劉夢靈， 陳穎華， 張盛春

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 廣東省植物發(fā)育生物工程重點實驗室， 廣州 510631)

過氧化氫對擬南芥生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白的影響

劉夢靈， 陳穎華， 張盛春*

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 廣東省植物發(fā)育生物工程重點實驗室， 廣州 510631)

通過添加外源過氧化氫來探究其對植物生長素信號的影響. 以GUS基因作為報告基因，研究擬南芥中各生長素相關(guān)蛋白(生長素含量標志蛋白DR5、輸入蛋白AUX1、輸出蛋白PIN1和PIN2)對過氧化氫的響應(yīng). 結(jié)果表明過氧化氫處理后擬南芥呈植株變小、根變短和不定根數(shù)目增多的表型；與對照相比，GUS染色后各生長素相關(guān)蛋白的表達下降，表明過氧化氫對植物生長素的合成與運輸起一定的抑制作用. 在過氧化氫處理的基礎(chǔ)上，添加抗氧化物質(zhì)后發(fā)現(xiàn)植株表型有明顯恢復(fù)，GUS染色也表明相關(guān)蛋白的表達量均增加；另外，0.1 nmol/L的外源IAA能恢復(fù)過氧化氫處理后擬南芥的表型和生長素相關(guān)蛋白的表達. 綜上所述，過氧化氫主要通過抑制植物體內(nèi)的生長素信號來調(diào)控植物的生長發(fā)育.

擬南芥； 生長素信號； 過氧化氫； 生長發(fā)育

Keywords：Arabidopsisthaliana; auxin signal; hydrogen peroxide; growth and development

植物在生長過程中會進行光合作用、呼吸作用以及光呼吸等有氧代謝，這些生理過程均會產(chǎn)生活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)，包括超氧陰離子、羥自由基、過氧化氫和單線態(tài)氧等[1].

活躍生長組織的質(zhì)外體專一產(chǎn)生的活性氧可使細胞壁松弛并可代替生長素誘導(dǎo)細胞生長[2]. 葉綠體和線粒體是ROS的主要來源[3]. 植物自身可維持ROS的動態(tài)平衡以避免遭受氧化脅迫[4]. 植物在其生長發(fā)育過程中，常會經(jīng)受各種脅迫，植物應(yīng)對所有這些脅迫的共同特征是產(chǎn)生所謂的活性氧[5-6]. 近年來，ROS特別是H2O2，被認為是重要的信號分子，參與調(diào)控一系列重要的植物生理生化過程.

植物激素生長素(Auxin)主要集中在植物幼嫩部位[7]，目前認為各種氧化脅迫影響植物生長發(fā)育的原因之一是改變植物體內(nèi)的生長素含量. 植物擁有精細的機制以控制局部生長素穩(wěn)態(tài)，包括控制生長素代謝，亞細胞區(qū)室化以及由漿膜駐留轉(zhuǎn)運蛋白介導(dǎo)的定向生長素轉(zhuǎn)運[8-12]. 植物體內(nèi)生長素在運輸過程中需要輸入和輸出蛋白完成，目前報道得較多的是生長素輸入蛋白AUX1[7]、生長素輸出蛋白PIN1和PIN2[13-14]，PIN蛋白由于其不對稱的亞細胞定位而直接限制極性生長素轉(zhuǎn)運[15-17]；生長素運輸?shù)较鄳?yīng)的部位后必須先和靶細胞中的受體結(jié)合，再由受體感知激素信號后，把激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)下去，最后引起基因表達，導(dǎo)致一系列的生理生化反應(yīng).

對于植物體內(nèi)H2O2與生長素的相互關(guān)系，傳統(tǒng)觀點認為生長素IAA能夠自發(fā)地被H2O2所降解. 后期在玉米的研究[18]中發(fā)現(xiàn)生長素能夠誘導(dǎo)活性氧(ROS)的產(chǎn)生，生長素和重力刺激后玉米根中H2O2含量升高. 近年的研究[19-20]發(fā)現(xiàn)氧化還原系統(tǒng)中的某些組分在調(diào)控生長素依賴的生物過程中具有主導(dǎo)地位，生長素誘導(dǎo)的反應(yīng)往往被氧化脅迫所加強. 另外，擬南芥MAPK激酶ANP1抑制生長素響應(yīng)的過程依賴于H2O2信號[21]，并且許多生長素響應(yīng)基因的表達隨著H2O2含量的提高而降低[22-23]，為H2O2和生長素信號之間的關(guān)系提供了初步的分子證據(jù).

目前對于H2O2是否是通過影響生長素的含量與運輸來調(diào)控生長素信號進而調(diào)控植物生長發(fā)育的研究還未見報道. 本論文主要利用模式植物擬南芥研究外源H2O2對生長素含量及運輸?shù)挠绊?，以期闡明H2O2調(diào)控生長素信號的具體作用機制.

1 材料與方法

1.1 植物材料

本實驗采用的5種擬南芥株系包括野生型(WT)、DR5-GUS、AUX1-GUS、PIN1-GUS、PIN2-GUS. 種子洗凈后，將其鋪于MS板上，4 ℃冰箱放置2 d后，轉(zhuǎn)移至植物培養(yǎng)室培養(yǎng).

1.2 過氧化氫處理

將培養(yǎng)好的各類擬南芥幼苗分別移植到含0.5 mmol/L H2O2(處理2)的MS培養(yǎng)基中去，每一培養(yǎng)基中移入15株幼苗；移植擬南芥至普通MS培養(yǎng)基中作為對照組(處理1). 對每株擬南芥的原始根長進行標記，放置光下垂直培養(yǎng)，觀察擬南芥根的生長情況. 培養(yǎng)5 d后，記下每株幼苗根的總伸長量及不定根的數(shù)目，計算經(jīng)H2O2處理之后每種擬南芥每株幼苗根的日平均伸長量和不定根的平均數(shù)目，3次生物學(xué)重復(fù).

1.3 GUS組織化學(xué)染色及觀察

配置GUS染色液，配方為：50 mmol/L磷酸緩沖液(pH為7.0)，1 mmol/LEDTA，0.1% Triton X-100，100 mg/L氯霉素，2 mmol/L鐵氰化鉀，2 mmol/L亞鐵氰化鉀，加入100 g/L X-Glue母液使其終質(zhì)量濃度為1 g/L. 取若干支1.5 mL離心管，做好標記，各加入適量的1 mol/L GUS染色液；用鑷子夾取各處理條件下培養(yǎng)的擬南芥幼苗若干株分別置于上述離心管中，37 ℃溫育3～4 h，期間搖動數(shù)次使材料均勻，(如果有GUS基因表達產(chǎn)物，則出現(xiàn)藍色，肉眼下可以觀察染色情況).

顯微觀察：將染好色的擬南芥在70%酒精下脫色；在玻片上滴加適量的透明液，將擬南芥的根泡在透明液中，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察，并分“深色、中間色、淺色、無色”4層次統(tǒng)計好每種擬南芥根的染色情況，并拍照(放大倍數(shù)為20倍). 實驗進行3次生物學(xué)重復(fù).

1.4 抗氧化物質(zhì)維生素C(Vc)和還原性谷胱甘肽(GSH)處理

將培養(yǎng)好的各類擬南芥幼苗分別移植到含1.25 mg/L Vc(處理3)、1.25 mg/L Vc+0.5 mmol/L H2O2(處理4)、1.25 mg/L GSH(處理5)、1.25 mg/L GSH+0.5 mmol/L H2O2(處理6)的MS培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，統(tǒng)計拍照，GUS染色及顯微觀察，實驗進行3次生物學(xué)重復(fù).

1.5 IAA處理

將培養(yǎng)好的各類擬南芥幼苗分別移植到含0.1 nmol/L IAA(處理7)、0.1 nmol/L IAA+0.5 mmol/L H2O2(處理8)、0.5 nmol/L IAA(處理9)、0.5 nmol/L IAA+0.5 mmol/L H2O2(處理10)、1.0 nmol/L(處理11)、1.0 nmol/L IAA+0.5 mmol/L H2O2(處理12)的MS培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，統(tǒng)計拍照，GUS染色及顯微觀察，3次生物學(xué)重復(fù).

2 結(jié)果與分析

2.1 H2O2抑制擬南芥根生長及生長素蛋白表達

經(jīng)0.5 mmol/L H2O2處理5 d后，各種擬南芥與對照組都表現(xiàn)出相似的氧化脅迫表型(圖1)：根的生長受到明顯的抑制，主根變短，不定根數(shù)目增多.

與對照組相比，H2O2處理后擬南芥根的生長速度明顯減慢(表1)，同時，H2O2處理會使各種擬南芥的根(包括主根、不定根)的總數(shù)目明顯增多，對照組的擬南芥根的數(shù)目約2條，但H2O2處理后擬南芥的平均根數(shù)達到4條以上.

1:對照;2:0.5 mmol/L H2O2處理.

基因型對照組0.5mmol/LH2O2處理組日平均伸長量/(mm·d-1)植株平均根數(shù)/條日平均伸長量/(mm·d-1)植株平均根數(shù)/條WT4.16±0.50a1.30±0.46a0.86±0.40b4.60±1.10cDR5-GUS4.22±0.76a1.20±0.40a1.04±0.31b4.90±1.30cAUX1-GUS3.80±0.64a2.50±0.67b0.80±0.41b5.50±1.20cPIN1-GUS4.46±0.90a2.40±0.49b0.64±0.28b4.40±1.11cPIN2-GUS4.12±0.75a2.00±0.77b0.82±0.38b4.50±1.75c

注：a、b、c等不同字母表示平均值之間具有顯著性差異(P<0.05).

為了探究H2O2處理后擬南芥根的生長受到的抑制作用是否是由生長素信號受到破壞而引起的，研究了生長素相關(guān)蛋白在H2O2處理后的表達情況. 選用生長素含量標記蛋白DR5、生長素運輸輸入蛋白AUX1、生長素運輸輸出蛋白PIN1和PIN2進行GUS染色. 經(jīng)過GUS染色后(圖2)，以上4種蛋白的GUS顯色均呈現(xiàn)出深色、中間色、淺色和無色等不同程度的顏色.

圖2 H2O2處理后各生長素相關(guān)蛋白GUS顯色圖

H2O2的處理后，蛋白GUS顯色中深色所占的比例下降，而且有無色情況的出現(xiàn)，即H2O2處理后，生長素含量標記蛋白DR5、生長素輸出蛋白AUX1、生長素輸出蛋白PIN1和PIN2的表達量都受到了抑制(表2)，從而使得生長素不能正常地起生理效應(yīng)，最終表現(xiàn)在表型上的變化.

綜上所述，H2O2對于各種擬南芥根的生長都表現(xiàn)出較明顯的抑制作用，并且根中生長素相關(guān)蛋白在H2O2處理后表達明顯下降. 所以，H2O2處理可能通過影響植物體內(nèi)生長素的合成和運輸來調(diào)控擬南芥根的生長.

表2 H2O2處理后各種擬南芥在GUS染色中顯色情況Table 2 Statistical data of the GUS staining results after H2O2 treatment %

2.2 外源抗氧化劑抑制H2O2的作用

H2O2是具有氧化性的物質(zhì)，理論上添加抗氧化物質(zhì)可以對H2O2起清除作用，從而減低對植物的危害. 為了研究外源抗氧化劑能夠恢復(fù)H2O2對植物生長的抑制作用，在H2O2處理的基礎(chǔ)上對植物進行了抗氧化劑維生素C(Vc)和還原型谷胱甘肽(GSH)的處理. 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1.25 mg/L Vc可以促進植物根的生長，表明外源Vc處理可部分恢復(fù)H2O2對擬南芥根的抑制(圖3).

同樣，添加1.25 mg/L GSH處理也可以在一定程度上恢復(fù)H2O2處理對擬南芥根生長的抑制作用 (圖4).

1：對照；2：0.5 mmol/L H2O2；3：1.25 mg/L Vc；4:1.25 mg/L Vc+0.5 mmol/L H2O2

1:對照；2: 0.5 mmol/L H2O2；5:1.25 mg/L GSH；6:1.25 mg/L GSH+0.5 mmol/L H2O2

對根的具體生長情況進行分析，發(fā)現(xiàn)與對照組比較，Vc和GSH處理后能夠增加H2O2處理擬南芥根的日伸長量，減少其不定根數(shù)(表3)，說明Vc或者GSH的添加可以緩解外源H2O2對擬南芥根的脅迫作用，使生長素的合成和運輸情況得到了一定的恢復(fù).

結(jié)果表明，外源抗氧化劑能夠在一定程度上恢復(fù)H2O2對根生長的抑制作用，因此進一步研究了外源抗氧化劑對生長素相關(guān)蛋白的表達影響. 在添加H2O2處理的基礎(chǔ)上，再添加GSH處理后，GUS蛋白均能著色，且深色的比例與H2O2處理相比大大增加. 在添加H2O2處理的基礎(chǔ)上，再添加GSH處理也出現(xiàn)類似結(jié)果(表4)，表明外源抗氧化劑由于還原性可對H2O2起一定的清除作用，從而降低其的抑制作用，使得擬南芥表型和各種生長素相關(guān)蛋白表達相對H2O2處理組均有所恢復(fù).

表3 Vc以及GSH處理后擬南芥根的生長情況Table 3 Statistical data of Arabidopsis thaliana roots growth after vitamin C or GSH treatment

注： a、b、c、d等不同字母表示平均值之間具有顯著性差異(P<0.05). 處理2～6：0.5 mmol/L H2O2;1.25 mg/L Vc；1.25 mg/L Vc+0.5 mmol/L H2O2；1.25 mg/L GSH；1.25 mg/L GSH+0.5 mmol/L H2O2(表4同).

表4 Vc以及GSH處理后GUS染色情況Table 4 Statistical data of the GUS staining results after vitamin C or GSH treatment %

2.3 IAA處理對H2O2作用的影響

從以上結(jié)果可知，外源H2O2主要是通過抑制生長素合成和運輸來調(diào)控植物根的生長發(fā)育，那么外源添加生長素能否起一定的恢復(fù)作用呢？因此，添加IAA來研究外源生長素IAA能否恢復(fù)H2O2處理后擬南芥根的生長及相關(guān)蛋白的表達.

選用了0.1、0.5、1.0 nmol/L的IAA進行實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外源IAA可對H2O2處理過的擬南芥根生長起到一定的恢復(fù)作用，且不同濃度起到的效果不同，其中0.1 nmol/L的IAA效果最為顯著(圖5).

另外，外源生長素可激發(fā)細胞分裂和根原基發(fā)生，促進了不定根的形，使擬南芥不定根的數(shù)目增加(表5).

1:對照；2:0.5 mmol/L H2O2；7:0.1 nmol/L IAA；8:0.1 nmol/L IAA +0.5 mmol/L H2O2；9:0.5 nmol/L IAA；10:0.5 nmol/L IAA+0.5 mmol/L H2O2；11:1.0 nmol/L IAA；12:1.0 nmol/L IAA+0.5 mmol/L H2O2

圖5 不同濃度IAA處理對擬南芥根生長的影響

注： a、b、c、d、e等不同字母表示平均值之間具有顯著性差異(P<0.05). 處理2:0.5 mmol/L H2O2；處理7～12：0.1 nmol/L IAA；0.1 nmol/L IAA +0.5 mmol/L H2O2；0.5 nmol/L IAA；0.5 nmol/L IAA + 0.5 mmol/L H2O2；1.0 nmol/L IAA；1.0 nmol/L IAA +0.5 mmol/L H2O2(表6同).

在H2O2處理的基礎(chǔ)上，再添加不同濃度IAA處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GUS蛋白染色顯深色比例上升，并且0.1 nmol/L的IAA的恢復(fù)作用最明顯(表6)，表明添加外源IAA能夠恢復(fù)生長素相關(guān)蛋白的表達.

表6 不同濃度IAA處理后GUS染色情況Table 6 Statistical data of A. thaliana roots growth cultured with different concentrations of IAA %

3 討論

激素從產(chǎn)生到發(fā)揮作用都有一個既復(fù)雜又完善的過程，生長素也不例外. 在生長素的極性運輸中，生長素只能從植物體形態(tài)學(xué)上端向下端運輸[15]，原因是攜帶生長素的載體蛋白位于細胞底部的細胞膜上，頂部則沒有，這就促使IAA分子(生長素分子)在薄壁組織中(或韌皮部中)順序穿過一個個細胞向植株下部運行，不斷從細胞底部由載體帶出再進入下一個細胞. 植物體內(nèi)的生長素經(jīng)過極性運輸?shù)竭_植物體各組織器官起作用的過程中需要各種載體蛋白[11]，包括生長素的輸入和輸出載體，目前發(fā)現(xiàn)的輸入載體是AUX1膜蛋白，輸出載體有PIN和PGP蛋白[18]. 在運輸過程中，存在于細胞壁空間的生長素通過擴散作用或輸入載體AUX1蛋白的協(xié)助作用，從細胞的頂端流入到胞質(zhì)溶膠；而存在胞質(zhì)溶膠的生長素又在細胞基部質(zhì)膜的輸出載體PIN和PGP蛋白的協(xié)助下進一步輸出細胞. 本論文以GUS蛋白作為標記，發(fā)現(xiàn)H2O2處理后各種擬南芥中GUS蛋白的顯色都相對變淺或是消失，表明輸入載體AUX1蛋白與輸出載體有PIN蛋白的含量均下降了，植物體內(nèi)生長素的運輸過程受到了抑制. 另外，標志生長素合成量的蛋白DR5的含量也明顯減少，表明外源H2O2處理還抑制了植物體內(nèi)生長素含量. 因此，外源H2O2主要通過抑制生長素的合成和運輸來抑制植物體內(nèi)的生長素信號，最終導(dǎo)致到達作用部位的生長素量較正常時的低，從而影響植物的生長發(fā)育.

外源抗氧化物質(zhì)清除H2O2的抑制作用主要是針對H2O2的氧化性來設(shè)計的，已有的研究結(jié)果已驗證了添加抗氧化劑確實能夠降低H2O2的氧化作用. 還原型谷胱甘肽和維生素C都具有還原性，其中還原性谷胱甘肽由于含有巰基(—SH)，巰基可與自由基結(jié)合，加速自由基的轉(zhuǎn)化，從而起到抗氧化作用；而維生素C的作用機制主要是利用本身的化學(xué)特性促使雙硫鍵(—S—S)還原為—SH，從而也有抗氧化作用. 所以添加這2種物質(zhì)可以對植物體內(nèi)的H2O2起一定的清除作用，抑制了H2O2對生長素信號的破壞作用，從而使得植物生長受到的影響相對減小. 對于這2種物質(zhì)起清除、解毒及細胞保護功能作用的內(nèi)在原因歸納為3種機制: (1)親核進攻——結(jié)合反應(yīng)；(2)抑制脂質(zhì)過氧化；(3)清除自由基. 在植物生理、生化過程中，還原性谷胱甘肽和維生素C兩者可以運用以上一種或多種機制來對抗有氧化性的物質(zhì)，從而保護細胞，維持植物的生長.

外源IAA能夠在不同程度上抑制外源H2O2對植物生長的抑制作用，主要是因為外源H2O2影響了植物體內(nèi)生長素的合成和運輸，使植物體內(nèi)的生長素含量和生長素信號不足以維持植物的生長發(fā)育，外源IAA則能夠彌補植物體內(nèi)生長素的缺陷，從而恢復(fù)植物的生長發(fā)育表型.

4 結(jié)語

外源H2O2對植物生長發(fā)育起調(diào)控作用主要是通過調(diào)控生長素相關(guān)蛋白的表達來起作用，經(jīng)過H2O2處理后，各生長素相關(guān)蛋白包括生長素含量標志蛋白DR5、生長素輸入蛋白AUX1、生長素輸出蛋白PIN1和PIN2的表達量都下降，這表明H2O2能抑制生長素的合成和運輸，這種抑制作用綜合表現(xiàn)在植物的表型和相關(guān)蛋白表達量的變化；外源抗氧化劑能夠抑制H2O2的作用，并且外源生長素能夠恢復(fù)H2O2處理后植物的生長發(fā)育. 但是H2O2影響植物生長素信號的深層分子機制，還有待進一步探究，如如何抑制各種生長素相關(guān)蛋白的表達？生長素響應(yīng)基因如何響應(yīng)H2O2信號？生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能否直接和H2O2信號發(fā)生相互作用調(diào)控植物的生長發(fā)育等等. 這些問題的解決可以為農(nóng)業(yè)、林業(yè)生產(chǎn)提供很好的理論依據(jù)和應(yīng)用基礎(chǔ).

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Effects of Hydrogen Peroxide on Auxin Signal Associated Proteins in Arabidopsis Thaliana

LIU Mengling，CHEN Yinhua，ZHANG Shengchun*

( Guangdong Provincial Key Lab of Biotechnology for Plant Development, School of Life Sciences, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

The effect of exogenous hydrogen peroxide on the auxin signal is studied. TheGUSwas used as the reporter gene to investigate the responses of auxin signaling proteins, including DR5 (a maker of auxin level), AUX1 (auxin input protein), PIN1 and PIN2 (auxin output proteins) to hydrogen peroxide. The results showed thatArabidopsisthalianasdisplayed smaller size, shorter root and increased adventitious root number after hydrogen peroxide treatment. The GUS staining results showed that the expression of auxin-related proteins decreased, and suggested that hydrogen peroxide can inhibit the auxin synthesis and transport. The effects of hydrogen peroxide on the phenotype and the expression of auxin-related proteins inA.thalianacan be restored by some antioxidants, as well as 0.1 nmol/L IAA. The results suggest that the hydrogen peroxide can regulate the plant growth and development by inhibiting the auxin signal.

2015-12-31 《華南師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)》網(wǎng)址：http://journal.scnu.edu.cn/n

廣東省自然科學(xué)基金項目(2014A030313443)；2011年廣東省教學(xué)團隊和2013國家級精品課程資源共享課程建設(shè)項目(植物生理學(xué))

*通訊作者:張盛春，副教授，Emali:sczhang@scnu.edu.cn.

Q945.3

A

1000-5463(2017)05-0064-08

【中文責(zé)編：成文 英文審校：李海航】