失敗和疾病復(fù)發(fā)的主要原因之一[16]。有報(bào)道指出，檢測患者體內(nèi)MRP的表達(dá)可以作為監(jiān)測惡性腫瘤細(xì)胞原發(fā)性耐藥的主要指標(biāo)[17-18]。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生MRP與藥物外排泵ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的過度表達(dá)與細(xì)胞凋亡水平異常改變、DNA修復(fù)活性增強(qiáng)、細(xì)胞內(nèi)酶異常改變和器官微環(huán)境改變有密切關(guān)系[19]，此外Notch-1信號與腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的形成有重要的聯(lián)系，過表達(dá)的Notch-1能夠增加與多藥耐藥相關(guān)的ABBCC1基因的表達(dá)，誘導(dǎo)多藥耐藥現(xiàn)象的形成[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染HBx的Bel-7404細(xì)胞多藥耐藥明顯增強(qiáng)，這意味著轉(zhuǎn)染HBx的Bel-7404細(xì)胞可能通過誘導(dǎo)Notch-1和MRP的過表達(dá)，最終導(dǎo)致多藥耐藥的發(fā)生。此外，在此研究基礎(chǔ)上檢測Notch通路的活化情況及由此引起凋亡抑制蛋白livin的表達(dá)，同時(shí)研究livin的表達(dá)后多藥耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，并觀察HBx、Notch通路活化、livin蛋白及多藥耐藥蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性是下一步的研究重點(diǎn)，為乙肝相關(guān)性肝細(xì)胞癌開展新的臨床治療提供新靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2017-06-13 本文編輯：張瑜杰）endprint