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      春季西葫蘆日光溫室黃瓜花葉病毒病發(fā)生規(guī)律與防蟲網(wǎng)的防控效果

      2017-10-27 12:21:18毛曉紅于毅張秀霞
      江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年16期
      關(guān)鍵詞:防蟲網(wǎng)發(fā)生規(guī)律

      毛曉紅 于毅 張秀霞

      摘要:為探明西葫蘆日光溫室中黃瓜花葉病毒病發(fā)生規(guī)律和防蟲網(wǎng)隔離瓜蚜對該病毒病的防控效果,于2014、2015年在山東濟南地區(qū)開展田間定點調(diào)查和室內(nèi)PCR檢測試驗。結(jié)果表明,在春季日光溫室西葫蘆生長期,西葫蘆帶毒植株4月中旬開始出現(xiàn),之后帶毒率逐漸上升,5月下旬達30%左右。黃瓜花葉病毒病的發(fā)生與瓜蚜密度密切相關(guān),瓜蚜密度達到一定程度后,出現(xiàn)西葫蘆帶毒植株,瓜蚜進入迅速增長期后,西葫蘆帶毒株率亦呈上升趨勢;春季日光溫室中帶毒瓜蚜在4月中旬開始出現(xiàn),而后帶毒率呈逐漸上升趨勢,5月下旬達3611%~4556%。西葫蘆生長期用100目防蟲網(wǎng)隔離可降低西葫蘆植株帶毒率。該研究能為日光溫室西葫蘆病毒病科學(xué)防控提供理論依據(jù)。

      關(guān)鍵詞:黃瓜花葉病毒(CMV)??;發(fā)生規(guī)律;瓜蚜;種群動態(tài);防蟲網(wǎng)

      中圖分類號: S4364211+9文獻標(biāo)志碼:

      文章編號:1002-1302(2017)16-0096-03

      收稿日期:2016-03-26

      基金項目:公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(編號:201303028)。

      作者簡介:毛曉紅(1985—),女,山東煙臺人,研究方向為蔬菜病毒防控。Tel:(0531)83178008;E-mail:315159613@qqcom。

      通信作者:張安盛,碩士,研究員,主要從事蔬菜病蟲害防控技術(shù)研究。Tel:(0531)83179542;E-mail:zhangansheng2003@163com。

      黃瓜花葉病毒(cucumber mosaic virus,簡稱CMV)隸屬雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)黃瓜花葉病毒屬(Cucumovirus),該病毒寄主范圍廣,可侵染包括葫蘆科、茄科、十字花科、豆科在內(nèi)的1 000多種寄主植物[1-2]。寄主植物被侵染后表現(xiàn)為矮化、花葉、褪綠,同時還表現(xiàn)出斑駁、明脈及過敏性壞死等癥狀。自1916年CMV被首次確定為黃瓜花葉病病原以來,因其發(fā)生的普遍性和危害的嚴重性,已成為世界范圍內(nèi)重要的、研究較多的RNA病毒之一,位居世界第4[3-4]。黃瓜花葉病毒病在自然界主要由蚜蟲以非持久性方式傳播,如瓜蚜(Aphis gossypii)、桃蚜(Myzus persicae)等,此類蚜蟲寄主范圍廣,在西葫蘆植株及其他蔬菜上發(fā)生嚴重,為黃瓜花葉病毒病的傳播提供了條件[5]。目前,黃瓜花葉病毒病在山東省蔬菜主產(chǎn)區(qū)日光溫室西葫蘆上發(fā)生面積大、危害嚴重,對日光溫室西葫蘆的安全生產(chǎn)造成了重大影響。

      目前國內(nèi)外學(xué)者對黃瓜花葉病毒的研究,主要有病毒的生物學(xué)特性、株系分化、綜合防控技術(shù)[8-10]等,鄭光宇研究了桃蚜對黃瓜花葉病毒新疆株的傳播特性[11],但關(guān)于瓜蚜對日光溫室中黃瓜花葉病毒的傳播未見報道。本研究對山東省春季西葫蘆日光溫室黃瓜花葉病毒病發(fā)生規(guī)律、發(fā)生規(guī)律與傳毒介體瓜蚜種群動態(tài)的關(guān)系、西葫蘆生長期罩防蟲網(wǎng)隔離瓜蚜對病毒病的防控效果進行了分析,以期為西葫蘆病毒病的科學(xué)防治提供理論依據(jù)。

      1材料與方法

      11試驗地概況

      試驗地點為山東省濟南市歷城區(qū)董家鎮(zhèn)張而村西葫蘆日光溫室,試驗地面積均為0067 hm2,西葫蘆品種為優(yōu)美F1。黃瓜花葉病毒病調(diào)查定植時間分別為2014年3月4日、2015年3月12日、2015年9月4日,株行距為60 cm×100 cm,長勢良好。

      12試驗儀器

      TP600PCR儀(日本TaKaRa公司);RXZ-280D-LED光照培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠);5804R低溫冷凍離心機(德國Eppendorf公司);凝膠成像儀(美國Alpha Innotech公司);DYY-6C電泳儀(北京市六一儀器廠);25~1 000 μL移液器(德國Eppendorf公司);MDF-U4086S -80 ℃冰箱(日本SANYO公司);MLS-3020高壓滅菌鍋(日本SANYO公司);HD-920超凈工作臺(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司);MDF-U4086S -80 ℃冰箱(日本SANYO公司)。

      13試驗材料

      植物RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司,目錄號:DP432];反轉(zhuǎn)錄試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司,目錄號:KR107];Taq PCR MasterMix[天根生化科技(北京)有限公司,目錄號:KT201];TRIzol(美國Invitrogen公司);DL2000Marker(ProbeGene公司);三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇(國藥集團化學(xué)試劑有限公司);100目防蟲網(wǎng)(浙江省臺州市路橋區(qū)德農(nóng)防蟲網(wǎng)廠,加工成100 cm×100 cm×100 cm 防蟲網(wǎng)罩,用于西葫蘆生長期罩網(wǎng))。

      14試驗方法

      141西葫蘆植株和瓜蚜體內(nèi)黃瓜花葉病毒PCR檢測

      單頭蚜蟲RNA提?。簩晤^蚜蟲置于15 mL離心管中,放入液氮中冷卻,用微型小杵研磨均勻;加入250 μL TRIzol試劑,室溫放置5 min;加入50 μL三氯甲烷混合物[三氯甲烷 ∶異戊醇(體積比)=24 ∶1],振蕩混勻3 min;4 ℃、12 000 r/min離心 10 min,移上清至另一離心管中(約125 μL),加入等體積異丙醇(-20 ℃預(yù)冷),室溫放置10 min(夏天放于-20 ℃冰箱中預(yù)冷30 min),4 ℃、12 000 r/min離心10 min,棄上清,加入70%預(yù)冷的乙醇(250 μL)洗滌,4 ℃、12 000 r/min離心 5 min,待乙醇揮發(fā)后加入8 μL RNase-Free ddH2O。

      植物基因組RNA提?。簩⑽骱J葉片在液氮中磨碎;每50~100 mg組織加1 mL裂解液RZ,用勻漿儀進行勻漿處理;將勻漿樣品在室溫中放置5 min,使得核酸蛋白復(fù)合物完全分離;4 ℃、12 000 r/min離心5 min,取上清,轉(zhuǎn)入1個新的無RNase的離心管中。 加入200 μL三氯甲烷,蓋好管蓋,劇烈振蕩15 s,室溫放置3 min;4 ℃、12 000 r/min離心1 min,緩慢加入05倍體積無水乙醇,混勻(此時可能會出現(xiàn)沉淀);將得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱CR3中,4 ℃、12 000 r/min 離心30 s,棄掉收集管中的廢液,將CR3放入收集管中,向吸附柱CR3中加入700 μL漂洗液RW,室溫靜置2 min,4 ℃、 12 000 r/min離心30 s,棄廢液,重復(fù)操作步驟,將吸附柱放入2 mL收集管中,4 ℃、12 000 r/min離心2 min,去除殘余液體,將吸附柱CR3轉(zhuǎn)入1個新的15 mL離心管中,加 30 μL RNase-Free ddH2O,室溫放置2 min,4℃、12 000 r/min 離心2 min,RNA于-80 ℃凍存。

      反轉(zhuǎn)錄體系共20 μL:模板RNA 10 μL、Random 1 μL、dNTP 1 μL、Mix 1 μL,5×First-Stranf Buffer 4 μL、RNase-free ddH2O 3 μL,將所有試劑輕輕混勻后,按照程序(25 ℃ 10 min,42 ℃ 45 min,85 ℃ 5 min)進行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后cDNA于-20 ℃凍存。

      PCR反應(yīng):使用CMV特異引物(上游引物5′-GATGGACAAATCTGAATCAACCAG-3′;下游引物5′-AACTGGGAGCACCCCAGATGTG-3′)進行擴增,反應(yīng)體系為10 μL:cDNA 2 μL,F(xiàn)端、R端引物各05 μL,2×PCR MasterMix 5 μL,ddH2O 2 μL。PCR反應(yīng)程序:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,57 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,35個循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR擴增產(chǎn)物進行15%瓊脂糖凝膠電泳檢測并拍照。

      142春季日光溫室西葫蘆植株上黃瓜花葉病毒病發(fā)生規(guī)律與瓜蚜種群動態(tài)的關(guān)系

      日光溫室西葫蘆植株黃瓜花葉病毒病調(diào)查時間分別為2014年、2015年3月中旬至5月下旬(3月12日—5月26日),每10 d左右調(diào)查1次,每年調(diào)查8次。調(diào)查方法:在日光溫室東、西兩側(cè)分別保留2行西葫蘆作保護行,將日光溫室自東向西平均分為5個小區(qū),在每個小區(qū)的中間位置選取西葫蘆2行,在每行西葫蘆的南、中、北各固定2株代表性西葫蘆,共固定60株西葫蘆;每次均調(diào)查固定西葫蘆植株上、中部5張葉片上瓜蚜數(shù)量;同時采集固定西葫蘆植株的葉片和30~40頭瓜蚜,室內(nèi)用PCR方法檢測西葫蘆植株、瓜蚜對黃瓜花葉病毒的帶毒率。

      15日光溫室西葫蘆生長期罩防蟲網(wǎng)對西葫蘆病毒病的防控效果

      試驗時間為2015年9月上旬至11月中旬,西葫蘆定植時(2015年9月4日)用防蟲網(wǎng)將供試西葫蘆植株罩網(wǎng)隔離,共罩防蟲網(wǎng)罩36個,1個防蟲網(wǎng)罩對應(yīng)西葫蘆苗2株。分別在西葫蘆定植后10、20、30、40 d揭掉防蟲網(wǎng)罩,每個處理重復(fù)3次,每次重復(fù)3個防蟲網(wǎng)罩;分別在揭防蟲網(wǎng)罩后5 min、10 d、20 d、30 d PCR檢測原先防蟲網(wǎng)內(nèi)西葫蘆植株的帶毒率。

      2結(jié)果與分析

      21春季西葫蘆日光溫室黃瓜病毒病發(fā)生與瓜蚜種群動態(tài)的關(guān)系

      圖1表明,2014、2015年3月中旬至5月下旬調(diào)查結(jié)果顯示,2年中日光溫室西葫蘆瓜蚜種群動態(tài)、黃瓜花葉病毒病發(fā)生規(guī)律基本相似,即單葉瓜蚜數(shù)量、西葫蘆帶毒株率整體均呈逐漸增長的趨勢。2年中西葫蘆帶毒植株均于4月中旬開始出現(xiàn)(病株率333%~500%),而后西葫蘆帶毒株率逐漸提高,到5月下旬達到高峰,2014、2015年帶毒株率分別為3167%、3000%;2014、2015年瓜蚜則分別于4月上旬、3月下旬開始出現(xiàn),但此時瓜蚜數(shù)量較低,平均蚜量分別僅為217、021頭/張;4月中旬以后瓜蚜數(shù)量迅速增長,5月下旬達到最高值,平均蚜量分別為2689、2311頭/張。

      從西葫蘆病毒病發(fā)生與瓜蚜種群動態(tài)關(guān)系來看,瓜蚜沒有發(fā)生或發(fā)生數(shù)量較低時,西葫蘆植株不帶毒;隨著瓜蚜數(shù)量的增長,西葫蘆帶毒植株開始出現(xiàn);瓜蚜進入迅速增長期后,西葫蘆帶毒株率亦呈上升趨勢,西葫蘆植株帶毒率的提高與瓜蚜種群動態(tài)的增長密切相關(guān)。

      22西葫蘆日光溫室瓜蚜帶毒率檢測

      室內(nèi)檢測結(jié)果顯示,春季日光溫室西葫蘆植株上,瓜蚜對黃瓜花葉病毒的帶毒率呈現(xiàn)逐漸上升趨勢:3月下旬至4月上旬,日光溫室瓜蚜帶毒率為0,4月中、下旬,瓜蚜帶毒率小幅度上升(222%~1389%),5月中旬至下旬,瓜蚜帶毒率迅速升高,2014、2015年5月下旬瓜蚜帶毒率分別達 3611%、4556%(表1)。

      23西葫蘆生長期罩網(wǎng)隔離瓜蚜對西葫蘆病毒病的控制效果

      表2表明,日光溫室西葫蘆罩100目防蟲網(wǎng),罩防蟲網(wǎng)時間越長,揭防蟲網(wǎng)后相同時間內(nèi)西葫蘆發(fā)病率越低。揭防蟲網(wǎng)后5 min采樣檢測,罩防蟲網(wǎng)40、30、20、10 d處理西葫蘆均未發(fā)病;揭防蟲網(wǎng)后10 d采樣檢測,罩防蟲網(wǎng)40、30、20 d處理的西葫蘆均未發(fā)病,罩防蟲網(wǎng)10 d處理的西葫蘆發(fā)病率為1667%,但4個處理無顯著差異;揭防蟲網(wǎng)后 20 d 采樣檢測,罩防蟲網(wǎng)40 d西葫蘆仍未發(fā)病,30 d處理的西葫蘆發(fā)病率為1667%,顯著低于罩防蟲網(wǎng)10、20 d處理(西葫蘆發(fā)病率10000%);揭防蟲網(wǎng)后30 d采樣檢測,罩防蟲網(wǎng)40 d西葫蘆發(fā)病率為1667%,極顯著低于罩防蟲網(wǎng)10、20、30 d處理(西葫蘆發(fā)病率8333%~10000%)。

      注:同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在005水平上差異顯著,不同大寫字母表示在001水平上差異顯著。

      3結(jié)論與討論

      本研究表明,春季日光溫室西葫蘆植株瓜蚜數(shù)量呈逐漸增長趨勢,西葫蘆植株對黃瓜花葉病毒的帶毒率呈逐漸上升趨勢,西葫蘆黃瓜花葉病毒病的發(fā)生與瓜蚜種群動態(tài)密切相關(guān),即蚜蟲密度達到一定程度后,會導(dǎo)致西葫蘆帶毒植株的出現(xiàn)并且發(fā)病率持續(xù)上升。春季日光溫室西葫蘆植株帶毒瓜蚜出現(xiàn)時間為4月中旬,之后帶毒率逐漸上升;西葫蘆帶毒株率出現(xiàn)時間為4月中旬,帶毒株率也呈上升趨勢,進一步說明日光溫室西葫蘆病毒病的發(fā)生與帶毒瓜蚜密切相關(guān)。

      在日光溫室西葫蘆中,被黃瓜花葉病毒入侵的帶毒瓜蚜取食健康西葫蘆使西葫蘆植株帶毒,其他健康瓜蚜取食帶毒西葫蘆植株后又成為帶毒瓜蚜,這些帶毒瓜蚜取食過程中又引起其他健康西葫蘆植株發(fā)病,這種惡性循環(huán)會導(dǎo)致日光溫室西葫蘆帶毒率越來越高。因此,阻斷外來瓜蚜入侵和殺滅日光溫室內(nèi)部已有的瓜蚜是防控西葫蘆病毒病的關(guān)鍵。本研究表明,日光溫室西葫蘆生長期罩100目防蟲網(wǎng)隔離瓜蚜,可有效降低西葫蘆植株帶毒率,西葫蘆植株受帶毒瓜蚜危害越晚,發(fā)病株率越低,進一步說明日光溫室罩防蟲網(wǎng)切斷外來帶毒瓜蚜的入侵,是防治日光溫室西葫蘆病毒病的有效措施之一。

      本研究明確了日光溫室西葫蘆病毒病發(fā)生規(guī)律、發(fā)生規(guī)律與傳毒介體瓜蚜種群的動態(tài)關(guān)系及西葫蘆生長期罩防蟲網(wǎng)隔離瓜蚜對病毒病的防控效果,為西葫蘆病毒病的科學(xué)有效防治提供了理論依據(jù)。但要實現(xiàn)對日光溫室西葫蘆病毒病徹底有效的防治,尚須開展大量工作,須要加強對西葫蘆抗病毒品種選育,以及對西葫蘆病毒病、瓜蚜與寄主之間的互作關(guān)系,特別是瓜蚜對病毒病的傳毒機制等的深入研究。

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