張勇， 卜春曉， 程敬亮， 李顏良

·實驗研究·

丁苯酞對缺血腦組織RGMa表達及軸索損傷的影響

張勇， 卜春曉， 程敬亮， 李顏良

目的探討丁苯酞對缺血性腦損傷后缺血腦組織排斥導向分子(RGMa)表達的影響。方法120只成年雄性SD大鼠，隨機分為假手術(shù)組，大腦中動脈閉塞(MCAO)模型組，生理鹽水組，丁苯酞干預組。選取缺血后1h、3h、6h、12h、24h，進行神經(jīng)功能評分，免疫組織化學觀察RGMa的表達情況。結(jié)果MCAO模型組、生理鹽水組、丁苯酞組的改良的神經(jīng)功能評分(mNSS)均高于假手術(shù)組，且隨著時間的延長，mNSS評分越高；在缺血后3h、6h、12h、24h時，丁苯酞組的mNSS評分較MCAO模型組降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。MCAO模型組、生理鹽水組大鼠缺血后，不同時間點缺血區(qū)的RGMa蛋白陽性表達均有所增加，呈棕黃色染色。局灶性腦缺血后RGMa蛋白表達逐漸增多，在12h表達量最多；丁苯酞組在相應時間點的RGMa蛋白的表達較MCAO模型組有所降低，在6h、12h、24h時間點差異具有統(tǒng)計學意義。結(jié)論丁苯酞可減少缺血性腦損傷大鼠的缺血腦組織的RGMa的表達，從而發(fā)揮神經(jīng)功能保護作用。

丁苯酞； 腦缺血； 軸索損傷； 模型，動物

丁苯酞是我國自主研發(fā)的化學藥物，其通過改善缺血區(qū)微循環(huán)降低缺血再灌注損傷，改善缺血腦組織的能量代謝、保護線粒體功能、抑制氧自由基等而發(fā)揮腦保護作用[1-3]，但其保護機制仍待進一步研究。排斥導向分子A(RGMa)是近年發(fā)現(xiàn)神經(jīng)再生的排斥導向分子，中樞神經(jīng)受損后，其生長錐塌陷，軸突結(jié)構(gòu)受到嚴重破壞，將導致神經(jīng)突起間聯(lián)系的中斷，細胞間信息的傳遞受損，從而導致神經(jīng)功能的損傷[4，5]。本研究觀察丁苯酞干預后局灶性缺血大鼠RGMa表達以及軸索損傷的影響，為臨床治療提供實驗依據(jù)。

材料與方法

1.實驗分組

挑選清潔級健康成年的SD雄性大鼠120只，體重為280～300 g，平均(293.4±5.8) g，實驗所用SD大鼠均由河南省動物實驗中心提供[實驗動物使用許可證號：SCXK(豫)2010-0002]。動物隨機分為假手術(shù)組、MCAO模型組、生理鹽水組和丁苯酞組，每組分1h、3h、6h、12h、24h 5個時間點。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg體重)麻醉，MCAO模型組參照Longa等[6]報道使用線栓法制作大鼠左側(cè)大腦中動脈缺血模型；假手術(shù)組大鼠不插入線栓，其余步驟同MCAO模型組；丁苯酞干預組，Tween80溶液稀釋丁苯酞膠囊(由石藥集團恩必普藥業(yè)有限公司提供，批號09110611)，MCAO模型制作后腹腔注射給藥，大鼠給藥劑量按80 mg/kg計算；生理鹽水組，MCAO模型制作后腹腔注射給予相同體積的生理鹽水。

圖1 大鼠缺血后不同時間點mNSS。* 代表與MCAO模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(α =0.05，P<0.05)。 圖2 大鼠缺血后不同時間點缺血側(cè)腦組織RGMa蛋白的表達水平。* 代表與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學意義(α=0.05，P<0.05)。# 代表與MCAO模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(α=0.05，P<0.05)。

2.大鼠神經(jīng)功能評分

采用文獻報道[7]的改良的大鼠神經(jīng)功能評分標準(Modified neurological severity scores，mNSS)，在相應時間點對大鼠進行神經(jīng)功能評分。嚴重損傷13～18，中度損傷7～12，輕度損傷1～6。評分標準如表1。

表1 相應時間點對大鼠的神經(jīng)功能評分標準

3.免疫組織化學檢測RGMa及軸突神經(jīng)絲蛋白-200(NF-200)表達

大鼠麻醉、灌注后取腦，放入4% PFA中固定，24 h后做石蠟包埋，制作石蠟切片( 片厚4 μm) 。用二甲苯和梯度酒精脫蠟，3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶10 min，枸櫞酸緩沖液熱修復抗原6 min×4 次，1% TritonX 細胞通透20 min，山羊血清封閉30 min，RGMa兔多克隆抗體(1:50，英國Abcam公司) 及小鼠抗NF-200 一抗(1:100，武漢博士德生物技術(shù)有限公司)孵育并于4℃過夜。再用生物素標記的山羊抗兔IgG/山羊抗小鼠IgG孵育，辣根酶標記的鏈霉卵白素孵育30 min，二抗試劑盒( 北京中杉生物技術(shù)有限公司) 。最后二氨基聯(lián)苯胺(DAB) 顯色、梯度脫水及封片。

4.統(tǒng)計學方法

結(jié) 果

1.各組不同時間點大鼠神經(jīng)功能評分

按mNSS評分標準對4組大鼠進行行為學評分，假手術(shù)組大鼠未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀，MCAO模型組、生理鹽水組及丁苯酞組大鼠的mNSS評分差異具有統(tǒng)計學意義(重復測量設計方差分析，F(xiàn)=64.39，P=0.00)。進一步采用LSD法兩兩比較，缺血后第3h、6h、12h、24h時，丁苯酞組與MCAO模型組(P<0.05)、丁苯酞組與生理鹽水組(P<0.05) 大鼠的mNSS評分差異均具有統(tǒng)計學意義；生理鹽水組和MCAO模型組相比差異無統(tǒng)計學意義(圖1)。

2.各組不同時間點大鼠腦皮質(zhì)及海馬RGMa 蛋白表達

假手術(shù)組大鼠腦皮質(zhì)及海馬區(qū)可見少量RGMa蛋白陽性細胞，著色較弱。缺血性腦梗死第1h，MCAO模型組、生理鹽水組及丁苯酞組大鼠RGMa 蛋白陽性細胞增多，對RGMa蛋白表達半定量分析可得，4組間RGMa蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義(F=421.50，P=0.00)。給予丁苯酞治療后，在相應時間點同MCAO模型組相比，丁苯酞組大鼠腦皮質(zhì)RGMa蛋白的表達明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2、3)。進一步采用Western blot法檢測RGMa蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)同免疫組化相似的趨勢，假手術(shù)組大鼠缺血腦梗死灶周圍腦皮質(zhì)僅有少量RGMa蛋白表達。同假手術(shù)組相比，MCAO模型組大鼠RGMa蛋白表達顯著增高(P<0.05)，給予丁苯酞治療后，在相應時間點同MCAO模型組相比，丁苯酞干預組大鼠腦皮質(zhì)RGMa蛋白的表達水平明顯下降(P<0.05，圖4)。

圖3 不同組大鼠缺血后不同時間點缺血腦組織的RGMa的表達。A0代表假手術(shù)組；A1-A5分別為MCAO模型組1h、3h、6h、12h、24h缺血區(qū)腦組織RGMa蛋白表達。隨著腦梗死時間的延長，RGMa蛋白表達逐漸增加，12h達到最高值，在24h稍降低；B1-B5分別為生理鹽水組1h、3h、6h、12h、24h缺血區(qū)腦組織RGMa蛋白表達，RGMa蛋白表達與MCAO模型組無明顯差異；C1-C5分別為丁苯酞組1h、3h、6h、12h、24h缺血區(qū)腦組織RGMa蛋白表達，RGMa蛋白表達較MCAO模型組降低。

圖4 大鼠缺血后不同時間點缺血腦組織NF-200蛋白的表達水平。*代表與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學意義(α=0.05，P<0.05)。# 代表與MCAO模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(α=0.05，P<0.05)。

3.各組不同時間點大鼠腦皮質(zhì)及海馬NF-200蛋白表達

假手術(shù)組大鼠的免疫組化染色顯示缺血性腦梗死灶周圍腦皮質(zhì)有大量 NF-200反應陽性的細胞；MCAO模型組大鼠在缺血3h時NF-200反應陽性細胞顯著減少，陽性纖維結(jié)構(gòu)紊亂，突起中斷，長度明顯縮短，并隨著時間的延長這種現(xiàn)象越明顯。對NF-200蛋白表達半定量分析可得，4組間NF-200蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義(F=310.82，P=0.00)。丁苯酞組同MCAO模型組相比，大鼠腦皮質(zhì)及海馬NF-200蛋白陽性細胞數(shù)目有所增加，在1h和3h這種差異沒有統(tǒng)計學意義，在6h、12h及24h差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖4、5)。

討 論

RGMa已被證實是一類具有抑制軸突再生的排斥性分子，排斥導向分子(repulsive guidance molecule，RGM)最初被認為是連接視網(wǎng)膜和中腦頂蓋神經(jīng)纖維系統(tǒng)誘導生長錐塌陷的一種膜結(jié)合蛋白，其通過糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定于細胞膜，控制神經(jīng)元的增殖和分化等[8]。使用Rho激酶特異性抑制劑阻止了RGMa所誘導的神經(jīng)元生長錐塌陷，說明RGMa通過RhoA-Rho 激酶通路，抑制神經(jīng)軸突再生。也有體外實驗[9]證實RGMa可以引起正常皮質(zhì)神經(jīng)元的軸突回縮，并伴有細胞內(nèi)pCRMP-2表達的增多，說明RGMa可以誘導pCRMP-2磷酸化而發(fā)揮抑制軸突生長的作用。

Hata等[10]報導RGMa抑制脊髓損傷后神經(jīng)元軸突再生，使用RGMa抗體干預，脊髓神經(jīng)功能恢復得以改善，而Yshida等[11]在體外進一步證實了RGMa抑制皮質(zhì)神經(jīng)元的軸突再生。Yamashita等[12]研究表明局灶性腦缺血后RGMa免疫陽性細胞在病變區(qū)和病變周圍聚集，并在缺血后1.5～2.5d達到峰值。本研究選擇RGMa作為觀察指標，檢測其在腦梗死組織及小腦半球的表達情況。

腦組織在發(fā)生局灶性腦缺血后，RGMa免疫陽性細胞會聚集在病灶中心及周圍區(qū)域[12]，隨著大鼠的腦皮質(zhì)內(nèi)RGMa表達的增多，軸突損傷逐漸加重，神經(jīng)功能缺損也相應嚴重。Chung等[13]的研究證實其不利于軸突缺血性損傷后的修復劑在再生。本研究建立了穩(wěn)定的MCAO模型，與假手術(shù)組相比較，MCAO模型組RGMa陽性表達顯著增加，死亡的神經(jīng)細胞數(shù)量增多，而神經(jīng)功能評分升高，說明神經(jīng)功能損傷嚴重，與前期的研究結(jié)果相一致。

圖5 不同組大鼠缺血后不同時間點小腦半球的RGMa蛋白的表達。A0代表假手術(shù)組；A1-A5分別為MCAO模型組1h、3h、6h、12h、24h小腦半球RGMa蛋白表達，隨著腦梗死時間的延長，RGMa蛋白的表達逐漸增加，12h達到最大值，24h稍降低；B1-B5分別為生理鹽水組1h、3h、6h、12h、24h小腦半球RGMa蛋白表達，RGMa蛋白表達與MCAO模型組無明顯差異；C1-C5分別為丁苯酞組1h、3h、6h、12h、24h小腦半球RGMa蛋白表達，RGMa蛋白表達較MCAO模型組降低。

丁苯酞通過作用于缺血腦組織病理生理過程中的多個靶點而發(fā)揮腦保護作用，本研究通過與模型組比較發(fā)現(xiàn)丁苯酞組相應時間點的RGMa陽性表達減少，相應時間點的NF-200蛋白陽性細胞數(shù)目有所增加，說明丁苯酞能抑制缺血性腦損傷中RGMa的陽性表達，改善神經(jīng)功能損傷。我們推測在神經(jīng)損傷中丁苯酞可以減少RGMa表達，減少生長錐塌陷，保護軸突的結(jié)構(gòu)，維持神經(jīng)突起間聯(lián)系，保障細胞間信息的傳遞，最終減輕神經(jīng)功能的損傷。

綜上所述，本研究提示丁基苯酞可減少缺血性腦損傷后大鼠腦組織RGMa表達，從而減輕神經(jīng)功能的損害。由此可以推測，NBP通過缺血性腦損傷后腦組織內(nèi)RGMa生成，起到神經(jīng)保護作用，但丁基苯酞引起表達變化的具體機制又是什么，以及二者之間的具體關(guān)系，這值得我們進一步研究，以便為臨床腦梗死患者提供新的治療思路。

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EffectsofbutylphthalideonRGMaexpressionandaxonalinjuryinischemicbrain

ZHANG Yong,BU Chun-xiao,CHENG Jing-liang,LI Yan-liang.

Department of Magnetic Resonance,the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,China

Objective：To investigate the effect of butylphthalide on the expression of RGMa in ischemic brain.MethodsOne hundred and twenty healthy male SD rats were randomly divided into following four groups:sham operation group,middle cerebral artery occlusion (MCAO) model group,saline group and the experimental group.Each group would be further divided into 5 subgroups (1h,3h,6h,12h and 24h).The modified neurological severity scores and Western blot assay RGMa expression of ischemia side were performed at 1h,3h,6h,12h,24h after successful MCAO model.ResultsThe Modified Neurological Severity Score (mNSS) of MCAO model group,saline group,butylphthalide group were higher than those of sham group,mNSS were more higher as time went on;at 3h,6h,12h,at 24h after ischemia,mNSS of NBP group compared with MCAO model group,the difference was statistically significant (P<0.05).After ischemia,RGMa protein expression of MCAO model group and saline group in ischemic area had increased,which were staining with brownish yellow.RGMa expression gradually increased as time went on,up to maximum at 12h;RGMa protein expression of NBP group decreased,the difference between NBP group and MCAO group had statistically significant at 6h,12h,24h;RGMa protein expression changes between cerebellum and ischemic area were similar,RGMa protein expression of NBP group were reduced, difference was statistically significant at 1h,3h,6h,12h (P<0.05).ConclusionButylphthalide can reduce the expression of RGMa in ischemic brain tissue of rats with ischemic brain,and thus has a neuroprotective role.

Butylphthalide; Brain ischemia; Axonal injury; Models,animal

R743.31; R651.15

A

1000-0313(2017)10-1018-04

2017-01-20

2017-05-15)

450002 鄭州，鄭州大學第一附屬醫(yī)院磁共振科

張勇(1977-)，男，河南焦作人，副主任醫(yī)師，主要從事中樞神經(jīng)系統(tǒng)影像學診斷工作。

程敬亮，E-mail: cjr.chj@vip163.com

2014年國家自然科學基金項目(U1404823)

10.13609/j.cnki.1000-0313.2017.10.005