莊 艷

(重慶警察學(xué)院, 重慶 401331)

簡(jiǎn)化基因測(cè)序技術(shù)在植物檢材個(gè)體認(rèn)定中應(yīng)用初探

莊 艷

(重慶警察學(xué)院, 重慶 401331)

目的 在涉及中草藥真假辨識(shí)及個(gè)體識(shí)別的案件中很大比例的植物類物證都無(wú)法用形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)方法來(lái)鑒別，而植物DNA測(cè)序分析技術(shù)為我們提供了一種強(qiáng)有力的手段。方法 通過對(duì)18個(gè)桂花植物樣品進(jìn)行DNA建庫(kù)和高通量測(cè)序、序列多態(tài)性分析，評(píng)估其遺傳多樣性，并用基于單核苷酸多態(tài)性分析方法探討了簡(jiǎn)化基因測(cè)序技術(shù)用于個(gè)體識(shí)別的案例。結(jié)果 未知植物物證樣品A與桂花1的匹配度最高，未知植物物證樣品B與桂花4匹配度最高，未知植物物證樣品B與桂花11的匹配度最高，該方法能成功識(shí)別3個(gè)盲測(cè)樣品。

簡(jiǎn)化基因測(cè)序技術(shù)； 單核苷酸多態(tài)性； 桂花； 個(gè)體識(shí)別

0 引言

很多涉及食品安全的案件中常常出現(xiàn)植物類物證，而植物是犯罪現(xiàn)場(chǎng)中一種很容易被忽視的環(huán)境和過程證據(jù)，大多這些植物類物證都無(wú)法用形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)方法來(lái)鑒別，需要借助植物DNA技術(shù)手段，對(duì)植物物證的來(lái)源和種類進(jìn)行鑒定，如果能對(duì)案件中涉及的植物類材料進(jìn)行物種鑒別，進(jìn)而建立起人與物的環(huán)境或者過程關(guān)系，那鑒定結(jié)果對(duì)偵查破案和法庭訴訟產(chǎn)生重要的指導(dǎo)和支撐作用[1-3]。

RAD-seq(Restriction Association site DNA sequencing)技術(shù)是在第二代測(cè)序技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，利用限制性內(nèi)切酶對(duì)基因組進(jìn)行酶切，結(jié)合一定大小的插入片段文庫(kù)，通過高通量測(cè)序和信息分析，快速鑒定成千上萬(wàn)的單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)信息，獲得的SNP位點(diǎn)信息可以較好的代表整個(gè)基因組的序列特征，RAD-seq技術(shù)操作簡(jiǎn)單、可簡(jiǎn)化復(fù)雜基因組，而且可以不受參考基因組限制，目前已廣泛應(yīng)用于分子育種、系統(tǒng)進(jìn)化等領(lǐng)域[4]。但RAD-seq技術(shù)應(yīng)用于涉及植物個(gè)體識(shí)別的鑒定案例還未見報(bào)道。

本文選擇沒有可參考基因組的植物物證桂花作為研究對(duì)象，利用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)來(lái)降低基因組測(cè)序和分析的復(fù)雜度，構(gòu)建桂花的個(gè)體識(shí)別數(shù)據(jù)庫(kù)，試圖找到能識(shí)別桂花同一個(gè)體的方法。

1 材料與方法

桂花樣品全部與2015年10月采自西南大學(xué)校園里，每棵桂花樹隨機(jī)采集2～4片葉片，置于4 ℃冰箱備用，將選取的葉片樣品，提取總基因組DNA進(jìn)行分析。

2 RAD-seq的主要技術(shù)流程

2.1 利用限制性內(nèi)切酶對(duì)基因組DNA樣品進(jìn)行酶切，保證產(chǎn)生的RAD標(biāo)記能夠在基因組上均有分布，同時(shí)獲得的RAD標(biāo)記數(shù)量能夠達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需的飽和度。

2.2 建庫(kù)主要步驟如下：

(1) 用限制性酶消化基因組DNA，并在酶切片段兩端加P1接頭；(2) 對(duì)連接P1 接頭的DNA片段進(jìn)行pooling，并隨機(jī)打斷，收集長(zhǎng)度在350～550 bp之間的片段；(3) 在回收片段兩端加P2接頭。P2接頭為分叉的Y 型接頭，可阻止未連接P1接頭的片段擴(kuò)增；(4) 選擇連接了P1接頭的RAD tag進(jìn)行擴(kuò)增。

2.3 上機(jī)測(cè)序

將 PCR 后產(chǎn)物進(jìn)行DNA片段回收，并對(duì)最終構(gòu)建完成的文庫(kù)利用安捷倫2100r文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)。RAD-seq測(cè)序平臺(tái)的測(cè)序儀器為Illumina Hiseq 4000。

2.4 數(shù)據(jù)產(chǎn)出

采用Illumina Hiseq4000測(cè)序儀對(duì)RAD文庫(kù)進(jìn)行序列測(cè)定。對(duì)所測(cè)得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，其過濾標(biāo)準(zhǔn)如下：(1)僅使用含有 Hind Ⅲ酶切識(shí)別位點(diǎn)Read1序列；(2)reads序列整體質(zhì)量Q30>85%；(3)如果一條read，它的低質(zhì)量(Q≤5(E)) 的堿基數(shù)占整條read的50%以上，則去掉該reads；(4)去除前5bp不是酶切序列AATTC的reads(5)整條序列中不確定堿基不多于 3 個(gè)；(6)去除含有dupulication的reads；(7)去除PolyAreads。過濾后的序列根據(jù)index序列劃分到具體個(gè)體，便于后續(xù)分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 測(cè)序基本信息分析

如表1所示，獲得15個(gè)已知植物物證桂花樣本以及3個(gè)未知植物物證桂花樣本的原始DNA序列，根據(jù)如下標(biāo)準(zhǔn)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾：(1)僅使用含有Hind Ⅲ酶切識(shí)別位點(diǎn)Read1序列；(2)利用Q30標(biāo)準(zhǔn)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估；(3)所得的序列的前50 bp不存在不確定堿基；(4)整條序列中不確定堿基不多于3個(gè)。

15個(gè)已知桂花樣本的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過濾后共產(chǎn)出3.47 Gb clean data，3個(gè)未知樣本的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過濾后共產(chǎn)出746 Mb clean data。并且G和C含量相近，A和T含量相近，說明測(cè)序質(zhì)量較好。從整體數(shù)據(jù)量來(lái)看，數(shù)據(jù)有效率高達(dá)97.28%。經(jīng)過濾后，共獲得6,638,587,602 bp的Clean data，平均每個(gè)個(gè)體數(shù)據(jù)高達(dá)368 810 422 bp，數(shù)據(jù)量統(tǒng)計(jì)如表1所示。

表1 植物物證桂花樣本測(cè)序質(zhì)量統(tǒng)計(jì)表

3.2 SNP的查找檢測(cè)和建庫(kù)

利用RAD技術(shù)對(duì)過濾后的數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類和SNP的查找，然后得出初步的SNP的可能位點(diǎn)，且先對(duì)15個(gè)已知樣品通過聚類獲得的初始SNP進(jìn)行初步過濾，得到SNP數(shù)量為119 708 5個(gè)，過濾標(biāo)準(zhǔn)如下：所有SNP位點(diǎn)總深度須大于等于4，如果SNP為雜合型則次好堿基深度須大于等于2。

如表2所示，植物物證桂花樣品獲得的SNP數(shù)量從3 373到158 467不等，樣品平均SNP數(shù)量為79 805。Mc Carroll.S.A認(rèn)為群體遺傳上的差異主要是通過對(duì)其群體上SNP位點(diǎn)信息，來(lái)進(jìn)行群體間遺傳多樣性的分析[5]。本實(shí)驗(yàn)獲得SNP數(shù)量最多的是植物物證桂花9，最少的是桂花8。雜合度最高個(gè)體是桂花4，高達(dá)83.52%。植物物證桂花個(gè)體的SNP的差異性反映了個(gè)體間的多態(tài)性。

3.3 建庫(kù)比對(duì)分析法

為進(jìn)一步解析系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果的推測(cè)，本文進(jìn)一步通過建立SNP數(shù)據(jù)庫(kù)和未知植物物證樣品的SNP位點(diǎn)比較來(lái)找出具有區(qū)分效力的SNP子集，并建立個(gè)體識(shí)別的分析方法。

表2 經(jīng)過濾所得的SNP信息

通過RAD-seq技術(shù)獲得15個(gè)桂花樣本的SNP數(shù)據(jù)集，對(duì)此數(shù)據(jù)集進(jìn)行篩選(篩選原則：純合SNP深度至少為4，雜合SNP的次好深度至少為2)，將至少在15個(gè)樣本都存在的136個(gè)SNP位點(diǎn)和至少在14個(gè)桂花樣本都存在1 046個(gè)SNP位點(diǎn)，獲得 共計(jì)1 182個(gè)SNP位點(diǎn)，然后用這1 182個(gè)SNP數(shù)據(jù)集建庫(kù)。

3.3.1 盲測(cè)單樣品tag簇嚴(yán)格過濾分析

通過RAD-seq技術(shù)分別獲得3個(gè)未知樣本的SNP數(shù)據(jù)集，遵循以上原則進(jìn)行篩選，然后將得到的SNP位點(diǎn)信息與SNP庫(kù)做比對(duì)，最終得出的統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表3。

表3 未知樣品A、B、C的SNP位點(diǎn)信息與桂花數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)的結(jié)果

從表3中可以看出，未知植物物證桂花樣品A的SNP位點(diǎn)信息與桂花數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后，桂花1與未知植物物證樣品A的比對(duì)符合度最高，有148個(gè)位點(diǎn)符合，符合率達(dá)到12.52%；未知植物物證樣品B的SNP位點(diǎn)信息與桂花數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后，桂花4與未知樣品B的比對(duì)的符合度最高，有116個(gè)位點(diǎn)符合，符合率達(dá)到9.81%；未知植物物證樣品C的SNP位點(diǎn)信息與桂花數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后，桂花11與未知樣品C的比對(duì)的符合度最高，有112個(gè)位點(diǎn)符合，符合率達(dá)到9.48%。從而推測(cè)出A、B、C三個(gè)未知植物物證樣品分別是桂花1、桂花4、桂花11。分析結(jié)果剛好也驗(yàn)證了系統(tǒng)發(fā)育樹的推測(cè)，且與實(shí)際情況吻合。

3.3.2 盲測(cè)單樣品tag簇寬松條件過濾分析

將3個(gè)未知植物物證樣品的數(shù)據(jù)產(chǎn)出結(jié)果進(jìn)行聚類，并進(jìn)行過濾(過濾原則：將tag中不含有N值并且至少有兩個(gè)tag聚類在一起的tag提取出來(lái))，將過濾后的聚類結(jié)果與本文15個(gè)植物桂花樣本所建的SNP庫(kù)做比對(duì)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下表4。

表4 3個(gè)未知樣品聚類與桂花SNP數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果

3個(gè)未知植物物證樣品同時(shí)與桂花SNP數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，從中可以近似地看出這樣一種情況：未知植物物證樣品A與數(shù)據(jù)庫(kù)中的桂花1重疊度最高，重疊SNP位點(diǎn)達(dá)234，未知植物物證樣品B與數(shù)據(jù)庫(kù)中的桂花4重疊度最高，重疊SNP位點(diǎn)達(dá)227，未知植物物證樣品C與數(shù)據(jù)庫(kù)中的桂花11重疊度最高，重疊SNP位點(diǎn)達(dá)220。這種數(shù)據(jù)分析結(jié)果也很好的驗(yàn)證了系統(tǒng)發(fā)育樹的推測(cè)和盲測(cè)單樣品tag簇嚴(yán)格過濾分析結(jié)果，說明該分析方法是可行且有效的。

4 結(jié)果與討論

在涉及食品安全案件中，如何快速、準(zhǔn)確地鑒別中藥材的易混品，以及在涉及鑒別植物個(gè)體的案件中建立一種行為人及受害者可控物品中附著植物與案件現(xiàn)場(chǎng)的植物是否存在同一性聯(lián)系的方法就顯得尤為重要[6]。本文首次嘗試?yán)肦AD-seq技術(shù)來(lái)識(shí)別桂花個(gè)體同一性，用未知桂花個(gè)體與已知建庫(kù)中的桂花個(gè)體比對(duì)分析，得出兩個(gè)桂花個(gè)體的特征點(diǎn)相同，存在同一性聯(lián)系，這對(duì)于查找破案線索，劃定偵查范圍往往具有重要的意義。

傳統(tǒng)的分析方法都是制作系統(tǒng)發(fā)育樹，通過分析樣本之間的親緣關(guān)系來(lái)識(shí)別3個(gè)未知樣本。本文的數(shù)據(jù)采用建庫(kù)比對(duì)分析法來(lái)區(qū)分未知植物樣品，不管是盲測(cè)單樣品tag簇寬松條件或者是盲測(cè)單樣品tag簇嚴(yán)格過濾條件的分析結(jié)果，可以得到即：未知植物物證樣品A與桂花1的匹配度最高，未知植物物證樣品B與桂花4匹配度最高，未知植物物證樣品C與桂花11的匹配度最高，也就是說，我們鑒定出未知植物物證樣品A、B、C對(duì)應(yīng)庫(kù)中桂花個(gè)體1、4和11。這些不同角度的分析方法都進(jìn)一步說明數(shù)據(jù)分析的可靠性。

未知植物物證樣品A與桂花1有148條SNP位點(diǎn)信息相吻合，符合度達(dá)到了12.5%，這12.5%的吻合度是否可以對(duì)未知植物物證的樣品A與桂花1的同一認(rèn)定做出定性的判斷？在今后的不同物種個(gè)體識(shí)別的研究中，是否可以建立一個(gè)最低的認(rèn)定標(biāo)準(zhǔn)做定性判斷，這些問題還需要大量的樣本和實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步確定。

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(責(zé)任編輯于瑞華)

D918.93

重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計(jì)劃項(xiàng)目(cstc2014jcyiA00012)階段性成果;重慶市教委科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目(KJ1501502)。

莊 艷(1980—)，女，新疆昌吉人，博士，講師。研究方向?yàn)橹参镂镒C鑒定技術(shù)。