大慶龍鳳濕地一株新型δ-變形菌綱趨磁螺菌的發(fā)現(xiàn)

張衡 ，王芙仙 ，王春麗 ，陳志寶

大慶龍鳳濕地一株新型δ-變形菌綱趨磁螺菌的發(fā)現(xiàn)

張衡1，2，王芙仙2，王春麗1，陳志寶1

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶 163319；2.中國科學(xué)院地質(zhì)與地球物理研究所，地球與行星物理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）

通過對大慶龍鳳濕地中趨磁細(xì)菌的首次研究，發(fā)現(xiàn)了一株新型趨磁螺菌，它能夠在細(xì)胞內(nèi)合成子彈頭形磁小體，成分為磁鐵礦，呈單鏈排列，16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析，該趨磁細(xì)菌屬于變形菌門中的δ-變形菌綱，是目前國內(nèi)在東北地區(qū)第一例、內(nèi)陸第三例發(fā)現(xiàn)的屬于δ-變形菌綱的趨磁細(xì)菌。研究揭示了大慶地區(qū)可能蘊(yùn)含豐富的趨磁細(xì)菌資源，δ-變形菌綱趨磁細(xì)菌在該地區(qū)的首次發(fā)現(xiàn)對龍鳳濕地的生態(tài)環(huán)境認(rèn)識也具有一定的指示意義。

趨磁細(xì)菌；δ-變形菌綱；龍鳳濕地；16S rRNA；透射電子顯微鏡

趨磁細(xì)菌（Magnetotactic bacteria，MTB）廣泛存在于全球的水生環(huán)境的表層沉積物或具有化學(xué)梯度分層環(huán)境的水體中，是一類能沿地磁場或外加磁場運(yùn)動的革蘭氏陰性細(xì)菌，趨磁細(xì)菌的這個行為被稱為趨磁性（Magnetotaxis）[1]。通過趨磁性，研究者能將趨磁細(xì)菌從自然樣品中富集和磁分離[2]。趨磁細(xì)菌的趨磁性是因?yàn)槠淠軌蛟诩?xì)胞內(nèi)通過生物控制礦化合成有膜包被的，單磁疇的磁鐵礦（Fe3O4）或膠黃鐵礦（Fe3O4）磁性晶體顆粒，即磁小體[3-4]。它是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一能利用地磁場定向和在細(xì)胞內(nèi)礦化合成納米級磁鐵礦或膠黃鐵礦的原核微生物，是研究微生物控制礦化和微生物-礦物相互作用的典范[5]。通過對趨磁細(xì)菌多樣性及其生物礦化機(jī)制的深入研究，能夠?yàn)槲覀兏玫牧私馍锏V化作用，認(rèn)識其在鐵、硫、氧等元素地球化學(xué)循環(huán)中和維持地球生態(tài)系統(tǒng)功能方面的重要作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)，趨磁細(xì)菌極其多樣，從形貌上講有球菌、桿菌、弧菌、螺旋菌和多細(xì)胞形態(tài)細(xì)菌；從系統(tǒng)進(jìn)化上講，迄今發(fā)現(xiàn)的趨磁細(xì)菌分屬于細(xì)菌域中的四個門類：變形菌門、硝化螺旋菌門、Omnitrophica門（暫定分類單元OP3）和Latescibacteria門（暫定分類單元WS3），其中變形菌門中趨磁細(xì)菌分布在的 α-、δ-、γ-三個綱中[7]。 目前發(fā)現(xiàn)報道的 δ-變形菌綱趨磁細(xì)菌均屬于硫酸鹽還原細(xì)菌，從形態(tài)上講主要可分為兩大類：一類是由10～30個細(xì)胞組成的多細(xì)胞趨磁細(xì)菌（MMP）；另一類則是常見的單細(xì)胞的趨磁細(xì)菌。前者只在海洋中被發(fā)現(xiàn)[8]，后者目前國內(nèi)只在西安的護(hù)城河和未央湖中發(fā)現(xiàn)并報道[9-10]。

近期，馬如霞等[11]對大慶龍鳳濕地的沉積物中的氨氧化的細(xì)菌和古菌進(jìn)行了研究報道，研究則綜合使用光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡和分子生物學(xué)技術(shù)，對大慶龍鳳濕地中的趨磁細(xì)菌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了一株新型的δ-變形菌綱的趨磁細(xì)菌，該細(xì)菌為螺旋菌，能夠在體內(nèi)生物控制礦化合成子彈頭狀的磁鐵礦磁小體，是目前國內(nèi)在沼澤濕地中發(fā)現(xiàn)的第一株δ-變形菌綱的趨磁細(xì)菌，也是第一株螺旋狀的δ-變形菌綱趨磁細(xì)菌，對于豐富國內(nèi)趨磁細(xì)菌的多樣性以及認(rèn)識濕地生態(tài)環(huán)境具有一定的指示意義。

1 材料和方法

1.1 環(huán)境中趨磁細(xì)菌樣品的采集、儲存和檢測

研究從大慶龍鳳濕地自然保護(hù)區(qū)內(nèi)選取了一處水深約兩米的沼澤，采集水體的表層沉積物樣品，將樣品按照沉積物：原位水=1∶2的比例裝入550毫升的采樣瓶中，帶回實(shí)驗(yàn)室，松開瓶口在避光處室溫存放。記錄采樣點(diǎn)坐標(biāo)、采樣時間等信息，使用鹽度計和pH計測量記錄原位水的鹽度和pH值。

對實(shí)驗(yàn)室中儲存的樣品，每隔3～5 d，使用5 mL的一次性的塑料吸管，在樣品的泥水交界面處吸取沉積物，然后采用懸滴法檢測樣品中的趨磁細(xì)菌種類及數(shù)量變化[12]。檢測方法：將樣品在磁場中富集約15 min，富集后的樣品放在光學(xué)顯微鏡下對液滴兩邊富集的趨磁細(xì)菌，采用奧林巴斯BX51型顯微鏡進(jìn)行觀察并拍照記錄[13]。

1.2 環(huán)境中趨磁細(xì)菌的富集

趨磁細(xì)菌的收集可以采用毛細(xì)管和磁分離器[14]，研究中采用磁分離器收集沉積物中的趨磁細(xì)菌，收集過程中使用的所有儀器材料需要提前清洗滅菌，對于檢測發(fā)現(xiàn)含有數(shù)量較多的趨磁細(xì)菌樣品，將采樣瓶中上部的原位水移入到一個干凈的燒杯中，原位水需剩余0.5 cm，選用5 mL的移液槍，將剩余的原位水與瓶中1～2 cm深的沉積物攪拌成泥漿，轉(zhuǎn)移至趨磁細(xì)菌的分離器中，分離器連接離心管的一端微微上揚(yáng)，距離分離器兩端5 cm處放置一對條形鐵氧體磁鐵，由于北半球的趨磁細(xì)菌趨北運(yùn)動，所以在靠近離心管的一端將磁鐵的S極面向分離器，在靠近分離器的一端將磁鐵N極面向分離器，形成一個定向的磁場，使樣品內(nèi)的趨磁細(xì)菌定向移動到離心管內(nèi)，富集1.5 h，取下離心管，12 000 rpm離心2 min，去除上清，PBS緩沖液清洗兩次，最后濃縮至50 μL得到磁富集后的趨磁細(xì)菌樣品。

1.3 純化后趨磁細(xì)菌樣品的處理

將富集純化后的趨磁細(xì)菌樣品分成三份：制備透射電子顯微鏡樣品、制備PCR模板、固定保存。取1～2 μL樣品滴在銅網(wǎng)的正中心，室溫靜置30 min后，使用蒸餾水洗去銅網(wǎng)表面的雜質(zhì)，待銅網(wǎng)干燥后移至銅網(wǎng)盒中，進(jìn)行透射電子顯微鏡觀察和測量；取10 μL的樣品于200 μL離心管中，使用PCR儀設(shè)置98℃加熱10 min，作為PCR模板；除去電鏡和擴(kuò)增模板使用，剩下的所有趨磁細(xì)菌樣品使用終濃度1%多聚甲醛于4℃固定過夜，清洗后存放在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 透射電子顯微鏡觀測

透射電子顯微鏡實(shí)驗(yàn)在JEM-2100HR型透射電鏡上完成，實(shí)驗(yàn)的加速電壓為200 kV。該電鏡還配備了牛津X射線能譜儀（型號Oxford X-Max 80），在微納米尺度上對樣品進(jìn)行形貌觀測的同時，對目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行化學(xué)成分分析。

1.5 16S rRNA基因的擴(kuò)增、測序及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

使用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物27F、1492R進(jìn)行擴(kuò)增[15]，擴(kuò)增體系和反應(yīng)步驟如Lin等人所述[16]，然后構(gòu)建出其16S rRNA基因克隆文庫，在文庫中隨機(jī)挑選克隆送往公司完成測序，測序結(jié)果拼接后去除質(zhì)粒部分，使用NCBI的BLAST比對剔除非趨磁細(xì)菌序列，趨磁細(xì)菌按照98%劃分OTU，使用MEGA 7.0軟件將序列比對分析后，使用比鄰法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，自展系數(shù)選取1 000[17]。

2 結(jié)果

2.1 沉積物樣品采集信息

樣品采集時間為2015年7月，采樣地點(diǎn)位于大慶龍鳳濕地自然保護(hù)區(qū)內(nèi)，具體坐標(biāo)北緯46°31′57.8″，東經(jīng) 125°11′57.1″，利用鹽度計和 pH 計測得原位水的鹽度為1.93 ppt，pH值為7.82。

2.2 趨磁細(xì)菌的檢測、富集和形態(tài)觀測

如圖1所示，利用懸滴法對大慶龍鳳濕地的沉積物樣品進(jìn)行觀測，在光學(xué)顯微鏡下發(fā)現(xiàn)樣品含有一類螺旋形的趨磁細(xì)菌為優(yōu)勢菌群，數(shù)量約為103～104個·cm-3，為趨北運(yùn)動的趨磁細(xì)菌。對磁分離后的趨磁細(xì)菌染色后利用光學(xué)顯微鏡觀測，發(fā)現(xiàn)這類趨磁螺菌比例超過95%，暫時命名為LFSHDR-1。透射電鏡觀測顯示，LFSHDR-1為螺旋狀，細(xì)菌長度為2.5～4.3 μm，直徑為 0.5～1.1 μm，通常在細(xì)胞內(nèi)合成1條磁小體鏈，含有20～50顆子彈頭狀的磁小體，磁小體形狀大小差異較為明顯，成熟后的磁小體長度能達(dá)到80 nm，其寬度可達(dá)30 nm。透射電鏡X-射線能譜分析顯示，磁小體的成分為鐵和氧，是磁鐵礦（圖 2）。

圖1 大慶龍鳳濕地樣品中趨磁細(xì)菌的光學(xué)顯微鏡和透射電鏡照片F(xiàn)ig.1 Optical microscopy images and transmission electron microscopy images of magnetotactic bacteria from Daqing Longfeng wetland samples

圖2 樣品中趨磁螺菌磁小體X-射線能譜圖Fig.2 The X-ray energy spectrum of magnetotactic magnetism in samples

2.3 趨磁細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育

由于光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀測結(jié)果均顯示樣品中的趨磁螺菌為優(yōu)勢菌，我們將磁分離后的趨磁細(xì)菌進(jìn)行DNA提取和16S rRNA基因擴(kuò)增，并建立單克隆文庫。從單克隆文庫中任意挑選了40個進(jìn)行16S rRNA基因測序，排除載體序列和質(zhì)量較低的序列后，獲得32條高質(zhì)量的序列，約含1 491個堿基，將這32條序列兩兩比對發(fā)現(xiàn)序列之間相似度非常高（大于99%），說明這些序列為同一類群，因此歸類為一個OTU，從該OTU中選取了1條代表性的序列命名為LFSDR-1，與已知的代表性序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖3）。通過NCBI進(jìn)行BLAST同源性比對，發(fā)現(xiàn)與已發(fā)表的δ-變形菌綱的趨磁細(xì)菌具有最高的相似度，在95%～96%，預(yù)示該菌為一株新型的δ-變形菌綱趨磁細(xì)菌。

圖3 趨磁細(xì)菌16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of magnetotactic bacteria 16S rRNA genes

3 討論與結(jié)論

研究綜合使用光學(xué)顯微鏡、透射電子顯微鏡和分子生物學(xué)技術(shù)，對大慶龍鳳濕地采集的沉積物樣品進(jìn)行檢測研究，發(fā)現(xiàn)了一株新型的螺旋形的趨磁細(xì)菌LFSHDR-1，其與Christopher等[18]在美國一個咸水湖報道的δ-變形菌綱的趨磁螺菌在菌體和磁小體形態(tài)上都非常相似，且通過16S rRNA分析比對其序列相似度在95%～96%，同為NCBI數(shù)據(jù)庫中相似度比對最高的序列，說明該菌為一株新型的δ-變形菌綱趨磁細(xì)菌。δ-變形菌綱報道的較少，除去對海洋沉積物中MMP的報道，國內(nèi)僅在西安發(fā)現(xiàn)報道了該種趨磁細(xì)菌，且龍鳳濕地地處高緯度，水體偏鹽堿性，預(yù)示著大慶地區(qū)可能有更多豐富和獨(dú)特的趨磁細(xì)菌資源，有待進(jìn)一步的研究。

透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)該趨磁細(xì)菌的磁小體雖然歸類為子彈頭狀的磁小體，但是同一菌體內(nèi)不同磁小體之間形狀差異顯著，子彈頭磁小體也并非朝著同一個方向進(jìn)行生長，預(yù)示其有著不同的生物礦化機(jī)制[19]；同時國內(nèi)西安未央湖和護(hù)城河報道的δ-變形菌綱的趨磁細(xì)菌90%以上都是桿菌，所以該菌的發(fā)現(xiàn)不僅豐富了國內(nèi)趨磁細(xì)菌的多樣性，同時為趨磁細(xì)菌的生物礦化機(jī)制研究提供新的材料。從生理生化特征上講，δ-變形菌綱趨磁細(xì)菌均屬于硫酸鹽還原細(xì)菌（SRB）。硫酸鹽還原菌是一類非常重要厭氧微生物，在有機(jī)質(zhì)的生物降解過程中扮演重要角色，也能將廢水中的硫酸鹽還原成H2S，凈化水體[20]。LFSHDR-1在大慶龍鳳濕地沼澤環(huán)境中的首次發(fā)現(xiàn)，對于揭示其可能與該濕地沉積物中有機(jī)物降解和促進(jìn)碳、氮和硫的地球化學(xué)循環(huán)相關(guān)有重要意義。

下一步可以利用宏基因組測序、生物信息學(xué)和更先進(jìn)的顯微學(xué)和顯微譜學(xué)方法對龍鳳濕地中所發(fā)現(xiàn)的LFSHDR-1和其他類型的趨磁細(xì)菌進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究，了解其礦化基因及其礦化機(jī)制；并繼續(xù)開展對大慶地區(qū)趨磁細(xì)菌多樣性和分布的研究，為趨磁細(xì)菌的研究開發(fā)提供更多的材料和理論依據(jù)。

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Detection of a Novel Magnetotactic Bacterium Belong to δ-Proteobacteria in Longfeng Wetland of Daqing City

Zhang Heng1，2，Wang Fuxian2，Wang Chunli1，Chen Zhibao1
（1.Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.Key Laboratory of Earth and Planetary Physics，Institute of Geology and Geophysics，Chinese Academy of Sciences）

A novel strain of magnetotactic bacterium was detected in Longfeng Wetland of Daqing City.It formed dozens of bulletshaped magnetite-type magnetosomes which were organized into single chain.Phylogenetic analysis of its 16S rRNA gene demonstrated that this strain was affiliated with the δ-Proteobacteria class within the Proteobacteria phylum.This study provided a case that magnetotactic bacteria occurred in wetland environments for the first time in the northeastern region of China.The first detection of magnetotactic δ-Proteobacteria indicated an abundant resources of magnetotactic bacteira in Daqing region，and also indicated the significance for the understanding of ecological environment in Longfeng wetland.

magnetotactic bacteria；δ-Proteobacteria；Longfeng wetland；16S rRNA；transmission electron microscopy

Q14

A

1002-2090（2017）05-0054-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.05.014

2017-03-06

國家自然科學(xué)基金（41522402和41374004）；黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)研究生科研創(chuàng)新資助項(xiàng)目（YJSCX2016-Y46）。

張衡（1991-），男，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)2013級碩士研究生。

陳志寶，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：chenzhibao@byau.edu.cn。