歐明林，曾 君，龔蔚蔚，薛 雯，荊環(huán)云，張若菡，陳潔晶，甘 晴，戴 勇，眭維國

·臨床研究·

罕見性反轉(zhuǎn)綜合征三例微陣列基因組雜交檢測結(jié)果分析

歐明林，曾 君，龔蔚蔚，薛 雯，荊環(huán)云，張若菡，陳潔晶，甘 晴，戴 勇，眭維國

目的探討微陣列基因組雜交檢測在性反轉(zhuǎn)綜合征診斷中的價(jià)值及臨床意義。方法收集2010—2015年來我院中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行遺傳咨詢患者的臨床資料與外周血標(biāo)本，采用G顯帶技術(shù)分析患者染色體核型，并對確診為性反轉(zhuǎn)綜合征的患者進(jìn)行微陣列基因組雜交檢測，分析患者基因組拷貝數(shù)變異(copy number variations, CNVs)變化特點(diǎn)。結(jié)果同期在本實(shí)驗(yàn)室行遺傳咨詢者共9946例，其中3例(0.03%)診斷為性反轉(zhuǎn)綜合征。其中G顯帶染色體核型分析確診46,XX男性性反轉(zhuǎn)綜合征2例，46,XY女性性反轉(zhuǎn)綜合征1例。微陣列基因組雜交檢測發(fā)現(xiàn)3例均存在亞顯微CNVs異常變化，其中1例46,XX男性性反轉(zhuǎn)綜合征患者性染色體Yp11.31存在擴(kuò)增(SRY陽性)；另2例均未檢測到SRY基因(SRY陰性)。結(jié)論桂林地區(qū)遺傳咨詢?nèi)巳褐行苑崔D(zhuǎn)綜合征患者相對罕見，微陣列基因組雜交技術(shù)為CNVs檢測提供了一種高效的方法,為性反轉(zhuǎn)綜合征病因?qū)W篩查及分類提供了新的途徑。

性逆轉(zhuǎn),性腺；細(xì)胞遺傳學(xué)分析；核型分析；基因拷貝數(shù)變異

目前，人類性別決定的關(guān)鍵因素尚未完全闡明，現(xiàn)有研究報(bào)道普遍認(rèn)為Y染色體，特別是Y染色體中的睪丸決定因子(testis deter- mining factor， TDF)可以引導(dǎo)性腺原基發(fā)育成熟為睪丸，在人類性別決定中扮演著關(guān)鍵的角色[1]。性反轉(zhuǎn)綜合征是一類染色體核型與性腺不一致的罕見疾病，可以細(xì)分為46，XX男性性反轉(zhuǎn)綜合征和46,XY女性性反轉(zhuǎn)綜合征[2]。性反轉(zhuǎn)綜合征臨床以男性假兩性畸形和女性假兩性畸形兩種表現(xiàn)較為常見，患者體內(nèi)一般只有1種生殖腺[3]。根據(jù)Y染色體SRY基因特異性序列的存在與否，在分子水平上此病又分為SRY陽性和陰性兩類[4]。國外流行病學(xué)研究顯示，46，XX男性和46，XY女性性反轉(zhuǎn)綜合征的發(fā)病率分別約為1/20 000和1/100 000，而我國尚缺乏本病的流行病學(xué)相關(guān)報(bào)道[5]。本研究統(tǒng)計(jì)近5年來我院進(jìn)行遺傳咨詢的性反轉(zhuǎn)綜合征患者，并應(yīng)用微陣列芯片技術(shù)對患者進(jìn)行基因組拷貝數(shù)變異(copy number variations， CNVs)分析，以期為本病的分類、診斷和發(fā)病機(jī)制研究提供新的信息。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2010—2015年來我院中心實(shí)驗(yàn)室行遺傳咨詢患者資料和外周血標(biāo)本9946例，其中發(fā)現(xiàn)性反轉(zhuǎn)綜合征3例，發(fā)病率0.03%。

1.2遺傳學(xué)檢測及分析

1.2.1G顯帶核型分析：取經(jīng)肝素抗凝處理的患者外周血標(biāo)本，利用細(xì)胞培養(yǎng)基(廣州拜迪生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn))增殖培養(yǎng)淋巴細(xì)胞70 h，加入適量秋水仙素終止細(xì)胞分裂，于第72小時收獲細(xì)胞，常規(guī)制片及烘干后利用2%胰酶消化，Giemsa染色顯帶，最后應(yīng)用光學(xué)顯微鏡和Imager.Z2蔡司染色體自動掃描儀及分析系統(tǒng)進(jìn)行核型分析。其中每例標(biāo)本計(jì)數(shù)細(xì)胞分裂象30個，詳細(xì)分析染色體核型3～5個，存在核型異常標(biāo)本適當(dāng)增加染色體計(jì)數(shù)及核型分析量。

1.2.2微陣列基因組雜交：選取G顯帶染色體核型性別與社會性別不一致的患者臨床資料及外周血標(biāo)本，應(yīng)用QIAamp DNA Blood Mini Kit(美國Qiagen公司生產(chǎn))提取患者基因組DNA并稀釋至50 ng/μl；每例標(biāo)本取DNA 250 ng，應(yīng)用Affymetrix CytoScan 750K Array和Affymetrix GCS 3000D V.2微陣列基因芯片分析系統(tǒng)(美國Affymetrix公司生產(chǎn))進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)步驟主要參考試劑盒說明書進(jìn)行，并根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)。實(shí)驗(yàn)主要過程包括：片段化DNA樣本，全基因組擴(kuò)增，產(chǎn)物純化及質(zhì)量檢測，雜交，洗脫，染色和掃描。芯片掃描儀分析所得數(shù)據(jù)由Chromosome Analysis Suite 3.1系統(tǒng)(美國Affymetrix公司生產(chǎn))進(jìn)行分析，并利用國際公共良性CNVs數(shù)據(jù)庫(DGVs)和國際公共病理性CNVs數(shù)據(jù)庫(DECIPHER)對結(jié)果進(jìn)行過濾，獲得潛在的病理性CNVs。

2 結(jié)果

2.1臨床特征 經(jīng)G顯帶染色體核型分析發(fā)現(xiàn)46，XX男性性反轉(zhuǎn)綜合征2例，46，XY女性性反轉(zhuǎn)綜合征1例。3例主要臨床表現(xiàn)及性激素水平見表1、表2。

表1 3例性反轉(zhuǎn)綜合征臨床表現(xiàn)

表2 3例性反轉(zhuǎn)綜合征性激素水平

2.2微陣列基因組雜交結(jié)果 1例46，XX男性性反轉(zhuǎn)綜合征患者為SRY基因陽性，另1例46，XX男性和1例46，XY女性性反轉(zhuǎn)綜合征患者均為SRY基因陰性。3例患者在不同的染色體區(qū)帶均存在相對較大片段(Marker Count>50)的潛在病理性CNVs，見表3和圖1。

3 討論

性反轉(zhuǎn)綜合征是一類罕見的性腺發(fā)育異常相關(guān)的染色體病，目前人們對此病的了解仍十分有限。性反轉(zhuǎn)綜合征中以46，XY女性患者較為罕見，國際上共發(fā)現(xiàn)46，XX男性患者僅數(shù)百例[6-7]。在近5年的遺傳咨詢以及染色體核型分析工作中，我們累計(jì)發(fā)現(xiàn)本病患者僅3例，發(fā)病率與國外文獻(xiàn)報(bào)道相近。在臨床表現(xiàn)方面，由于大多數(shù)患者在出生時具有正常表型，僅15%的患者會出現(xiàn)尿道下裂、隱睪和嚴(yán)重的生殖器畸形病征，因此大多數(shù)患者是在青春期后由于性腺發(fā)育不全、男性乳房異常發(fā)育和不育，進(jìn)行遺傳咨詢篩查從而確診[8]。國外一些研究認(rèn)為性反轉(zhuǎn)綜合征發(fā)病率(1/20 000～1/25 000)可能被嚴(yán)重低估，導(dǎo)致一部分患者可能在不孕不育病因篩查中被漏診[9]。本組1例表現(xiàn)為相對正常男性表型，因不育進(jìn)行核型分析從而確診；另2例因?yàn)樯称鳟惓：蜕L發(fā)育異常進(jìn)行核型分析從而確診。因此，根據(jù)相關(guān)診療指南針對嚴(yán)重?zé)o精子癥、少弱精子癥和生長發(fā)育異常患者，進(jìn)行染色體核型分析在本病診斷中具有重要的臨床意義[10]。

表3 3例性反轉(zhuǎn)綜合征染色體相對較大片段的基因組拷貝數(shù)變化情況

圖1 3例性反轉(zhuǎn)綜合征微陣列基因組雜交圖

性反轉(zhuǎn)綜合征的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明，現(xiàn)普遍認(rèn)為本病與Y染色體缺失，特別是Y染色體特定區(qū)帶缺失存在密切的關(guān)系[9]。一些研究表明，Xp-Yp易位導(dǎo)致的染色體異常是本病發(fā)病的最主要原因，因?yàn)樵谄涓赶瞪臣?xì)胞減數(shù)分裂異常而產(chǎn)生的包含SRY基因的X型精子，與正常母系卵子結(jié)合很可能會導(dǎo)致子代異常受精卵產(chǎn)生[11]。在本研究中，G顯帶核型分析并未發(fā)現(xiàn)這些患者的X染色體長臂存在明顯的異常，也未發(fā)現(xiàn)與Y染色體可能相關(guān)的標(biāo)記染色體，該結(jié)果可能與染色體顯帶的分辨率較低，以及易位片段大小有關(guān)；為了進(jìn)一步明確這些患者是否存在Y染色體DNA序列，我們利用微陣列基因組雜交技術(shù)對患者基因組DNA序列的拷貝數(shù)進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)例1和例3存在部分Y染色體DNA序列，例2不存在，結(jié)果表明存在Y染色體DNA序列的性反轉(zhuǎn)綜合征患者與其父系生殖細(xì)胞Xp-Yp易位相關(guān)可能性較大，而不存在Y染色體DNA序列的患者致病原因則可能與Xp-Yp易位無關(guān)。SRY基因?yàn)樾坌缘男詣e決定關(guān)鍵基因，該基因只有一個外顯子，無內(nèi)含子，46，XX男性性反轉(zhuǎn)綜合征患者SRY陽性和46，XY女性性反轉(zhuǎn)綜合征患者SRY陰性較為常見[12]。本研究中，兩例未檢測到Y(jié)染色體者為SRY陰性，余1例檢測到Y(jié)p11.31存在擴(kuò)增，為SRY陽性患者，基因組雜交分析進(jìn)一步確定了G顯帶核型分析難以明確的疾病亞型；SRY基因缺失可能在例2和例3患者的性發(fā)育異常過程中起關(guān)鍵作用。

一些研究發(fā)現(xiàn)，性染色體遺傳物質(zhì)DNA的突變、重復(fù)或缺失在性反轉(zhuǎn)綜合征患者基因組內(nèi)比較常見[13-15]，其臨床表現(xiàn)較高的異質(zhì)性以及病因的不確定性可能與染色體異常有關(guān)。本研究微陣列基因組雜交分析發(fā)現(xiàn)了一些G顯帶核型分析無法發(fā)現(xiàn)的性染色體亞顯微CNVs。例1性染色體Xp22.33存在缺失涉及8個基因，其中6個基因存在于孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫中，可能與生物過程蛋白質(zhì)的合成以及基因表達(dá)調(diào)控存在密切的關(guān)系。此外，該患者Yp11.2與Yp11.31存在多個片段的重復(fù)，涉及SRY和ZFY等與性別決定密切相關(guān)的基因。與例1類似，例3性染色體Yq11.21-2染色體存在多個片段重復(fù)，盡管片段相對較小(<500 kbp)，但涉及7個基因，其中6個基因?yàn)椴G丸特異轉(zhuǎn)錄蛋白，有趣的是它們很可能是1976年Tieplolo等發(fā)現(xiàn)的無精子因子(azoospermia factor， AZF)成員，AZF缺失一直被認(rèn)為是無精子癥致病的關(guān)鍵原因之一，然而AZF重復(fù)是否與無精子癥有關(guān)仍未明確[16]。潛在具有病理性作用的亞顯微CNVs不但存在于性反轉(zhuǎn)綜合征患者X和Y性染色體上，而且也見于常染色體上，并且其片段大小不一，涉及多個基因。對相關(guān)基因進(jìn)行功能分析發(fā)現(xiàn)，不少基因與各種已知孟德爾遺傳病存在一些聯(lián)系，該結(jié)果表明性反轉(zhuǎn)綜合征可能僅代表一大類疾病，其進(jìn)一步分類仍有待根據(jù)分子細(xì)胞遺傳檢測結(jié)果確定。但是，人類基因組中存在的CNVs多為非病理性，本研究中發(fā)現(xiàn)CNVs的臨床意義尚有待更多研究證實(shí)。此外，微陣列基因組雜交技術(shù)也存在一些明顯的不足，比如該技術(shù)只能針對包括重復(fù)和缺失的CNVs進(jìn)行檢測，而無法對性反轉(zhuǎn)綜合征致病相關(guān)基因的突變、平衡易位、倒位等因素進(jìn)行檢測。

綜上所述，性反轉(zhuǎn)綜合征是一類相對罕見的性發(fā)育異常疾病，此病臨床表現(xiàn)較高的異質(zhì)性以及發(fā)病機(jī)制的多樣性給臨床診療帶來了挑戰(zhàn)，針對嚴(yán)重少精子癥、無精子癥和外生殖器畸形患者進(jìn)行染色體核型分析，有利于本病的確診。盡管不少亞顯微CNVs的致病機(jī)制尚未被明確，在傳統(tǒng)核型分析的基礎(chǔ)上進(jìn)行微陣列基因組雜交分析可以獲得更詳細(xì)的患者核型重復(fù)與缺失異常信息，這些信息可能在明確疾病分類、指導(dǎo)臨床合理治療、促進(jìn)患者第二性征發(fā)育及避免性腺惡變相關(guān)疾病的發(fā)生等方面具有重要的應(yīng)用前景。

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ResultsAnalysisofDetectionofMicroarrayGenomicHybridizationfor3PatientswithRareSexReversalSyndromes

OU Ming-lin1, ZENG Jun2, GONG Wei-wei1, XUE Wen1, JING Huan-yun1, ZHANG Ruo-han1, CHEN Jie-jing1, GAN Qing1, DAI Yong2, SUI Wei-guo1

(1. Central laboratory Guangxi Key laboratory of Metabolic Diseases Research, 181 Hospital of PLA, Guilin, Guangxi Zhuang Nationality Autonomous Region 541002， China； 2. Clinical Medical Research Center, Shenzhen People's Hospital, Shenzhen, Guangdong 518020, China)

ObjectiveTo analyze values and clinical significances of detection of microarray genomic hybridization in diagnosis of sex reversal syndromes.MethodsClinical data and peripheral blood samples of patients with genetic counseling from 2010 to 2015 were collected. G-banding technique was used to analyze the chromosomal karyotypes. Detection of microarray genomic hybridization was performed for patients confirmed sex reversal syndromes, and characteristics changes in patients were analyzed.ResultsThere were 9946 patients with genetic counseling at the same period, and 3 patients (0.03%) were confirmed as having sex reversal syndromes. G band karyotype analysis showed that there were 2 male patients with 46, XX female sex reversal syndrome and 1patient with 46, XY sex reversal syndrome. Detection of microarray genomic hybridization showed that 3 patients had micro sub CNVs abnormal changes, which included that sex chromosome Yp11.31 of 1 patient with 46, XX male sex reversal syndrome had amplification (SRY-positive), while other 2 patients did not find SRY gene (SRY-negative).ConclusionThe sex reversal syndrome in genetic counseling population in Guilin is relatively rare. Microarray genomic hybridization provides an effective method for CNVs detection. It is a new way for the etiological diagnosis and classification of sex reversal syndromes.

Sexual reversal, gonad; Cytogenetic analysis； Karyotype analysis; Gene copy number variations

廣西科技計(jì)劃項(xiàng)目(桂科攻1598012-25)

541002 廣西壯族自治區(qū) 桂林，解放軍181醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室 廣西代謝性疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(歐明林、龔蔚蔚、薛雯、荊環(huán)云、張若菡、陳潔晶、甘晴、眭維國)；518020 廣東 深圳，深圳市人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心(曾君、戴勇)

眭維國，E-mail：suiwg@163.com

R698.2

A

1002-3429(2017)10-0076-05

10.3969/j.issn.1002-3429.2017.10.026

2017-06-26 修回時間：2017-07-23)