馬齒莧多糖對小鼠抗炎及鎮(zhèn)痛作用的實驗研究

趙蕊，吳桐，陳昭，劉琦

馬齒莧多糖對小鼠抗炎及鎮(zhèn)痛作用的實驗研究

趙蕊，吳桐，陳昭，劉琦

（黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，大慶 163319）

為了探討馬齒莧多糖的抗炎及鎮(zhèn)痛作用。實驗采用二甲苯導致小鼠急性炎癥模型及棉球肉芽腫慢性炎癥模型，將水提醇沉法制備的馬齒莧多糖經口灌胃小鼠連續(xù)12 d，觀察馬齒莧多糖的抗炎活性。通過HE染色觀察各組小鼠肝臟和腎臟的變化。并且通過熱板法觀察馬齒莧多糖對小鼠的鎮(zhèn)痛活性。結果顯示：馬齒莧多糖給藥組對小鼠肝、腎無明顯毒性，且高劑量馬齒莧多糖給藥組能顯著降低二甲苯誘導小鼠的耳腫脹及明顯抑制肉芽腫的增生，并能延長熱板法導致小鼠的舔足反應潛伏期時間、減少舔足次數(shù)。結論：該實驗結果顯示，馬齒莧多糖低毒、無副作用，對小鼠的急性和慢性炎癥均表現(xiàn)明顯的抑制活性，并表現(xiàn)出較強的鎮(zhèn)痛活性。

馬齒莧多糖；抗炎；鎮(zhèn)痛

馬齒莧，又名“長壽菜”是田頭路邊隨處可見的一種藥食兩用的植物[1]。我國馬齒莧資源豐富，儲量大且無污染。馬齒莧性寒，味甘酸，主入心、肝、脾、大腸經。主要功效是清熱解毒、利水除濕、消腫散血、殺蟲通淋等。藥理學研究證實，馬齒莧具有抗菌、降血脂、降血糖、增強免疫抗腫瘤等作用[2]。目前，手術切除、放療和化療是治療惡性腫瘤的主要方法。這些方法都有明顯的副作用，如白細胞減少并發(fā)炎癥等。解決臨床腫瘤患者疼痛也是醫(yī)護人員面臨的最大難題。多糖具有廣泛的生理活性，越來越多的研究表明，植物中獲取的多糖表現(xiàn)很強的免疫活性，一些提高機體免疫力的多糖已成為臨床上治療腫瘤的良好藥物[3]。多糖是馬齒莧中重要的生物活性物質之一。馬齒莧多糖的提取、分離和純化是研究其化學結構和表現(xiàn)出生物活性的基礎。研究應用天然活性成分馬齒莧多糖，觀察其對小鼠的抗炎及鎮(zhèn)痛活性，為臨床馬齒莧多糖作為抗腫瘤的輔助治療奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物：選取4周齡，體重20±2 g的 SPF級昆明雌性小鼠（購于長春醫(yī)科大學實驗動物中心）。

1.2 主要試劑：二甲苯分析純?yōu)樘旖蚴刑炝瘜W試劑有限公司，批號：20120308。阿司匹林腸溶片為德國拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號：20130078。醋酸地塞米松為華潤雙鶴藥業(yè)股份有限公司，批號：H11020537。

1.3 實驗方法

1.3.1 馬齒莧多糖制備

馬齒莧采自黑龍江省大慶市喇嘛甸一帶。稱取500 g干燥馬齒莧，粉碎，以甲醇回流脫脂后用80%乙醇回流去寡糖。殘渣采用傳統(tǒng)的水提醇沉法進行粗多糖制備[4]，簡要過程如下：藥材添加2 000 mL蒸餾水于95℃下提取，連續(xù)3次，每次進行2 h。合并3次提取后的濾液，減壓蒸餾濃縮，在濃縮后的粗提液中加入95%的乙醇50 mL，置4℃冰箱中過夜，經3 000 r·min-1離心15 min后，所得沉淀物分別用95%的乙醇、無水乙醇、丙酮進行洗滌，最后真空干燥得馬齒莧粗多糖，硫酸苯酚法測多糖含量。

1.3.2 小鼠急性炎癥模型的建立與分組

50只小鼠，雌雄各半，隨機分成5組，每組10只：模型對照組（灌胃生理鹽水）、馬齒莧粗多糖低劑量組（L：50 mg·kg-1）、中劑量組（M：100 mg·kg-1）、高劑量組（H：200 mg·kg-1）和陽性對照組（阿司匹林，4.17 mg·mL-1）。連續(xù)灌胃 12 天。末次給藥后 60 min，在小鼠右耳兩面均勻涂抹40 μL二甲苯，左耳作對照，30 min后，脫頸椎處死小鼠，沿耳廓線剪下雙耳，用6 mm打孔器分別在兩耳同一部位取下耳片，稱重，以左右耳片質量差值表示炎性腫脹程度[5]。比較各組小鼠耳廓腫脹度（左耳耳片重—右耳耳片重），并計算腫脹抑制率。

耳廓腫脹抑制率＝對照組平均腫脹度-用藥組平均腫脹度/對照組平均腫脹度×100%

1.3.3 小鼠慢性炎癥模型的建立與分組

分組及給藥途徑同1.3.2，陽性對照組（地塞米松3 mg·kg-1）。乙醚麻醉，背部去毛消毒，將兩個10 mg滅菌棉球分別植入小鼠兩側腋窩部皮下，術后次日開始用藥，連續(xù)灌胃12 d。末次給藥后60 min，處死小鼠，剝離肉芽組織，取出棉球，于60℃烤箱烘干后稱重，肉芽腫凈重=肉芽腫重量-原棉球重量。

1.3.4 馬齒莧多糖的鎮(zhèn)痛作用

用熱板舔足反應觀察馬齒莧多糖對熱刺激導致小鼠疼痛的鎮(zhèn)痛作用[5]。待熱板儀溫度穩(wěn)定在55℃時，將小鼠放入槽內，以小鼠舔右后足為疼痛反應指標預先測定痛閾值（以痛閾值平均值在5～30 s為合格小鼠）。 挑選合格小鼠50只，分組及給藥途徑同1.3.2，連續(xù)灌胃12 d。末次給藥后60 min，觀察小鼠舔足的反應潛伏期（即痛閾）及1 min內舔足的次數(shù)，計算痛閾提高的百分率。

痛閾提高百分率=（給藥后平均痛閾值-給藥前平均痛閾值）/給藥前平均痛閾值×100%。

1.3.5 病理學檢查

取適量肝、腎組織在4%中性多聚甲醛中固定，脫水、透明及石蠟包埋制片等處理，7 μm厚度切片。HE常規(guī)染色，中性樹膠封片。光鏡觀察，記錄病理形態(tài)學變化。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件進行分析，所有的試驗結果均以均數(shù)±標準誤（xˉ±S.D.）表示，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），當方差齊時，組間均值兩兩比較采用LSD檢驗。P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果與分析

2.1 馬齒莧多糖對小鼠肝、腎組織的影響

為了明確馬齒莧多糖對小鼠的毒性大小，對各組小鼠肝、腎組織HE染色切片觀察發(fā)現(xiàn)，光鏡下，與正常對照組相比，各給藥組小鼠肝小葉結構完整，中央靜脈居中，肝索向四周呈放射狀分布，肝細胞排列整齊，胞核清晰，胞漿豐富（圖1）。與正常對照組相比，各給藥組小鼠腎小球大小適中，結構完整，腎小管形態(tài)正常，無炎癥細胞浸潤和纖維組織增生（圖1）。

圖1 肝、腎組織形態(tài)學變化（HE×400）Fig.1 Morphological changes of liver and kidney tissue（HE×400）

2.2 馬齒莧多糖的抗炎活性

2.2.1 對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響

為了檢測馬齒莧多糖的抗炎活性，馬齒莧多糖灌胃小鼠12 d，通過建立二甲苯誘導的急性炎癥模型觀察馬齒莧多糖對小鼠耳腫脹的抑制效果。結果顯示，與模型對照組比較，馬齒莧多糖中、高劑量組可明顯降低二甲苯誘導的小鼠耳腫脹度（P＜0.05，P＜0.01）。阿司匹林組的小鼠耳腫脹度與模型對照組比較差異顯著（P＜0.01），但是與馬齒莧多糖高劑量組比較，無統(tǒng)計學差異（見表1）。因此，馬齒莧多糖對急性炎癥有抑制作用，且成劑量依賴性。

表1 馬齒莧多糖對二甲苯誘導小鼠耳腫脹的影響Table 1 Effect of Portulaca oleracea L.polysaccharide on ear swelling model induced by xylol in mice

2.2.2 對棉球所致小鼠肉芽組織增生的影響

為了檢測馬齒莧多糖的抗炎活性，通過對慢性炎癥小鼠給馬齒莧多糖后觀察小鼠肉芽組織增生的抑制效果。結果顯示，與模型對照組比較，馬齒莧多糖中、高劑量組可明顯減少棉球肉芽腫凈重（P＜0.05，P＜0.01）。地塞米松組的小鼠棉球肉芽腫凈重與模型對照組比較差異顯著（P＜0.01），但是與馬齒莧多糖高劑量組比較，無統(tǒng)計學差異（見表2）。因此，馬齒莧多糖對慢性炎癥有抑制作用，且成劑量依賴性。

表2 馬齒莧多糖對棉球所致小鼠肉芽組織增生的影響Table 2 Effect of Portulaca oleracea polysaccharide on granulation tissue hyperplasia induced by cotton ball in mice

2.3 馬齒莧多糖的鎮(zhèn)痛活性

為了了解馬齒莧多糖的鎮(zhèn)痛活性，通過檢測熱板法所致各組小鼠疼痛作用的影響。表3所示：與模型對照組比較，馬齒莧多糖各劑量組小鼠的舔足反應潛伏期時間延長，舔足次數(shù)均有減少，且高劑量組效果優(yōu)于低、中劑量組。阿司匹林組小鼠的舔足反應潛伏期時間顯著延長，舔足次數(shù)顯著減少，痛閾提高百分率為39.17%。與阿司匹林組小鼠比較，馬齒莧多糖各劑量組小鼠的舔足反應潛伏期和舔足次數(shù)均有顯著性差異。隨著劑量的不斷增加，痛閾提高百分率分別為12.45%、20.31%和27.25%。因此，馬齒莧多糖對熱源引起的疼痛有抑制作用，且成劑量依賴性，但是效果沒有阿司匹林作用強。

表3 馬齒莧多糖對熱板所致小鼠疼痛的影響Table 3 Effect of Portulaca oleracea polysaccharide on ache induced by hot plate in mice

3 討論

馬齒莧在我國資源豐富，儲量大且無污染，它不但具有一定的營養(yǎng)保健作用，且具有多種藥理活性，被譽為21世紀最有發(fā)展的綠色食物之一。隨著醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展，馬齒莧越來越引起科研工作者的興趣，并日益增進了對馬齒莧藥用價值的認識。馬齒莧作為一種具有綠色型、環(huán)保型保健作用的功能性藥物，備受人們的青睞，馬齒莧的開發(fā)利用具有巨大潛力，為我們提出了許多新課題。多糖作為近年來的研究熱點之一，它是一種重要的生命物質，因其參與了細胞的多種生命現(xiàn)象的調節(jié)，強化了機體自身的免疫功能，通過增強多種細胞因子的分泌，對腫瘤細胞起作用，同時對正常細胞無任何毒副作用，這有利于我們進一步開發(fā)新藥，并不斷擴展其在保健品、功能性食品中的應用，這是多糖區(qū)別于其他藥物的一大優(yōu)勢。有關馬齒莧多糖鎮(zhèn)痛、抗炎活性的研究國內外尚未見報道，由于實驗室已經證實馬齒莧的粗多糖提取物對人宮頸癌細胞株Hela有很好的抑制作用[6-7]，為了深入地探討，研究擬在我們已有工作的基礎上，對馬齒莧多糖的抗炎和鎮(zhèn)痛活性進一步探索，為開發(fā)利用馬齒莧作為高效、低毒的腫瘤輔助藥物及探索癌癥的中西醫(yī)綜合治療提供實驗理論依據(jù)。

炎癥是多種疾病的病理過程，以紅、腫、熱、痛為主要表現(xiàn)。初期以急性炎癥為主，逐漸遷延為慢性炎癥。腫瘤的術后及放化療患者由于機體的免疫力降低，易表現(xiàn)為炎癥反應[8]。中醫(yī)理論認為，炎癥的臨床表現(xiàn)以熱毒熾盛等實熱為主，中醫(yī)臨床治療多采用清熱解毒方藥[9]。因此，研究應用炎癥和疼痛動物模型評價馬齒莧多糖的抗炎鎮(zhèn)痛活性。二甲苯是化學致炎劑，可誘導炎癥介質釋放，導致局部毛細血管通透性增加、炎癥細胞浸潤引起水腫。中藥創(chuàng)新藥物研發(fā)中，常以二甲苯誘發(fā)小鼠耳殼急性腫脹，模擬機體急性炎癥的病理狀態(tài)，以評價藥物抗炎活性。研究結果顯示，馬齒莧多糖對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹和棉球肉芽腫具有明顯抑制作用，表明其對急性炎癥和炎癥后期結締組織的生成均具有抑制作用。小鼠足底沒有毛，皮膚裸露在外，在高溫的熱板刺激下會產生疼痛，小鼠表現(xiàn)出舔后足反應，熱板法是研究藥物鎮(zhèn)痛活性的常用方法。研究結果顯示，馬齒莧多糖各劑量能使熱疼痛導致的小鼠舔后足反應潛伏期延長，舔后足次數(shù)減少，其中高劑量鎮(zhèn)痛效果最強。

研究過程中，我們選用臨床上常用的抗炎鎮(zhèn)痛藥阿司匹林和地塞米松作為陽性對照藥。馬齒莧多糖高劑量組對急性炎癥的效果與阿司匹林相似，但對熱板所致的疼痛的改善不及阿司匹林。阿司匹林是通過抑制外周前列腺素的合成起抗炎、鎮(zhèn)痛作用，但其具有抑制血小板聚集作用、惡心、嘔吐、上腹部不適或疼痛等副作用[10]。馬齒莧多糖高劑量組對慢性炎癥的效果雖然不如地塞米松，但是兩組無統(tǒng)計學差異。地塞米松是長效類糖皮質激素類藥物，具有較多副作用，如滿月臉、向心性肥胖、痤瘡、多毛、高血壓、高血脂、低血鉀、肌肉萎縮、尿糖升高、骨質疏松、甚至股頭壞死，以及胃潰瘍、胃穿孔或誘發(fā)精神分裂癥和癲癇等。我們的實驗結果證實馬齒莧多糖低毒無明顯副作用，適用范圍廣，可作為臨床長期應用的抗腫瘤輔助治療藥物。

4 結論

馬齒莧多糖低毒、無副作用，對小鼠的急性和慢性炎癥均表現(xiàn)明顯的抑制活性，并表現(xiàn)出較強的鎮(zhèn)痛活性。

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Anti-inflammatory and Analgesic Study of Portulaca oleracea L.polysaccharide on Mice

Zhao Rui，Wu Tong，Chen Zhao，Liu Qi
(College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

The acute inflammation model induced by xylene and chronic inflammation model induced by cotton ball granuloma in mice were adopted to discuss the anti-inflammation and analgesic action of Portulaca oleracea L.polysaccharide.Portulaca oleracea L.polysaccharide was obtained by water extraction and alcohol precipitate method，and then the anti-inflammatory effects were evaluated by intragastric administration with Portulaca oleracea L.Polysaccharide for 12 d.The change of liver and kidney in mice was observed by HE dyeing.In addition，the analgesic effects were evaluated by hot-plate test.The experimental results showed that there was no obvious toxicity in liver and kidney of mice after treatment by Portulaca oleracea L.polysaccharide.And Portulaca oleracea L.polysaccharide of high dose group significantly suppressed xylene-induced ear edema in mice and significantly inhibited the proliferation of granuloma.Furthermore，the latency time of licking foot caused by hot plate method in mice was extended，but the number of times was reduced.The experimental results indicated that Portulaca oleracea L.polysaccharide was low toxicity and no side effects，and the inhibitory activity on acute and chronic inflammation was obvious，moreover the analgesic activity was significant.

Portulaca oleracea L.polysaccharides；anti-inflammatory；analgesia

R285

A

1002-2090（2017）05-0028-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.05.008

2016-11-29

黑龍江省教育廳科研項目（馬齒莧多糖對宮頸癌免疫逃逸作用的研究：12511370）。

趙蕊（1975-），女，副教授，燕山大學畢業(yè)，現(xiàn)主要從事中藥藥理及新藥研究與開發(fā)方面的研究工作。