王麗超+劉丹+姜勇+屠鵬飛+曾克武

[摘要] 探究肉蓯蓉低分子糖（LMSC）對RAW264.7小鼠巨噬細胞的激活作用靶點蛋白群及相關(guān)作用機制。該研究首先通過測定巨噬細胞吞噬活性以及NO釋放量來評價LMSC對RAW264.7巨噬細胞的激活作用。實驗結(jié)果顯示，LMSC在0.25～2 g·L-1給藥濃度可顯著提高RAW264.7細胞的吞噬活性及NO的釋放量，提示具有巨噬細胞激活作用。通過構(gòu)建LMSC鍵合的環(huán)氧活化瓊脂糖固相微球作為親和介質(zhì)，捕獲RAW264.7細胞裂解液中特異性結(jié)合靶標蛋白；對高分辨質(zhì)譜鑒定獲得的LMSC靶標蛋白群進行信號通路富集分析，探討LMSC巨噬細胞激活作用相關(guān)機制。實驗共獲得Eef2等24個LMSC靶點蛋白，分別涉及Fcγ受體依賴的吞噬、TNF-α NF-κB信號通路、糖酵解/糖原異生以及檸檬酸（TCA）循環(huán)和呼吸電子運輸過程等10條巨噬細胞激活相關(guān)信號通路。以上結(jié)果提示LMSC通過作用于多個靶點進而調(diào)節(jié)細胞吞噬、NF-κB信號通路以及糖代謝途徑最終實現(xiàn)對RAW264.7巨噬細胞激活作用。

[關(guān)鍵詞] 肉蓯蓉； 低分子糖； 巨噬細胞激活； 分子親和色譜； 靶點識別； 作用機制分析

[Abstract] This study aims to investigate the targets and targets-involved mechanism for the macrophage activation of low molecular weight saccharides from Cistanche deserticola （LMSC）. The phagocytic activity and NO release of RAW264.7 cells were detected， and results showed that LMSC exerts immune activation effect by significantly increasing the phagocytic activity and NO release. LMSC-conjugated epoxy-activated sepharose beads were prepared as affinity reagent to capture the target proteins. Twenty-four proteins such as Eef2 were identified by LC-MS/MS analysis. Pathway enrichment analysis showed LMSC activated RAW264.7 cells by regulating Fcgamma receptor dependent phagocytosis， TNF-alpha NF-κB signaling pathway， glycolysis/gluconeogenesis and the citric acid cycle and respiratory electron transport pathway.

[Key words] Cistanche deserticola； low molecular weight saccharides； macrophage activation； molecular affinity chromatography； target identification； mechanism analysis

肉蓯蓉Cistanches Herba是我國著名傳統(tǒng)補益中藥，具有補腎陽、益精血、潤腸通便^[1]之功效，有“沙漠人參”之稱?，F(xiàn)代分析化學研究表明肉蓯蓉中含有多種糖類成分，包括以果糖等為主的單糖化合物、蔗糖等寡糖化合物以及含ACDP-2等多糖，是肉蓯蓉發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、通便等作用的顯效物質(zhì)^[2-5]。肉蓯蓉多糖被廣泛報道為一類具有免疫調(diào)節(jié)作用的活性成分，低分子糖類（LMSC）如寡糖和單糖卻鮮為研究。本課題組一項對肉蓯蓉中主要活性部位進行巨噬細胞激活作用的研究發(fā)現(xiàn)，低分子糖是一類具有巨噬細胞激活作用的活性成分，但其免疫激活作用靶點及作用機制目前仍不明確。

分子親和色譜是一種通過固定相特異性結(jié)合目標分子從而實現(xiàn)分離純化目的色譜方法^[6]。該方法具有高親和力與高專一性，尤其適用于目標產(chǎn)物濃度極低的有機復雜體系^[7]，近年來逐步發(fā)展成為天然藥物靶標識別的有力工具。本研究利用基于分子親和色譜法的小分子靶標蛋白捕獲技術(shù)識別并鑒定具有巨噬細胞激活作用的LMSC靶點蛋白群。通過生物信息學分析，獲得靶標群的信號調(diào)節(jié)通路信息，以此探討LMSC的免疫調(diào)節(jié)活性及相關(guān)機制。

1 材料

1.1 細胞 小鼠巨噬細胞系RAW264.7購自中國醫(yī)學科學院細胞中心。

1.2 藥物與試劑 胎牛血清（FBS）購自德國PAN Biotech公司；抗生素、DMEM高糖培養(yǎng)基與6×蛋白上樣緩沖液均購自中科邁晨科技有限公司。肉蓯蓉低分子糖由本課題組自制，經(jīng)HPLC法測定主要含有甘露醇（16.53%）、蔗糖（8.34%）、果糖（25.38%）、葡萄糖（7.75%）等單體成分。大腸桿菌脂多糖（lipopolysaccharide from Escherichia coli O55：B5，LPS）、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）與0.33%中性紅溶液均購自美國Sigma-Aldrich公司。一氧化氮（NO）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。環(huán)氧活化瓊脂糖凝膠（Epoxy-activated Sepharose6B）購自瑞典GE healthcare公司。快速銀染試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。質(zhì)譜用甲酸和乙腈均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。endprint

1.3 儀器 CO2細胞培養(yǎng)箱（SANYO，日本）；CIX100顯微鏡（Olympus Corporation，日本）；5424R離心機（Eppendorf，德國）；自動純水機（Millipore，美國）；Sunrise-Basic酶標儀（TECAN，瑞士）；THZ-C臺式恒溫振蕩器（蘇州培英實驗設(shè)備有限公司）；EASY-nLC-Ⅱ液相色譜儀（Thermo Fisher Scientific，美國）；LTQ-Orbitrap離子阱串聯(lián)質(zhì)譜（Thermo Fisher Scientific，美國）；毛細管液相色譜柱（Michrom Bioresources，美國）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)及給藥 RAW264.7細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基中，并置于含5%CO2的37 ℃飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱。每2～3 d傳代1次，待細胞進入對數(shù)生長期時進行實驗。將細胞分為空白組、脂多糖組或肉蓯蓉低分子糖組。LPS組細胞使用1 mg·L-1LPS溶液處理，作為陽性對照；LMSC組細胞加入不同質(zhì)量濃度的LMSC溶液（0.25，0.5，1，2 g·L-1；給藥前用濾膜過濾）；空白組細胞加入等體積的無血清培養(yǎng)基。

2.2 中性紅法測定巨噬細胞吞噬活性 RAW264.7細胞接種于96孔板，過夜培養(yǎng)后更換為無血清培養(yǎng)基或含LPS或不同濃度LMSC的無血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，細胞更換為0.075%中性紅溶液，于37 ℃繼續(xù)孵育4 h。吸棄上清液，用PBS洗2遍，并使用細胞裂解液（冰醋酸-乙醇1∶1）于4 ℃下裂解細胞，待裂解完全后測定各孔吸光度（A540 nm）。

2.3 細胞上清液中NO釋放量檢測 RAW264.7細胞接種于48孔板，過夜培養(yǎng)后更換為無血清培養(yǎng)基或含LPS或不同濃度LMSC的無血清培養(yǎng)基。誘導培養(yǎng)24 h后，收集上清液，參照試劑盒說明書測定各孔細胞上清液中NO含量。

2.4 MTT法測定巨噬細胞活力 RAW264.7細胞接種于96孔板，過夜培養(yǎng)后更換為無血清培養(yǎng)基或含LPS或不同濃度LMSC的無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。各孔細胞更換為0.5 g·L-1MTT溶液，37 ℃孵育4 h，隨后用二甲基亞砜溶解MTT反應產(chǎn)物，并用酶標儀在570 nm波長處測定各孔吸光度。

2.5 肉蓯蓉低分子糖親和介質(zhì)的制備 參考文獻方法^[8]，稱取環(huán)氧活化瓊脂糖樹脂0.5 g，于去離子水中溶脹40 min后離心并棄去上清液，重復該過程3次，使凝膠充分溶脹（其體積約為1 mL），備用。分別吸取0.5 mL溶脹的環(huán)氧活化瓊脂糖凝膠與1 mL LMSC溶液（1 g·mL-1）或等體積溶劑混勻，置于37 ℃恒溫搖床上孵育過夜。將空白或偶聯(lián)LMSC的瓊脂糖介質(zhì)用去離子水清洗數(shù)次至上清無色，隨后加入1 mL乙醇胺溶液（1 mol·L-1），于37 ℃恒溫搖床上封閉2 d。反應結(jié)束后依次用雙蒸水、NaCl-HAc緩沖液及NaCl-Tris-HCl緩沖液各清洗5次，最后用0.01%NP40洗脫液清洗2次，備用。

2.6 靶點群的富集與識別 向RAW264.7細胞總蛋白提取液（0.5 g·L-1）中分別加入50 μL空白介質(zhì)或LMSC親和介質(zhì)，作為空白對照組及LMSC結(jié)合組；另設(shè)置同時加入LMSC溶液及LMSC親和介質(zhì)的競爭組。各組混合后，于4 ℃下孵育過夜，使LMSC與靶點蛋白充分結(jié)合。反應結(jié)束后用0.01%NP40洗脫液反復清洗親和介質(zhì)6次以洗去親和介質(zhì)上殘余的游離蛋白。洗滌過的親和介質(zhì)加入等體積 2×上樣緩沖液，98 ℃變性8 min解離結(jié)合蛋白。吸取上清液，進行SDS-PAGE凝膠電泳，隨后參照試劑盒說明書進行銀染分析。

2.7 LC-MS/MS法鑒定靶點蛋白群 參照文獻方法^[8]，利用二維納升級高效液相色譜儀串聯(lián)線性離子阱質(zhì)譜法（nano-HPLC-LTQ-Orbitrap/MS）鑒定特異性結(jié)合蛋白。具體方法如下：首先利用胰蛋白酶對顯色后的差異蛋白條帶進行膠內(nèi)酶解，獲得靶點肽段混合物。肽段混合物經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，吸取10 μL樣品溶液加樣至毛細管液相色譜柱。色譜條件：流動相0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫條件見表1。質(zhì)譜條件：電噴霧電壓為1.8 kV，正離子模式采集數(shù)據(jù)，全掃描范圍設(shè)置為m/z 350～2 000；對15個最強峰進行MS/MS掃描，二級碰撞能量設(shè)定為35 V。最后利用SEQUEST檢索軟件對獲得的肽段數(shù)據(jù)進行檢索匹配。

2.8 作用靶點群通路與功能分析 將鑒定得到的靶點蛋白導入Cytoscape 3.5.1軟件中，應用ClueGO插件進行KEGG，REACTOME Pathways及Wiki Pathways分析，設(shè)定種屬為小鼠，P<0.05為顯著性閾值，其余采用默認參數(shù)。

2.9 統(tǒng)計學分析 所有實驗數(shù)據(jù)均以±s表示。采用GraphPad Prism-6.02 統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析（ANOVA），以P<0.01作為具有非常顯著性差異。

3 結(jié)果與討論

3.1 肉蓯蓉低分子糖對RAW264.7細胞吞噬活性的影響 在本課題組另一項對肉蓯蓉巨噬細胞激活作用活性組分發(fā)現(xiàn)的研究中，LMSC可能是一類具有巨噬細胞激活作用的成分。本實驗首先利用中性紅法測定RAW264.7小鼠腹腔巨噬細胞體外培養(yǎng)體系經(jīng)不同給藥濃度LMSC刺激后細胞內(nèi)中性紅含量，以此考察LMSC對RAW264.7細胞吞噬活性的影響。與空白對照組相比，陽性對照藥LPS刺激細胞48 h可顯著增強細胞吞噬活性（P<0.01）；LMSC在0.25～2 g·L-1各給藥組均能顯著提高RAW264.7細胞的吞噬活性（P<0.01），且呈現(xiàn)劑量依賴特征。以上結(jié)果提示，LMSC可能具有激活RAW264.7細胞的作用，見圖1。endprint

3.2 肉蓯蓉低分子糖對RAW264.7細胞NO釋放的影響 NO是一種重要的具有機體免疫調(diào)節(jié)作用的細胞因子^[9]，被廣泛報道參與調(diào)控RAW264.7細胞激活反應。為進一步考察LMSC對RAW264.7細胞的激活作用，測定了LMSC刺激后細胞上清液中NO的含量。巨噬細胞激活陽性藥物LPS組NO釋放量顯著高于空白對照組（P<0.01），與之相似，0.5，1，2 g·L-13種劑量LMSC給藥組中RAW264.7細胞NO釋放量均明顯高于空白對照組（P<0.01），且呈劑量依賴性，見圖2。以上結(jié)果表明LMSC具有促進RAW264.7細胞釋放NO的效果，證實其巨噬細胞激活作用。

3.3 肉蓯蓉低分子糖對RAW264.7細胞活力的影響 細胞毒性作用是制約新藥開發(fā)與影響藥物發(fā)揮藥效的一項重要因素，為了考察本實驗中LMSC所用劑量是否具有潛在的細胞毒性，利用MTT法檢測LMSC給藥后的RAW264.7細胞活力。LMSC在0.25～2 g·L-1干預RAW264.7細胞24 h后對細胞活力沒有顯著影響，以上結(jié)果提示0.25～2 g·L-1LMSC對RAW264.7沒有細胞毒性，見圖3。

3.4 肉蓯蓉低分子糖巨噬細胞激活作用靶點群的富集與鑒定 環(huán)氧活化瓊脂糖凝膠是一種廣泛應用于含有羥基或氨基的糖類、蛋白質(zhì)等多種分子偶聯(lián)的固相載體。LMSC主要由富含羥基的果糖、甘露醇等成分組成，本研究利用所含的羥基可與環(huán)氧活性基團進行反應的特性，將肉蓯蓉低分子糖鍵合到環(huán)氧活化瓊脂糖凝膠微球表面，構(gòu)建LMSC親和介質(zhì)，見圖4A。利用分子親和色譜技術(shù)，將LMSC親和介質(zhì)與RAW264.7細胞總蛋白提取液進行孵育，以捕獲直接作用靶點蛋白群。對靶點群進行銀染色，見圖4B，LMSC親和介質(zhì)結(jié)合組的蛋白條帶明顯多于未偶聯(lián)LMSC的空白介質(zhì)組，而LMSC競爭組由于過量游離LMSC與靶點蛋白競爭性結(jié)合，引起親和介質(zhì)捕獲靶點數(shù)目顯著降低。隨后利用HPLC-MS/MS法對各蛋白條帶進行鑒定，共獲得Eef2等24個靶點蛋白，提示肉蓯蓉低分子糖可能通過以上靶點蛋白聯(lián)合作用引起巨噬細胞激活。

3.5 肉蓯蓉低分子糖巨噬細胞激活作用靶點群相關(guān)的作用機制分析 為了探究肉蓯蓉低分子糖靶點蛋白引起RAW264.7巨噬細胞激活的作用機制，本研究應用KEGG，REACTOME和Wiki信號通路數(shù)據(jù)庫對LMSC靶蛋白群所涉及的生物學通路進行分析。信號通路富集分析結(jié)果見圖5和表2，LMSC巨噬細胞激活作用靶點蛋白主要參與10條巨噬細胞激活相關(guān)信號通路，歸納為以下4類：Fcγ受體依賴的吞噬作用、TNF-α NF-κB信號通路、糖酵解/糖原異生以及檸檬酸（TCA）循環(huán)和呼吸電子運輸。

4 討論

現(xiàn)代研究報道中藥及天然藥物具有廣泛的生物學活性，但由于化學組成十分復雜，如何闡明中藥及天然藥物復雜成分體系的作用機制，至今仍面臨挑戰(zhàn)?；诜肿佑H和色譜法的小分子靶標蛋白捕獲技術(shù)，本研究結(jié)合肉蓯蓉分子糖（LMSC）中主要成分均具有羥基這一化學組成共性，構(gòu)建了LMSC鍵合的環(huán)氧活化瓊脂糖凝膠微球作為親和介質(zhì)，以此鑒定具有巨噬細胞激活作用的LMSC靶點蛋白群，并對靶點群相關(guān)的信號傳導通路進行分析，進而揭示了LMSC巨噬細胞激活作用機制。

巨噬細胞是機體內(nèi)具有吞噬顆粒型抗原作用的一類重要的免疫應答細胞^[10]。外源物刺激引起的巨噬細胞激活主要表現(xiàn)為吞噬功能的增強以及一系列信號傳導途徑引起的NO等因子的釋放。LMSC劑量依賴性提高RAW264.7細胞吞噬活性并顯著提高NO釋放，表明LMSC具有巨噬細胞激活作用。利用生物信息學手段對分子親和色譜法捕獲的LMSC巨噬細胞激活作用靶點進行信號通路富集分析，提示LMSC通過調(diào)節(jié)Fcγ受體依賴的吞噬作用、TNF-α NF-κB信號通路、糖酵解/糖原異生以及檸檬酸（TCA）循環(huán)和呼吸電子運輸?shù)冗^程發(fā)揮巨噬細胞激活作用。

Fcγ受體是細胞表面受體，是巨噬細胞模式識別受體之一^[11]，其位于細胞表面，能夠特異性識別外源性顆粒，使顆粒結(jié)合到細胞表面。Fcγ受體介導的吞噬作用信號傳導可引起下游肌動蛋白聚合及吞噬體的形成^[11]。LMSC顯著提高RAW264.7細胞吞噬活性，其作用可能與通過結(jié)合Hsp90等多種Fcγ受體信號傳導相關(guān)蛋白進而調(diào)節(jié)Fcγ受體依賴的吞噬作用相關(guān)。NF-κB信號通路被認為是巨噬細胞激活的一條關(guān)鍵信號傳導途經(jīng)^[12]。NF-κB是細胞核內(nèi)一種重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，NF-κB信號通路激活可以引起胞漿中NF-κB活化而移位至細胞核，進而介導各種細胞因子和NO等介質(zhì)的基因表達。LMSC刺激后可引起RAW264.7細胞大量釋放NO，其作用可能是通過結(jié)合Eef2等多種涉及TNF-α NF-κB信號通路等相關(guān)蛋白進而激活NF-κB信號通路及與之相關(guān)的真核翻譯起始與延長過程而實現(xiàn)的。此外，LMSC相關(guān)靶點還涉及糖酵解/糖原異生以及檸檬酸（TCA）循環(huán)和呼吸電子運輸2種糖類代謝途徑，推測LMSC含有的果糖、甘露醇等多種低分子糖對RAW264.7細胞進行能量供給并與糖代謝相關(guān)的Aldoa等蛋白結(jié)合，進而調(diào)控糖代謝相關(guān)途徑。

綜上所述，本研究利用分子親和色譜相關(guān)靶標蛋白識別技術(shù)鑒定得到LMSC巨噬細胞激活作用的24個不同功能靶點蛋白；靶蛋白相關(guān)的信號通路富集分析提示LMSC通過作用于Fcγ受體依賴的吞噬、TNF-α NF-κB信號通路以及糖代謝過程最終發(fā)揮RAW264.7巨噬細胞激活作用。該研究為揭示肉蓯蓉免疫調(diào)節(jié)作用活性組分與相關(guān)作用機制提供了理論支持，同時為天然藥物復雜活性成分群的靶點識別及作用機制研究提供了思路。

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[責任編輯 張寧寧]endprint