高壓中溫協(xié)同處理對(duì)菠蘿汁活性和致敏性的影響

梁 娟， 吳澤宇， 潘 見， 葛 梅， 徐金鳳

（合肥工業(yè)大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥230009）

高壓中溫協(xié)同處理對(duì)菠蘿汁活性和致敏性的影響

梁 娟， 吳澤宇， 潘 見*， 葛 梅， 徐金鳳

（合肥工業(yè)大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥230009）

為探討高壓協(xié)同中溫對(duì)鮮菠蘿汁活性和致敏性的影響，將鮮榨菠蘿汁經(jīng)不同壓力組合溫度處理后，測(cè)定其蛋白質(zhì)水解活性、纖溶活性和致敏性的變化。結(jié)果表明：高壓條件下，溫度對(duì)蛋白質(zhì)水解活性的影響削弱并變得不顯著。400 MPa組合溫度有利于纖溶活性的增加，而500 MPa組合溫度使纖溶活性降低。致敏性則隨著壓力和溫度的增加下降，500 MPa和50℃時(shí)致敏性降至51.39%。因此，壓力組合中溫對(duì)蛋白質(zhì)水解活性、纖溶活性和致敏性影響各不相同，選擇合適的溫度和壓力可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)鮮菠蘿汁的保活和減敏。

超高壓；中溫；菠蘿汁；活性；致敏性

菠蘿（Ananas comosus L.Merr）屬于鳳梨科多年生植物，是熱帶和亞熱帶地區(qū)的主要水果品種，我國(guó)菠蘿產(chǎn)量居世界第四位[1]。菠蘿中除含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，還含有一種蛋白水解酶菠蘿蛋白酶（bromelain，EC 3.4.22.3）[2]。 菠蘿蛋白酶具有抗血小板聚集、溶解纖維蛋白、抗炎、抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移及清創(chuàng)等功能等，被廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥行業(yè)[3-6]。除此之外，菠蘿蛋白酶也是一種常見的水果的過(guò)敏原，國(guó)內(nèi)學(xué)者報(bào)道了很多由菠蘿蛋白酶引起的菠蘿過(guò)敏的案例，菠蘿過(guò)敏尤其容易出現(xiàn)在嬰幼兒以及其他免疫力較弱的人群[7-8]。

菠蘿汁是果汁市場(chǎng)上僅次于橙汁的大宗果汁[9]。傳統(tǒng)的熱殺菌不僅會(huì)破壞菠蘿汁的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)，也會(huì)完全鈍化菠蘿汁中的主要生物活性成分菠蘿蛋白酶[10-11]。超高壓殺菌可以避免熱殺菌帶來(lái)的上述問題，最大程度的保留其風(fēng)味、營(yíng)養(yǎng)和菠蘿蛋白酶的活性[12-13]，但同時(shí)也部分殘留了致敏性。通過(guò)研究高壓協(xié)同中溫處理對(duì)菠蘿汁活性和致敏性影響，總結(jié)超高壓條件下菠蘿汁活性和致敏性的變化規(guī)律，可以為高活性低致敏性功能菠蘿汁的開發(fā)提供相關(guān)的理論與數(shù)據(jù)支持。

商業(yè)菠蘿蛋白酶的活性是通過(guò)其對(duì)不同底物如酪蛋白、明膠等的蛋白質(zhì)水解活性來(lái)進(jìn)行表征的。而菠蘿蛋白酶的某些活性如菠蘿蛋白酶抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及其清創(chuàng)作用主要與纖溶活性有關(guān)[5-6]?？寡“寰奂屠w維蛋白溶解也是基于菠蘿蛋白酶的纖溶活性[14-15]。因此本文作者在考察菠蘿汁的致敏性的同時(shí)，以超高壓菠蘿汁的酪蛋白水解活性和纖溶活性2個(gè)指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)菠蘿汁的功能活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 菠蘿：購(gòu)自合肥市周谷堆農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)；低相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)：購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；牛纖維蛋白原、凝血酶（酶活力62 U/mg）和4-氯-1-萘酚：購(gòu)自Sigma公司；尿激酶（酶活力1240 U/支）：購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；福林酚試劑：購(gòu)自索萊寶科技有限公司；致敏者血清：取自安徽醫(yī)科大學(xué)；羊抗人IgE：購(gòu)于美國(guó)Abcam公司；ELISA盒：購(gòu)于美國(guó)Costa公司；PVDF膜：購(gòu)自美國(guó)Pall corporation公司；超濾離心管：購(gòu)于美國(guó)Millipore公司：其余試劑購(gòu)于上海生工和國(guó)藥集團(tuán)。

1.1.2 儀器 1 L超高壓釜：包頭科發(fā)科技有限公司產(chǎn)品；超高壓系統(tǒng)：上海大隆超高壓設(shè)備廠制造；3K15高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)SIGMA公司產(chǎn)品；Thermo TSE320低溫冰箱：美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；Epoch微孔板分光光度計(jì)：美國(guó)BioTek公司產(chǎn)品；DZ-400/2S真空包裝機(jī)：浙江金華市包裝機(jī)械有限公司產(chǎn)品；SHP-250恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品。Epoch微孔板分光光度計(jì)：美國(guó)BioTek公司產(chǎn)品；JASCO J-810圓二色光譜儀：日本JASCO公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試樣的處理 選擇新鮮的8成熟的菠蘿，去皮去目，將果肉破碎成小塊榨汁，用6層紗布過(guò)濾，除去纖維和其他雜質(zhì)。然后4 000 r/min于4℃離心30 min去除大分子雜質(zhì)。保留上清液，棄去沉淀。

用于酪蛋白水解活性和纖溶活性檢測(cè)的樣品，取離心的上清液分裝在無(wú)菌PE瓶中，PE瓶用密封袋密封，密封袋中充滿水以排除空氣。然后至于1 L的高壓容器中加壓。用于致敏性測(cè)定的樣品，取離心后的菠蘿汁緩慢加入硫酸銨粉末提取致敏蛋白質(zhì)，邊加邊攪拌，直至加到飽和度為40%后停止，繼續(xù)攪拌2 h后，放入離心管中，6 000 r/min離心20min，棄去上清液，沉淀用雙蒸水復(fù)溶，然后用超濾離心管脫鹽和定量復(fù)溶，最后調(diào)節(jié)pH和添加不同含量的NaCl。所有提取和分離步驟均在4℃條件下進(jìn)行，處理好的所有樣品于-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蛋白質(zhì)水解活性測(cè)定 蛋白質(zhì)水解活性采用Forlin-酚法測(cè)定，參照蛋白酶活力測(cè)定法商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T10317-1999[16]。蛋白質(zhì)水解活力計(jì)算方法為：每mL菠蘿汁在40℃下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸，定義為1個(gè)蛋白酶活力單位。

式中：A為樣品平行試驗(yàn)的平均吸光度；4為反應(yīng)試劑的總體積，mL；10為反應(yīng)時(shí)間10 min；N為稀釋倍數(shù)。

相對(duì)蛋白質(zhì)水解活性如式（2），

式中，M1為待測(cè)樣品的蛋白質(zhì)水解活性；M2為對(duì)照品的蛋白質(zhì)水解活性。

1.2.3 纖溶活性測(cè)定 參考Astrup T[17]等采用的纖維素平板法測(cè)定菠蘿汁的纖溶活性，并根據(jù)本實(shí)驗(yàn)情況適當(dāng)改變了凝血酶和纖維蛋白原的比例。以尿激酶為標(biāo)準(zhǔn)品，以尿激酶活力單位數(shù) C（U/mL）的對(duì)數(shù)log C為橫坐標(biāo)，裂解圈的面積 A（mm2）的對(duì)數(shù)值log A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定樣品時(shí)取待測(cè)樣品10 μL點(diǎn)樣于纖維蛋白平板樣孔中，按上述方法進(jìn)行操作，測(cè)定裂解圈的直徑后取平均值，根據(jù)尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣品的纖溶活性。每個(gè)樣品做3個(gè)平行。

式（3）中，M3為待測(cè)樣的纖溶活性；M4為對(duì)照樣的纖溶活性。

1.2.4 致敏性測(cè)定 采用間接酶聯(lián)免疫法。包被：每孔包被100 μL抗原稀釋液，4℃放置過(guò)夜或者37℃保溫2 h。用200 μL PBST洗滌液洗滌3次，每次5 min。封閉：每孔加入封閉液200 μL，37℃孵育2 h，倒出封閉液。加一抗：每孔加入100 μL致敏者血清（1∶200），37 ℃孵育 1 h，洗滌 3 次，每次 5 min。加酶標(biāo)二抗：每孔加入100 μL辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗人 IgE（1∶2 000），37 ℃孵育 1 h。 洗滌 5 次，每次5 min。顯色：取出酶標(biāo)板，每孔加入底物液TBS 200 μL，置于室溫黑暗處放置 15 min。終止：取出酶標(biāo)板，向每孔中加入終止液50 μL。用酶標(biāo)儀在450 nm的吸光度下檢測(cè)。

1.2.5 不同影響因素的選擇 實(shí)驗(yàn)所用菠蘿汁的天然pH值為pH 3.65，超高壓處理保壓時(shí)間均設(shè)為20 min，常壓下選擇 10、20、30、40、50、60、70 ℃ 7 個(gè)不同溫度，400 MPa和500 MPa壓力條件下10、20、30、40、50℃ 5個(gè)溫度。每個(gè)實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定 3次，以未經(jīng)超高壓處理菠蘿汁的蛋白質(zhì)水解活性、纖溶活性和致敏性作為參照，相對(duì)值定義為100%?？疾斐邏航M合溫度對(duì)菠蘿汁的蛋白質(zhì)水解活性，纖溶活性和致敏性的影響時(shí)，選擇溫度范圍是10～50℃，主要是考慮到溫度高于50℃時(shí)，會(huì)影響菠蘿汁的風(fēng)味和香氣成分[18-19]。超高壓選擇400 MPa和500MPa的主要原因是2個(gè)，首先超高壓用于果汁殺菌一般選擇400 MPa或者以上，其次根據(jù)之前的研究結(jié)果，400 MPa壓力以上時(shí)，菠蘿汁活性和致敏性的差異較大且致敏性下降速度較快，有利于同時(shí)實(shí)現(xiàn)菠蘿汁的保活和減敏。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用EXCEL2007和Designexpert 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高壓中溫協(xié)同對(duì)蛋白質(zhì)水解活性的影響

根據(jù)蛋白質(zhì)水解活性標(biāo)準(zhǔn)曲線，菠蘿汁原樣的蛋白質(zhì)水解活性為（74.67±2.66）U/mL，其相對(duì)值定義為100%。圖1顯示了常壓、400 MPa和500 MPa的壓力下不同溫度對(duì)蛋白質(zhì)水解活性的影響。從該圖可以看出，常壓下，相對(duì)蛋白質(zhì)水解活性隨溫度的升高先增加后降低，并于50℃時(shí)達(dá)到最大值112.59%。這與文獻(xiàn)報(bào)道的菠蘿蛋白酶的最適酶活為55℃基本一致[20]。當(dāng)溫度高于酶的最適溫度范圍時(shí)，溫度升高，酶蛋白的氫鍵、疏水作用、離子鍵和靜電相互作用會(huì)弱化，三維構(gòu)象受到破壞，酶出現(xiàn)熱失活，使得酶活力降低甚至完全鈍化。常壓下，溫度對(duì)蛋白質(zhì)水解活性的影響顯著（p＜0.05）。

圖1 壓力協(xié)同不同溫度對(duì)蛋白質(zhì)水解活性的影響Fig.1 Effects of high pressure combined with temperature on proteolytic activity of pineapple juice

400 MPa，10～50℃時(shí)，蛋白質(zhì)水解活性變化不明顯，500 MPa，10～50 ℃，蛋白質(zhì)水解活性隨壓力的略有降低。另外，高壓條件下溫度較低時(shí)（如10℃），高壓能夠增加菠蘿蛋白酶的活性。這與Sun等[21]認(rèn)為從的在一定溫度范圍內(nèi)，溫度恒定時(shí)提高壓力將導(dǎo)致分子有序性的形成相符合。

數(shù)據(jù)分析顯示壓力組合中溫對(duì)蛋白質(zhì)水解活性的影響不顯著（p＞0.05）且壓力和溫度之間存在交互作用（p＜0.05）。 Fang[22]等研究高壓協(xié)同中溫對(duì)過(guò)氧化物酶活力的影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。以上分析說(shuō)明超高壓減弱了溫度對(duì)蛋白質(zhì)水解活性的影響，使得二者的組合效應(yīng)對(duì)蛋白質(zhì)水解活性的影響不明顯不顯著。

2.2 高壓中溫協(xié)同對(duì)纖溶活性的影響

根據(jù)纖溶活性標(biāo)準(zhǔn)曲線，菠蘿汁原樣纖溶活性為（247.88±13.21）U/mL，其相對(duì)值定義為 100%。從圖2可以看出常壓下，菠蘿汁的相對(duì)纖溶活性和相對(duì)蛋白質(zhì)水解活性曲線的變化趨勢(shì)相似，這和Morita[23]等認(rèn)為的菠蘿蛋白酶纖溶活性和蛋白水解活性有關(guān)的研究結(jié)果相似；但溫度對(duì)二者的影響程度不同，纖溶活性受溫度的影響更大，50℃時(shí)相對(duì)纖溶活性達(dá)到最高值121.33%。常壓下，溫度對(duì)菠蘿汁纖溶活性的影響顯著（p＜0.05）。

圖2 壓力協(xié)同不同溫度對(duì)纖溶活性的影響Fig.2 Effects of high pressure combined with temperature on fibrinolytic activity of pineapple juice

超高壓組合溫度對(duì)纖溶活性的影響則不同于對(duì)蛋白水解活性的影響。400 MPa、20～50℃條件下，纖溶活性幾乎是無(wú)差別的；500 MPa、10～40℃之間纖溶活性隨著溫度上升而上升，50℃時(shí)略有下降。400 MPa組合溫度有利于纖溶活性的增加，而500 MPa組合溫度使得纖溶活性低于常壓下的值。50℃，400 MPa和500 MPa條件下的纖溶活性分別為118.63%和84.57%。400 MPa時(shí)纖溶活性增強(qiáng)，可能是由于該壓力促使菠蘿蛋白酶的結(jié)構(gòu)微調(diào)，從而形成更有利于酶與其纖溶活性底物相結(jié)合的構(gòu)型。而更高的壓力（如500 MPa）則會(huì)破壞菠蘿蛋白酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)，從而使酶的活性降低。張瑜[24]等通過(guò)對(duì)脂肪酶活性的研究發(fā)現(xiàn)，壓力和溫度對(duì)酶分子排列和空間構(gòu)象存在拮抗關(guān)系，認(rèn)為不同加工條件下，加壓或升溫對(duì)酶的影響不同。低溫低壓，適度地增加溫度和壓力都能使酶保持其穩(wěn)定性；高溫高壓，溫度和壓力任一增加都會(huì)破壞酶的穩(wěn)定；低溫高壓，增加壓力使酶變性，增加溫度能夠穩(wěn)定酶活，高溫低壓作用相反。Eisenmenger等[25]報(bào)道了具有類似變化曲線的食品酶還有胰凝乳蛋白酶、多酚氧化酶、果膠甲酯酶、柚苷酶、β-葡聚糖酶、淀粉酶等。數(shù)據(jù)分析顯示超高壓組合溫度對(duì)纖溶活性的影響顯著（p＜0.05）且壓力和溫度對(duì)纖溶活性的影響具有交互作用（p＜0.05）。

2.3 高壓中溫協(xié)同對(duì)致敏性的影響

根據(jù)致敏性檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)曲線，菠蘿汁原樣的致敏原質(zhì)量濃度為（0.955±0.043）mg/mL，相對(duì)值定義為100%。從圖3可以看出常壓下，與蛋白質(zhì)水解活性和纖溶活性在50℃時(shí)最高不同，致敏性在20℃時(shí)達(dá)到最大值。常壓下溫度對(duì)致敏性的影響顯著（p＜0.05）。

圖3 壓力協(xié)同不同溫度對(duì)致敏性性的影響Fig.3 Effects of high pressure combined with temperature on allergenicity of pineapple juice

不同壓力組合溫度使得致敏性均低于常壓下的值，但400 MPa時(shí)，致敏性曲線變化較平緩，500 MPa時(shí)隨著溫度增加的致敏性下降速率加快，500 MPa和50℃時(shí)，相對(duì)致敏性降至51.39%。說(shuō)明在較高溫度和較高壓力時(shí)有利于致敏性的降低。數(shù)據(jù)分析顯示常壓下溫度對(duì)致敏性的影響顯著 （p＜0.05）。400 MPa時(shí)溫度對(duì)致敏性影響不顯著（p＞0.05），500 MPa時(shí)溫度對(duì)致敏性影響顯著（p＜0.05），壓力組合溫度對(duì)致敏性的影響具有交互作用（p＜0.05）。

比較圖1—圖3可以看出，超高壓條件下，溫度對(duì)蛋白質(zhì)水解活性和致敏性的影響相似，這和Hale等[26]等發(fā)現(xiàn)的菠蘿蛋白酶和其他半胱氨酸蛋白酶的蛋白質(zhì)水解活性和致敏性有一定的關(guān)系，并發(fā)現(xiàn)鈍化菠蘿蛋白酶可以降低其致敏性的研究結(jié)果相似。但超高壓對(duì)致敏性的影響程度更大。500 MPa時(shí)，蛋白質(zhì)水解活性和致敏性均隨著溫度的升高而降低，致敏性下降速率更快；在500 MPa、50℃時(shí)蛋白質(zhì)水解活性降至75.10%，而致敏性則降至51.39%。超高壓組合中溫對(duì)纖溶活性的影響則不同，400 MPa組合中溫可以提高纖溶活性，500 MPa組合中溫則使纖溶活性降低。

引起菠蘿蛋白酶蛋白水解活性、纖溶活性和致敏性變化的均是菠蘿蛋白酶，但是壓力組合中溫對(duì)三者的影響的不同。這可能是由于菠蘿蛋白酶對(duì)三者的作用機(jī)制不同。蛋白質(zhì)水解活性的作用目標(biāo)物是酪蛋白，纖溶活性是同時(shí)直接降解纖溶蛋白和把血纖維蛋白溶酶原轉(zhuǎn)化成溶纖維蛋白酵素來(lái)降解纖維蛋白[27]。而菠蘿蛋白酶的致敏性則是由抗原表位決定的，但關(guān)于菠蘿蛋白酶致敏性的抗原表位和作用機(jī)制的研究目前并未見相關(guān)報(bào)道。除此之外，菠蘿蛋白酶的活性位點(diǎn)和抗原表位也可能受到基質(zhì)組成的影響而表現(xiàn)出各自的變化特征。方亮[28]研究發(fā)現(xiàn)獼猴桃汁中的過(guò)氧化物酶在不同緩沖溶液和真實(shí)的食品體系中表現(xiàn)出不同的活性，Basak[29]和Rastogi[30]認(rèn)為由于不同的食品具有不同的pH值和化學(xué)組成成分，同種酶自不同食品基質(zhì)中所表現(xiàn)的耐壓特性有不同。對(duì)于本研究來(lái)說(shuō)，我們主要是考察超高壓菠蘿汁的特性，而非單純的菠蘿蛋白酶溶液，超高壓菠蘿汁是一個(gè)具有復(fù)雜基質(zhì)的體系。

3 結(jié) 語(yǔ)

常壓下溫度對(duì)蛋白質(zhì)水解活性影響顯著，50℃時(shí)蛋白質(zhì)水解活性達(dá)到最大值；超高壓能減弱溫度對(duì)蛋白質(zhì)水解活性的影響，使高壓下條件溫度對(duì)蛋白質(zhì)水解活性的影響不顯著，400 MPa時(shí)，蛋白質(zhì)水解活性幾乎無(wú)變化，500 MPa時(shí)，蛋白質(zhì)水解活性隨溫度的增加略有降低。

常壓下菠蘿汁的纖溶活性和蛋白質(zhì)水解活性的變化趨勢(shì)相似，但溫度對(duì)纖溶活性的影響程度更大。400 MPa、20～50℃時(shí)，纖溶活性幾乎是無(wú)差別的；500 MPa、10～40℃之間纖溶活性隨著溫度上升而上升，50℃時(shí)略有下降。且400 MPa組合溫度有利于纖溶活性的增加，而500 MPa組合溫度則使纖溶活性降低。50℃、400 MPa和500 MPa條件下的纖溶活性分別為118.63%和84.57%。

常壓下致敏性于20℃時(shí)達(dá)到最大值；高壓條件下，隨著壓力和加壓溫度的增加致敏性逐漸下降，500 MPa、50℃時(shí)降至 51.39%。

綜上，壓力組合中溫對(duì)蛋白質(zhì)水解活性、纖溶活性和致敏性影響各不相同，選擇合適的溫度和壓力可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)鮮菠蘿汁的?；詈蜏p敏。

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Effect of Combined High Pressure and Thermal Treatment on Activities and Allergenicity of Pineapple Juice

LIANG Juan， WU Zeyu， PAN Jian*， GE Mei， XU Jinfeng
（Engineering Research Centre of Bio-Process，Ministry of Education，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China）

In order to investigate the effect of high pressure combined with moderate temperature on the activity and allergenicity of pineapple juice，after treated by different pressures and temperatures，the proteolytic activity，fibrinolytic activity and allergenicity change of fresh squeezed pineapple juices were detected.The results showed that the effect of temperature on proteolytic activities were weaken and not significant under high pressure.The fibrinolytic activities increased under 400 MPa treatment combined with different temperatures，while decreased under 500 MPa treatment combined with a series of temperatures.Allergenicity decreased with the increase of pressure and temperature，and fell to 51.39%at 500 MPa and 50 ℃ .Therefore，the effect of high pressure combined with moderate temperature on proteolytic activity，fibrinolytic activity and allergenicity was different.Preserving activity and reducing allergenicity of pineapple juice could be achieved simultaneously with the selection of appropriate temperature and pressure.

ultra-high pressure，moderate temperature，pineapple juice，activity，allergenicity

TS 255.1

A

1673—1689（2017）08—0849—06

10.3969/j.issn. 1673-1689.2017.08.010

2015-06-11

安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（1708085QC77）。

*通信作者：潘 見（1955—），男，安徽合肥人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事功能食品研究。E-mail：hfut20022013@sina.com

梁娟，吳澤宇，潘見，等.高壓中溫協(xié)同處理對(duì)菠蘿汁活性和致敏性的影響[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，36（08）：849-854.