星點設計—效應面法優(yōu)化肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏處方配比

馬宏達+崔亞玲+吳瓊

[摘要] 目的 通過星點設計-效面優(yōu)化法，考察肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏中主藥最佳配比。方法 選用預防凍傷小鼠足腫脹實驗和預防凍傷大鼠局部激光多普勒血流灌注量實驗作為藥效篩選模型，以肝素鈉、肌醇煙酸酯和促透劑氮酮為考察因素，以足腫脹抑制率和血流灌注量為藥效評價指標，采用星點設計（Design-Expert 7.0軟件）對肝素鈉、肌醇煙酸酯和促透劑氮酮進行多因素多水平配伍實驗設計，對實驗結(jié)果進行數(shù)學模型預測，根據(jù)二項式擬合方程繪制出的因素對指標影響趨勢的二維等高線和三維效應面圖，選擇最佳配伍比例組合。 結(jié)果 星點設計-效應面法結(jié)果表明，肝素鈉、肌醇煙酸酯和氮酮均有一定的協(xié)同作用，試驗優(yōu)選處方藥物的配比為：肝素鈉8000 U、肌醇煙酸酯200 mg和氮酮600 mg。 結(jié)論 此方法簡便易行，預測性良好，提高了試驗精度，為提高組合藥物的臨床有效性提供科學方法和實驗依據(jù)。

[關鍵詞] 肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏；最優(yōu)配比；星點設計-效應面法

[中圖分類號] R943 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）09（a）-0008-05

[Abstract] Objective To optimize formulation of Heparin and Inositol Nicotinate Cream by central composite design-response surface method. Methods The model of paw edema of mice and the blood flow of rats measured by laser Doppler flowmetry （LDF） were chosen as the pharmacodynamic screening index. With the amount of Heparin， Inositol Nicotinate and penetration enhancers azone were as independent variables， the swelling inhibition rate and the blood perfusion were as the comprehensive pharmacodynamic index. Design-Expert 7.0 software was used for the experimental value， and response surface methodology was used to optimize the Heparin， Inositol Nicotinate and azone using central composite design-response surface method. The prediction was carried out through comparing the observed and predicted with the two-dimension overlaying contour and the three-dimension response surfaces. Results Heparin， Inositol Nicotinate and Azone were proved to have synergistic effectsby central composite design-response surface method. Optimal formulaiton was as following： Heparin 8000 U， Inositol Nicotinate 200 mg and Azone 600 mg. Conclusion Central composite design-response surface methodology is convenient and highly predictive in optimizing formulation of Heparin and Inositol Nicotinate Cream， which can be offered in the scientific methods and experimentation.

[Key words] Heparin and Inositol Nicotinate Cream； Optimization； Central composite design-response surface method

近年來，大量研究表明肝素鈉和肌醇煙酸酯能通過不同機制緩解血管痙攣，改善末端血管微循環(huán)，具有提高機體對冷刺激耐受的新活性[1-5]。目前，肝素鈉和肌醇煙酸酯已有市售軟膏，用于防治凍傷，但兩者長期過量單獨使用，均有潛在的副作用。通過前期工作發(fā)現(xiàn)兩者聯(lián)合用藥提高機體冷刺激耐受力具有協(xié)同作用，能有效降低毒副作用，提高藥效，且使用方法簡便，易于全軍配發(fā)。故本研究從部隊實際需求出發(fā)，通過星點設計-效應面法優(yōu)化處方配比，擬開發(fā)一種高效、低毒、便于部隊配發(fā)的復方抗寒乳膏，針對高寒地區(qū)衛(wèi)生勤務需求，具有很強的適用性，在一定程度上降低高寒地區(qū)指戰(zhàn)員因寒冷造成非戰(zhàn)斗減員，提高我軍高寒地域的作戰(zhàn)能力[6-7]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

冰柜（海爾電冰柜，BC/BD-272SE）；自制小鼠足體積測量儀；激光多普勒儀（Perimed，PF5002，Periflux system 5000）；電子分析天平（120D型，北京島津公司）。

1.2 試藥

肌醇煙酸酯（天津中瑞藥業(yè)有限公司，批號：130702）；肝素鈉（河北常山生化藥業(yè)股份有限公司，批號：01130509，效價：199.4 U/mg）；輕質(zhì)液狀石蠟（湖南爾康制藥股份有限公司）；羊毛脂（上海洲輝羊毛脂有限公司）；白凡士林（包頭昆侖石化有限公司）；單硬脂酸甘油脂（湖南爾康制藥股份有限公司）；十六醇（國藥集團化學試劑有限公司）；司盤80（南京威爾化工有限公司）；氮酮（國藥集團化學試劑有限公司）；羥苯乙酯（臺山市新寧制藥有限公司）；聚山梨酯80（湖南爾康制藥股份有限公司）；以上試劑均為藥用標準或分析純；肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏（沈陽軍區(qū)總醫(yī)藥藥劑科自制，每支20 g，批號：20140820、20140925、20141018）；水為純化水；其他試劑均為分析純。endprint

1.3 動物

昆明種小鼠：雄性，6～8周，體重25～27 g，由沈陽軍區(qū)總醫(yī)院動物實驗科提供[合格證號：SCXK（京）2012-0001]；SD大鼠：雄性，45～60 d，體重180～200 g，由沈陽軍區(qū)總醫(yī)院動物實驗科提供[合格證號：SCXK（遼）2010-0001]；飼養(yǎng)環(huán)境：室溫20～25℃，濕度40%～60%，自由飲食飲水，適應性飼養(yǎng)7 d后用于實驗。

2 方法與結(jié)果

本研究選用預防凍傷小鼠足腫脹實驗和預防凍傷大鼠局部激光多普勒血流灌注量實驗作為藥效篩選模型，以肝素鈉、肌醇煙酸酯和促透劑氮酮為考察因素，以足腫脹抑制率和血流灌注量為藥效評價指標，采用Design-Expert軟件中的星點設計法對各組實驗數(shù)據(jù)進行效果驗證。

2.1 預防凍傷小鼠足腫脹實驗

取健康昆明種小鼠170只，雌雄各半，按體重隨機分成17組，每組10只，分別為：模型組和16個不同配比給藥組。造模前1.5 h，除模型組外，其余各給藥組使用第1～16組乳膏均勻涂抹小鼠的四肢，1.5 h內(nèi)均勻涂抹2次。將小鼠放入-18℃冰柜中冷凍25 min，取出，造模完成。于給藥前和造模后4 h測量每只小鼠左、右后肢體積，記錄小鼠足腫脹程度并計算左、右后足腫脹之和的腫脹抑制率。

2.2 預防凍傷大鼠激光多普勒血流灌注量實驗

取健康SD大鼠102只，雌雄各半，按體重隨機分成17組，每組6只，分別為：模型組和16個不同配比給藥組。造模前1.5 h，除模型組外，其余各給藥組使用第1～16組乳膏均勻涂抹大鼠的四肢，1.5 h內(nèi)平均涂抹2次。將大鼠放入-18℃冰柜中冷凍80 min，取出，造模完成。各組于給藥前和造模后4 h均采用激光多普勒灌注測量儀測定右后足的血流灌注量，并進行統(tǒng)計學分析。

2.3 星點設計優(yōu)化方法

根據(jù)星點設計的原理[8-10]，本試驗對肝素鈉、肌醇煙酸酯和氮酮三個因素進行考察，每個因素設五水平，用代碼值-α，-1，0，1，α（α=1.68）表示，因素水平詳見表1，試驗安排如表2中1～16中肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏（20 g）各處方組成所示，結(jié)果詳見表2。

2.4 模型的預測、擬合與最優(yōu)處方配比

本研究分別以足腫脹抑制率Y1和血流灌注量Y2，肝素鈉X1、肌醇煙酸酯X2、氮酮X3為自變量，對各因素進行多元線性回歸和二項式擬合[11-13]，多元線性回歸相關系數(shù)r約為0.6，其相關性較差，擬合度不佳，對實驗結(jié)果的預測性較差，而二項式擬合的相關系數(shù)均大于0.98，擬合度較佳，得二項式方程為：

Y1 = 68.03+8.84X1+1.82X2+2.44X3+2.27X1X2+5.00X1X3+2.28X2X3-6.86X12-4.11X22-6.42X32（P < 0.01，r = 0.98）。

Y2 = 53.15+5.55X1+1.97X2+1.26X3+1.70X1X2+3.27X1X3+2.45X2X3-5.89X12-3.01X22-4.68X32（P < 0.01，r = 0.97）。

2.5 效應面分析

根據(jù)優(yōu)化后的二項式擬合方程，把因變量與兩個因素擬合為三維曲面圖，應用Design-Expert 7.0軟件做出三維效應圖，從而在效應面最佳區(qū)域上選取相應因素的較佳水平作為試驗條件[14-15]，三維效應面圖和等高線圖詳見圖1～6。

從足腫脹實驗輸出結(jié)果可知，肝素鈉、肌醇煙酸酯和氮酮均P < 0.05，說明三者對冷凍后足腫脹均有良好的抑制作用，且肝素鈉P < 0.01，說明肝素鈉作用更顯著。從響應面和等高線圖可以看出，肝素鈉和肌醇煙酸酯有一定的藥物協(xié)同作用，量效存在平臺現(xiàn)象；肝素鈉濃度低時，藥效隨氮酮濃度先升后降。肝素鈉濃度高時，藥效隨氮酮濃度升高，也具有一定的協(xié)同作用。

從大鼠足部血流灌注量實驗輸出結(jié)果可知，肝素鈉、肌醇煙酸酯和氮酮均P < 0.01，說明三者對冷凍后足部血流均有顯著的促進作用，AB、AC和BC均P < 0.05，三者之間均有一定的協(xié)同作用。從響應面和等高線圖可以看出，肝素鈉和肌醇煙酸酯有較強的藥物協(xié)同作用，藥效隨藥物濃度的增加均呈現(xiàn)先升后降的趨勢。

通過足腫脹和血流量實驗的等高線圖，選取肝素鈉、肌醇煙酸酯和氮酮藥效較佳范圍為6500～8500 U、肌醇煙酸酯200～300 mg、氮酮500～650 mg，考慮到肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏制劑的穩(wěn)定性、有效性和安全性等因素，及結(jié)合生產(chǎn)成本和可操作性等實際條件，最終試驗選取處方（20 g）藥物的較佳配比為：肝素鈉8000 U，肌醇煙酸酯200 mg和氮酮600 mg。

3 討論

在乳膏劑的處方中，氮酮為目前使用較多的促透劑，用量小，無毒且對皮膚的刺激性很低，對親水性或疏水性化合物均有較強的透皮吸收促進作用，通過文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)氮酮對不同藥物的透皮吸收影響不同、其用量并非越高越好，故本實驗除了篩選主藥的最優(yōu)配比外，也考察了促透劑氮酮對試驗藥物的最佳用量[16-20]。

本實驗在處方篩選過程中，考慮過現(xiàn)在使用比較成熟的均勻設計和正交實驗設計方法，但這兩種實驗的精度不夠，選擇的試驗取值僅僅是接近最佳取值，無法精確找到最佳點；條件優(yōu)選憑經(jīng)驗，不能靈敏地考察各因素間的交互作用等等。鑒于以上問題，最后選擇了國內(nèi)外近半年來常用集數(shù)學和統(tǒng)計學方法于一體的星點設計效應優(yōu)面法進行試驗設計[21-24]，它具有試驗次數(shù)小，試驗精度高等特點，它通過描繪效應考察因素的效應面，從效應面上選擇較佳的效應區(qū)，從而回推出自變量取值范圍，即最佳實驗條件，適用于本實驗。

[參考文獻]

[1] 張石革，龍振華.凍傷（瘡）與用藥防護[J].中國藥房，2003，14（12）：767-768.endprint

[2] 高彩平，孫占軍.肝素鈉注射液臨床新用途[J].中國藥師，2006，9（8）：764-765.

[3] 高勝旗.肝素鈉乳膏治療凍傷[J].食品與藥品，2005，7（11）：69-70.

[4] 宋永熙.肝素鈉軟膏的作用機制及臨床應用[J].食品與藥品，2005，7（8）：55-56.

[5] 侯兆明.中藥外洗聯(lián)合復方乳酸乳膏和肝素鈉乳膏外涂治療手足皸裂60例[J].中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學雜志，2012，11（3）：177.

[6] 韓運梅，林立，張春之.低溫對機體損傷作用的研究進展[J].中國職業(yè)醫(yī)學，2008，35（6）：515-517.

[7] 郭強，楊龍江.某部新兵集訓期間凍傷的防治體會[J].中國實用醫(yī)藥，2009，4（2）：217-218.

[8] 程勐，劉美，閆碧涵，等.星點設計-效應面法優(yōu)化多烯磷脂酰膽堿注射液的處方[J].華西藥學雜志，2014，29（6）：625-627.

[9] 葉海娜，張愛玲，何雁，等.星點設計-效應面法優(yōu)選婦糜康凝膠劑的基質(zhì)處方[J].中國實驗方劑學雜志，2014，20（16）：19-22.

[10] 冉茂蓮，李小芳，羅麗佳，等.星點設計-效應面法優(yōu)選羅布麻葉總黃酮提取工藝 [J].成都中醫(yī)藥大學學報，2014， 37（4）：4-7.

[11] 謝順嵐，吳方建.星點設計-效應面法優(yōu)化姜黃素提取工藝[J].中國醫(yī)藥導報，2016，13（33）：125-128.

[12] 侯曉軍，唐菱，周芃，等.星點設計-效應面法優(yōu)化硼酸乳膏基質(zhì)配方及質(zhì)量控制 [J].中國藥師，2016，19（5）：879-883.

[13] 部娜，王承志.星點設計-效應面法優(yōu)化雄黃乳膏劑的處方組成[J].中成藥，2016，38（4）：930-934.

[14] 伍勇，賀福元，曹燕，等.星點設計-效應面優(yōu)化法對四物湯醇沉工藝的研究[J].中國醫(yī)藥導報，2009，6（3）：17-19.

[15] 張紀興，何雯，梁福堯，等.八味痛風康微丸處方的星點設計-效應面法優(yōu)化[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2010，41（9）：674-677.

[16] 壽張軒.氮酮應用研究進展[J].中國藥業(yè)，2002，11（8）：73-74.

[17] 宇克莉，孫建華.幾種透皮吸收促進劑的作用機制探討[J].山東醫(yī)藥，2007，47（11）：30-31.

[18] 林桂濤，盛華剛，張超，等.復方蟾酥鎮(zhèn)痛巴布膏劑體外透皮吸收研究[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（9）：1-3.

[19] 劉海燕，黃志軍，梁穎，等.常用透皮吸收促進劑對鹽酸西替利嗪經(jīng)皮滲透性能的影響[J].中國藥房，2016，27（1）：41-43.

[20] 車選義，李裕欽，王建萍，等.氮酮對低分子量肝素鈉離體大鼠皮膚透皮吸收的研究[J].中國醫(yī)藥導報，2013， 10（32）：7-9.

[21] 劉艷杰，項榮武.星點設計效應面法在藥學試驗設計中的應用[J].中國現(xiàn)代應用藥學，2007，24（6）：455-457.

[22] 邱穎，朱玲，孫曉英.星點設計-效應面優(yōu)化法與正交設計和均勻設計的比較及其在藥劑研究中的應用[J].海峽藥學，2011，23（2）：18-20.

[23] 王永菲，王成國.響應面法的理論與應用[J].中央民族大學學報，2005，14（3）：236-240.

[24] 施昶，沈詩偲，黃海飛，等.星點設計-效應面優(yōu)化法在處方篩選和優(yōu)化中的應用[J].中國制藥裝備，2014，32（422）：41-46.

（收稿日期：2017-04-27 本文編輯：蘇 暢）endprint