一種快速分離蘋果果肉單細(xì)胞的方法

邢文曦　王永章　劉成連

摘要：?jiǎn)渭?xì)胞是生物體的基本單位，提取具有活性的單細(xì)胞是研究果實(shí)發(fā)育的基礎(chǔ)。以蘋果為材料，研究不同酶液組合和酶解時(shí)間對(duì)蘋果果肉單細(xì)胞分離的影響。結(jié)果表明，蘋果果肉在01%離析酶、暗酶解05 h時(shí)，為理想的蘋果果肉單細(xì)胞分離條件。

關(guān)鍵詞：蘋果；單細(xì)胞；離析酶；酶解濃度；酶解時(shí)間

中圖分類號(hào)： S661101文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號(hào)：1002-1302（2017）16-0138-02

[HJ14mm]

收稿日期：2016-03-29

基金項(xiàng)目：山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介：邢文曦（1990—），女，山西朔州人，碩士研究生，主要從事果樹栽培與生理等研究。E-mail：kaoyanxixi@163com。

通信作者：劉成連，教授，研究方向?yàn)楣麡湓耘嗌砼c分子生物學(xué)。E-mail：fmdb@qaueducn。

單個(gè)活體細(xì)胞是生物生命活動(dòng)的基本單元和進(jìn)化的基本單位，對(duì)單個(gè)活體細(xì)胞的識(shí)別、分選及分析，能夠解析生命體系最深層次的異質(zhì)性和運(yùn)作機(jī)制。同時(shí)，因其不依賴細(xì)胞的培養(yǎng)和擴(kuò)增，單細(xì)胞技術(shù)在生物發(fā)育、生物能源、氣候變化、疾病診斷、食品安全、農(nóng)業(yè)生態(tài)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。分離植物精細(xì)胞用于離體培養(yǎng)，可以為通過離體有性繁殖途徑進(jìn)行植物品種改良打下基礎(chǔ)；分離保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體，使研究保衛(wèi)細(xì)胞本身的生理生化特性及其與氣孔功能的關(guān)系成為可能；分離維管束組織和韌皮部組織細(xì)胞，可以進(jìn)行組織特異表達(dá)基因的鑒定。利用棉纖維單細(xì)胞研究細(xì)胞壁和纖維素的形成過程，能幫助人們更好地提高棉纖維的質(zhì)量。目前，研究基因表達(dá)都是一群細(xì)胞的基因表達(dá)，這種表達(dá)實(shí)際上是每個(gè)細(xì)胞特異表達(dá)的平均情況，但是單個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)分析能夠提供隱藏在群體細(xì)胞中單個(gè)細(xì)胞發(fā)育的新機(jī)制[3-4]。細(xì)胞膜上有各種離子通道，如鈣離子通道、鉀離子通道及鈉離子通道等，這些通道調(diào)節(jié)離子進(jìn)出，利用膜片鉗技術(shù)可研究單個(gè)細(xì)胞離子通道的特性等，從而深入地研究生物體信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞滲透壓、細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)及抗逆性等各種生理機(jī)制。Li等利用膜片鉗等技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了控制鉀離子通道的流向轉(zhuǎn)換機(jī)制，揭開了使同一離子通道的離子流向發(fā)生逆轉(zhuǎn)的關(guān)鍵因素[5]。果實(shí)的發(fā)育過程就是果肉細(xì)胞發(fā)育的過程，決定著果實(shí)的硬度、甜度、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量等，與果實(shí)貯藏時(shí)間長(zhǎng)短、病害發(fā)生等都有關(guān)系，因此研究分離活性果肉單細(xì)胞是研究果實(shí)發(fā)育的基礎(chǔ)；但是目前還沒有果樹類果肉細(xì)胞分離的相關(guān)報(bào)道，本研究以蘋果為材料，研究果肉細(xì)胞的提取方法。

1材料與方法

11材料

從青島農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)實(shí)習(xí)基地，取成熟富士蘋果，貯藏于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

12器材與試劑

熒光顯微鏡 （LEICA，DM2500，德國(guó)）、勻漿機(jī)、低速離心機(jī)、恒溫?fù)u床、磁力攪拌器等。

13試驗(yàn)方法

131單細(xì)胞分離

配制細(xì)胞和原生質(zhì)體洗滌溶液（cell and potoplast wash solution，簡(jiǎn)稱CPW）：101000 mg/L KNO3，27200 mg/L KH2PO4，246000 mg/L MgSO4·7H2O，1 480000 mg/L CaCl2·2H2O，0160 mg/L KI，0025 mg/L CuSO4·5H2O，0400 mol/L 甘露醇，4 ℃低溫保存?zhèn)溆谩＠w維素酶、果膠酶、離析酶溶于CPW溶液中，酶液見表1。

將蘋果表皮以下的果肉用手術(shù)刀切成邊長(zhǎng)05 cm 的小方塊，再徒手切成薄片。將切好的蘋果薄片分別置于50 mL的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ酶液中（酶液的組成見表1），于70 r/min搖床中振蕩酶解05 、10、20 h（27 ℃，黑暗條件）。靜置后，用CPW溶液清洗3次，以洗去酶液，再移到50 mL燒杯中，在磁力攪拌器上攪拌1 h后，在顯微鏡上檢測(cè)，比較各個(gè)酶液在不同處理時(shí)間下獲取單細(xì)胞的結(jié)果。

132采用VBL檢測(cè)細(xì)胞壁完整性

采用黃祥輝等的方法，配制VBL[4，4′-bis（4-anilino-6-hydroxyethyl-amine-S-triazin-2-ylamino）-2，2′-stilbene disulfonic acid]細(xì)胞壁染色液。先配制05 mol/L甘露醇，調(diào)節(jié)pH值為70 （Tris）。再用甘露醇溶液配制VBL，使VBL終濃度為01%。避光，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

染色步驟：（1）吸取1 mL細(xì)胞懸浮液到15 mL離心管中，吸取10 μL，滴加于載玻片上，在顯微鏡下觀察。（2）吸取400 μL細(xì)胞懸浮液至新的離心管中，加20 μL 上述01% VBL，避光，染色5 min。（3）染色后，用CPW溶液重復(fù)漂洗3次，以除去背景中的熒光。（4）漂洗后，懸浮于CPW溶液中，避光，熒光顯微鏡下觀察。VBL的激發(fā)波長(zhǎng)為345 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為430 nm。

133FDA檢測(cè)細(xì)胞活性

FDA是一種非熒光化合物，滲入活細(xì)胞后才釋放出熒光素，在藍(lán)色光激發(fā)下顯示出綠色熒光[8]。

配制5 mL 濃度為5 mg/L的FDA：先配065 mol/L甘露醇，再稱取25 mg雙醋酸熒光素FDA，溶于1 mL丙酮中，完全溶解之后，加入上述甘露醇溶液4 mL，避光，4 ℃ 保存。取細(xì)胞懸浮液05 mL于15 mL離心管中，加入FDA染色液，使其終濃度為001%，室溫下靜置5 min，熒光顯微鏡下觀察，F(xiàn)DA的最大激發(fā)波長(zhǎng)為493 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為510 nm。發(fā)綠色熒光的為活細(xì)胞，不發(fā)熒光的為死細(xì)胞。

2結(jié)果與分析

分離蘋果果肉單細(xì)胞過程中，在沒有酶的情況下，不能分離出果肉單細(xì)胞，用FDA染色液染色，能夠看到堆疊的有活性的細(xì)胞群（圖1-A）。當(dāng)酶液中含有01%纖維素酶或 005%果膠酶時(shí)，獲得單細(xì)胞少，有碎片存在，如表2中酶液Ⅰ、酶液Ⅱ；但當(dāng)酶液中只含有01%離析酶時(shí)，處理時(shí)間為05 h時(shí)，單細(xì)胞產(chǎn)量多且完整（圖1-B、1-D），當(dāng)處理時(shí)間為10、20 h時(shí)，雖有較多的單細(xì)胞，但有碎片存在，因此，酶液Ⅲ是分離果肉單細(xì)胞的最佳酶液，適宜酶解時(shí)間為05 h（表2）。

VBL與植物細(xì)胞壁中的纖維素有強(qiáng)烈的親和力，在紫外光下產(chǎn)生熒光，利用這個(gè)特性，常被用于檢測(cè)細(xì)胞的完整性。離析酶分離得到的蘋果果肉單細(xì)胞經(jīng)VBL染色后，細(xì)胞周圍有明顯的熒光（圖1-C），這說明經(jīng)離析酶處理果肉可以獲得完整的果肉單細(xì)胞。FDA常用動(dòng)植物細(xì)胞生活力的鑒定染料，當(dāng)活細(xì)胞具有完整細(xì)胞膜時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的FDA經(jīng)水解產(chǎn)生的熒光素在胞內(nèi)積累，在藍(lán)光下產(chǎn)生綠色熒光，而死細(xì)胞的細(xì)胞膜失去了選擇透性，熒光素?zé)o法在胞內(nèi)積累，不產(chǎn)生熒光[8]。分離得到的單細(xì)胞經(jīng)FDA染色5 min后，細(xì)胞內(nèi)充滿了熒光物質(zhì)（圖1-E），這表明分離得到的果肉單細(xì)胞具有活性。

3結(jié)論與討論

單細(xì)胞水平研究越來越受到關(guān)注，已被廣泛應(yīng)用于單細(xì)胞PCR擴(kuò)增、基因測(cè)序及細(xì)胞工程研究等，因此分離單細(xì)胞是生理和分子研究的基礎(chǔ)。據(jù)筆者所知，目前分離植物單細(xì)胞以酶解法為主，即采用纖維素酶、果膠酶等破壞植物細(xì)胞壁，使細(xì)胞相互分離，從而分離出單細(xì)胞或者原生質(zhì)體。張寧等應(yīng)用酶解法分離馬鈴薯的葉片單細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)果膠酶是細(xì)胞分離的關(guān)鍵酶，但只是統(tǒng)計(jì)了細(xì)胞的分離率，酶解時(shí)間比本研究的酶解時(shí)間長(zhǎng)，最少為4 h，酶解時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)破壞細(xì)胞的完整性和活性[9]。目前還有很多研究都直接提取了原生質(zhì)體，而使細(xì)胞壁破裂。陳穎等用纖維素酶酶解擬南芥葉肉細(xì)胞，獲取了葉肉細(xì)胞的原生質(zhì)體[10]。陳愛萍等用纖維素酶、果膠酶、離析酶提取了紅豆草的原生質(zhì)體[11]。

纖維素酶和果膠酶能夠促進(jìn)細(xì)胞壁的降解，在筆者的研究中，為了保護(hù)細(xì)胞壁，只采用10%離析酶進(jìn)行酶解，從而獲得有完整細(xì)胞壁的單細(xì)胞。細(xì)胞壁的功能，細(xì)胞極性的形成，植物激素的定向運(yùn)輸，細(xì)胞骨架的極性變化，小泡的定向分布和運(yùn)輸?shù)纫幌盗屑?xì)胞發(fā)育事件都是彼此相連的。植物細(xì)胞壁在細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用，是細(xì)胞外圍的一層壁，有保護(hù)細(xì)胞的作用[12]。除此之外，細(xì)胞壁還參與了植物生長(zhǎng)、細(xì)胞分化、細(xì)胞識(shí)別、抗病反應(yīng)等一系列代謝活動(dòng)。細(xì)胞極性是生物體的基本屬性，在多細(xì)胞生物里同時(shí)也控制細(xì)胞間的信息交換、模式生成、身份識(shí)別。因此獲取有細(xì)胞壁的單細(xì)胞對(duì)研究細(xì)胞的生理生化具有重要意義，也是在細(xì)胞水平研究蘋果生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)。纖維素酶和果膠酶可以分解植物細(xì)胞壁，所以在本研究中，為了避免細(xì)胞壁的降解，只用了離析酶分離果肉細(xì)胞，通過VBL檢測(cè)，獲得了有完整細(xì)胞壁的果肉單細(xì)胞。Mcatee等把蘋果、梨等果實(shí)的果肉，一邊加熱煮沸，一邊通過磁力攪拌器攪拌05 h，直至看到果肉單細(xì)胞才停止加熱，但是獲得的單細(xì)胞已經(jīng)失去活性，只能用于檢測(cè)果肉細(xì)胞的大小和形狀[14]。而本研究分離得到的果肉細(xì)胞經(jīng)VBL染色，能看到完整的細(xì)胞壁，經(jīng)過FDA染色，單細(xì)胞具有明顯的活性。酶解處理的原則是利用盡可能低的酶濃度和盡可能短的酶解時(shí)間獲得大量且有活力的原生質(zhì)體[15]。本研究只用了01%離析酶，而且酶解時(shí)間只有05 h，低于酶解獲取原生質(zhì)體的時(shí)間[16-17]。

總之，采用01%離析酶酶解蘋果果肉，再攪拌30 min，能得到細(xì)胞壁完整且具有活性的果肉單細(xì)胞。

參考文獻(xiàn)：

Beijnum J R V，Mat R，Karolien C，et al Isolation of endothelial cells from fresh tissues[J] Nature Protocol，2008，3（6）：1085-1091

Candace H H，Lissete B，Michael R Cotton fiber：a powerful single-cell model for cell wall and cellulose research[J] Frontiers in Plant Science，2012，3（4）：279-286

[3]Narsinh K H，Ning S，Veronica S F，et al Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells[J] Journal of Clinical Investigation，2011，121（3）：1217-1221

[4]Bloch D，Yalovsky S Cell polarity signaling[J] Current Opinion in Plant Biology，2013，16（6）：734-742

[5]Li L G，Liu K，Hu Y Single mutations convert an outward K+ channel into an inward K+ channel[J] Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2008，105（8）：2871-2876

[6]張寧，李威，顧釗宇，等 ‘富士蘋果花粉原生質(zhì)體分離初探[J] 園藝學(xué)報(bào)，2015，42（6）：1167-1174

[7]黃祥輝，顏季瓊 應(yīng)用熒光增白劑 VBL 研究原生質(zhì)體細(xì)胞壁的再生[J] 植物生理學(xué)報(bào)，1980，6（2）：207-211

[8]張先杰，李鐸，孫海晨，等 臺(tái)盼藍(lán)染色與FDA/PI雙染色對(duì)檢測(cè)肝細(xì)胞活率的評(píng)價(jià)[J] 首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，21（3）：258-258

[9]張寧，司懷軍，王蒂 馬鈴薯單細(xì)胞分離技術(shù)的研究[J] 中國(guó)馬鈴薯，2004，18（4）：193-197

[10]陳穎，賈艷菊，張翠茹 擬南芥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體分離及影響因素[J] 河北大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，28（4）：423-426

[11]陳愛萍，羅玉鵬，姜婷娜，等 不同酶液組合及酶解時(shí)間對(duì)普通紅豆草原生質(zhì)體游離的影響[J] 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，31（2）：29-32

[12]Caffall K，Mohnen D The structure，function，and biosynthesis of plant cell wall pectic polysaccharides[J] Carbohydrate Research，2009，344（14）：1879-1900

[13]Cosgrove D Growth of the plant cell wall[J] Nature Reviews Molecular Cell Biology，2005，6（11）：850-861

[14]Mcatee P A，Hallett I C，Johnston J W，et al A rapid method of fruit cell isolation for cell size and shape measurements[J] Plant Methods，2009，5（1）：157

[15]Burton R A，F(xiàn)incher G B Plant cell wall engineering：applications in biofuel production and improved human health[J] Current Opinion in Biotechnology，2014，26（7）：79-84

[16]Mazarei M，Alahmad H，Rudis M Protoplast isolation and transient gene expression in switchgrass，Panicum virgatum L[J] Biotechnology Journal，2008，3（3）：354-359

[17]Zhai Z，Jung H I，Vatamaniuk O K Isolation of protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis thaliana[J] Journal of Visualized Experiments，2009，30（30）：1149-1159