鎘對(duì)苯并(a)芘在蚯蚓亞細(xì)胞組分中分配積累的影響

周麗娜,周 靜,李輝信,胡 鋒,徐 莉

南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 南京 210000

鎘對(duì)苯并(a)芘在蚯蚓亞細(xì)胞組分中分配積累的影響

周麗娜,周 靜,李輝信,胡 鋒,徐 莉*

南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 南京 210000

通過(guò)外源添加不同濃度鎘離子(Cd2+)來(lái)研究復(fù)合污染條件下鎘(Cd)對(duì)苯并(a)芘(BaP)在蚯蚓體內(nèi)不同亞細(xì)胞組分(組分C：細(xì)胞溶質(zhì)組分；組分D：固體顆粒組分；組分E：細(xì)胞碎片組分)中的分配積累情況,并探究其內(nèi)在機(jī)制。結(jié)果表明,BaP主要分布于蚯蚓的細(xì)胞碎片組分,其次為固體顆粒組分,在細(xì)胞溶質(zhì)組分中的濃度最低。在Cd2+添加處理下,隨著Cd2+濃度的增加,3個(gè)細(xì)胞組分中的BaP濃度呈先降低后升高的趨勢(shì)。隨著Cd2+濃度的增加,3個(gè)亞細(xì)胞組分中的蛋白含量與乙酰膽堿酯酶(AChE)活性均呈先升高后下降的趨勢(shì)；而蚯蚓細(xì)胞溶質(zhì)和細(xì)胞碎片組分中的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)活性呈先下降后上升的趨勢(shì),但固體顆粒組分中逐漸增加。相關(guān)性分析表明,蚯蚓細(xì)胞溶質(zhì)和細(xì)胞碎片組分中的蛋白含量與其對(duì)應(yīng)組分中的BaP濃度呈顯著負(fù)相關(guān)；細(xì)胞溶質(zhì)組分中的AChE活性與該組分中的BaP濃度呈顯著負(fù)相關(guān)；而GST的活性與BaP濃度沒(méi)有顯著相關(guān)性。綜上所述,BaP主要分配積累在細(xì)胞碎片組分中,Cd2+可能通過(guò)影響蛋白含量及AChE的活性,從而影響B(tài)aP在細(xì)胞碎片和細(xì)胞溶質(zhì)組分中的積累,使得BaP的濃度隨著Cd2+濃度的增加呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)。

苯并(a)芘；鎘；赤子愛(ài)勝蚓(Eiseniafetida)；亞細(xì)胞組分；復(fù)合污染

重金屬和多環(huán)芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)是土壤環(huán)境中重要的兩類(lèi)污染物,它們往往同時(shí)存在形成復(fù)合污染[1]。這不僅嚴(yán)重?fù)p害土壤生態(tài)系統(tǒng),同時(shí)給人類(lèi)健康帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)[2- 3],因此,對(duì)復(fù)合條件下污染物的毒性測(cè)定及環(huán)境生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估十分必要[4]。

我國(guó)污染土壤普查表明[5]：重金屬鎘(Cd)被確定為中國(guó)土壤污染的首要污染物,在占中國(guó)國(guó)土三分之二的630萬(wàn)km2被調(diào)查的土地上,有7%的點(diǎn)位被測(cè)出鎘超標(biāo)。苯并(a)芘(BaP)具有細(xì)胞毒性、致突變性及致癌性,是多環(huán)芳烴中最受關(guān)注的污染物之一[6-9]。它們可以通過(guò)工業(yè)排放、化肥施用、污水灌溉、污泥農(nóng)用等途徑進(jìn)入農(nóng)田系統(tǒng),形成復(fù)合污染,這不僅對(duì)作物生長(zhǎng)和發(fā)育產(chǎn)生不良影響,而且會(huì)通過(guò)食物鏈對(duì)人和動(dòng)物健康構(gòu)成威脅,是目前環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一[10-11]。

蚯蚓是土壤中生物量最大的動(dòng)物類(lèi)群之一,它不僅在維持生態(tài)系統(tǒng)功能中起著不可替代的作用(如促進(jìn)土壤有機(jī)質(zhì)的分解、養(yǎng)分循環(huán)與釋放,改善土壤性狀等),而且也是土壤污染狀況的重要指示生物。多個(gè)國(guó)家和組織利用蚯蚓進(jìn)行污染物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià),特別是赤子愛(ài)勝蚓(Eiseniafetida),以其對(duì)污染物敏感性高、實(shí)驗(yàn)可操作性強(qiáng),而被經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織選作評(píng)估污染物毒性的模式動(dòng)物,并建立了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試流程[12]。

目前,國(guó)內(nèi)外的研究多專(zhuān)注于重金屬或多環(huán)芳烴單一或復(fù)合條件下對(duì)蚯蚓的生態(tài)毒性效應(yīng)。單一污染下,王慧[13]等報(bào)道了鎘暴露會(huì)對(duì)赤子愛(ài)勝蚓體內(nèi)的纖維素酶活性產(chǎn)生抑制作用,張薇等[14]研究表明苯并(a)芘可以誘導(dǎo)蚯蚓體內(nèi)細(xì)胞色素P450含量的增加,同時(shí)又抑制了超氧化物歧化酶(SOD)的活性；復(fù)合污染下,趙作媛[15]發(fā)現(xiàn)鎘和菲復(fù)合污染會(huì)對(duì)蚯蚓的毒性產(chǎn)生拮抗作用,且隨鎘濃度升高其降低菲毒性的程度降低,朱江[16]也報(bào)道了重金屬(Cd)和典型多環(huán)芳烴菲(Phe)復(fù)合污染對(duì)安德愛(ài)勝蚓(Eiseniaandrei)和白線蚓(Fridericiabulbosa)的毒性效應(yīng),發(fā)現(xiàn)污染物的組成以及濃度影響復(fù)合污染的交互作用類(lèi)型,表現(xiàn)出或拮抗或協(xié)同的毒性效應(yīng),生物體內(nèi)的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)活性變化可作為表征Cd-Phe復(fù)合污染的一項(xiàng)重要的參考指標(biāo)。

雖然毒性效應(yīng)的研究有了一定的積累,但至今對(duì)于不同類(lèi)型污染物復(fù)合條件下,污染物在蚯蚓體內(nèi)分配積累特征的研究為數(shù)不多。與此同時(shí),以往的毒性試驗(yàn)主要集中于研究污染物在蚯蚓個(gè)體水平上的分布特征,而忽視了基于蚯蚓亞細(xì)胞水平或分子水平上污染物的行為[17-19]。而污染物在蚯蚓體內(nèi)的行為特征,特別是污染物在亞細(xì)胞水平上的分布,更有助于揭示蚯蚓對(duì)污染物的固定和解毒策略,并且一些重要的生態(tài)毒理學(xué)資料必須從亞細(xì)胞水平上才能獲得[20-21]。本研究室前期基于土壤污染暴露環(huán)境下的研究表明,單一Phe污染下,赤子愛(ài)勝蚓的不同亞細(xì)胞組分中Phe的濃度存在差異,并通過(guò)Phe的濃度差異推斷Phe在蚯蚓體內(nèi)的分配過(guò)程[22],故對(duì)污染物在蚯蚓亞細(xì)胞水平上的積累分布的研究可以更好地評(píng)價(jià)污染物的毒性及闡明蚯蚓對(duì)污染物的固定和解毒機(jī)制。

一些研究表明,部分蚯蚓的生理生化指標(biāo)可以用于評(píng)價(jià)污染物積累分配特征。如蛋白的含量,污染物可以通過(guò)誘導(dǎo)蚯蚓體內(nèi)部分蛋白酶的表達(dá),促進(jìn)蛋白濃度的提高,從而提供與污染物的結(jié)合位點(diǎn),促進(jìn)污染物的積累[21]；乙酰膽堿酯酶(AChE)是生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的一種關(guān)鍵性酶, 該酶降解乙酰膽堿(ACh), 保證神經(jīng)信號(hào)在生物體內(nèi)的正常傳遞,它可能通過(guò)影響生物體的正常生理代謝過(guò)程,影響生物對(duì)污染物的轉(zhuǎn)化代謝[23-25]；谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)也被發(fā)現(xiàn)在生物體對(duì)外源污染物代謝解毒以及分配過(guò)程中起著重要的作用[26],如影響各細(xì)胞分室間對(duì)化學(xué)物質(zhì)的結(jié)合和運(yùn)輸功能[27],可以通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將污染物運(yùn)入液泡達(dá)到去毒作用等[28-30]。

綜上所述,本研究通過(guò)構(gòu)建復(fù)合污染條件,即在一定濃度BaP污染處理下,同時(shí)添加不同濃度的Cd2+,采用半靜態(tài)溶液培養(yǎng)7d,之后對(duì)蚯蚓亞細(xì)胞組分中BaP的積累分布特征進(jìn)行研究,同時(shí)測(cè)定蚯蚓各組分中的蛋白含量,乙酰膽堿酯酶以及谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的活性,通過(guò)研究以上生化指標(biāo)與BaP的相關(guān)性來(lái)嘗試揭示在復(fù)合污染下Cd對(duì)BaP在蚯蚓亞細(xì)胞組分中分配積累的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

赤子愛(ài)勝蚓(Eiseniafetida)購(gòu)自安徽蚯蚓養(yǎng)殖基地。選用大小及體重相近(300—500 mg),成熟且?guī)в协h(huán)帶的健康蚯蚓作為受體[12]。

苯并(a)芘為分析純,純度為98%,購(gòu)于百靈威科技有限公司。氯化鎘(CdCl2)為分析純,純度為99%,選自阿拉丁試劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)采用半靜態(tài)溶液培養(yǎng)方法進(jìn)行略加修改[31]。50 mg/L BaP模擬培養(yǎng)液配制如下：采用硝酸鈣(Ca(NO3)2)、硫酸鎂(MgSO4)、硝酸鈉(NaNO3)及硝酸鉀(KNO3)配制成 0.1 mmol/L Ca2+, 0.1 mmol/L Mg2+, 1.0 mmol/L Na+及0.1 mmol/L K+濃度的模擬液,BaP以丙酮溶解,溶于模擬液至終濃度為50 mg/L,丙酮體積終濃度為1‰。在此基礎(chǔ)上,設(shè)定4個(gè)處理,即添加不同濃度的CdCl2,使得Cd2+終濃度為0,0.2,0.5,0.8 mg/L,備用。

實(shí)驗(yàn)采用玻璃培養(yǎng)皿,每個(gè)培養(yǎng)皿中放入10條蚯蚓及20 mL污染物模擬水溶液并用封口膜封住,膜上扎上小口,防止蚯蚓逃逸且保證通氣,于(20±1) ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。每天挑除死亡蚯蚓,并更換培養(yǎng)液,第7天進(jìn)行采樣,用液氮?dú)⑺篮髢?chǔ)存于-70 ℃冰箱。每個(gè)處理設(shè)定4個(gè)重復(fù)。

1.3 亞細(xì)胞分組

本實(shí)驗(yàn)將蚯蚓分為3個(gè)亞細(xì)胞組分。具體過(guò)程如下：蚯蚓融化后放置于含有 5 mL 冰冷的 Tris-HCl (0.01 mol/L,pH=7.0) 緩沖液勻漿瓶中,在1500 r/min條件下勻漿 5 min (組織勻漿器 DY89- 2,寧波生物技術(shù)公司)。然后勻漿液在高速冷凍離心機(jī)中(Sigma 3K 30, Sigma 公司),分別在10000 r/min,4 ℃條件下離心30 min,收集上清(細(xì)胞溶質(zhì)部分)。得到的沉淀加入2 mL 氫氧化鈉(NaOH)溶液(1 mol/L)進(jìn)行充分消解,并繼續(xù)在高速冷凍離心機(jī)中,分別在10000 g,20 ℃條件下離心10 min,收集上清(細(xì)胞碎片部分)及沉淀(固體顆粒部分)。收集的3個(gè)組分冷凍后置于 ALPHA 1- 2 LD plus 冷凍干燥器中干燥。最后樣品儲(chǔ)存于 -70 ℃冰箱中,等待進(jìn)一步測(cè)定。

1.4 苯并(a)芘測(cè)定

苯并(a)芘的提取參考Contreras-Ramos等[32]的方法,并略加改動(dòng)。 蚯蚓經(jīng)過(guò)預(yù)處理后,固體組分稱(chēng)重后與3倍于其質(zhì)量的無(wú)水硫酸鈉(Na2SO4)混合后,置于研缽中磨成粉末。將粉末轉(zhuǎn)移到棕色玻璃離心管中(40 mL,安捷倫公司,美國(guó)),加入15 mL二氯甲烷作萃取劑,密封。將離心管置于加有冰水的超聲波清洗器中進(jìn)行超聲萃取1 h,然后在一個(gè)渦旋儀在渦旋 60 s,再次超聲1 h,提取液在3500 r/min條件下離心15 min,提取上清液。此過(guò)程重復(fù)2次。上清液合并后移取6 mL,并過(guò)加有3 g柱層層析硅膠的硅膠柱,用11 mL 1∶1 的二氯甲烷和正已烷溶液分兩次洗脫；洗脫液收集至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中,在 40 ℃ 水浴條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),濃縮至干。用2 mL甲醇進(jìn)行溶解定容,過(guò) 0.22 μm 有機(jī)濾膜后上機(jī)分析。

苯并(a)芘測(cè)定采用反相高效液相色譜(LC- 20AT, 日本 Shimadzu 公司) 測(cè)試, 并配有紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器(SPD- 20A),色譜柱為C18柱(Shim-pack VP-ODS, 250× 4.6 mm, 5 μm),保護(hù)柱為C18柱(Shim-pack GVP-ODS, 10× 4.6 mm, 5 μm)。色譜條件如下：流動(dòng)相為色譜純級(jí)甲醇,流動(dòng)相均為每次測(cè)樣前過(guò) 0.45 μm 濾膜并超聲脫氣；在流速 1.0 mL/min下實(shí)行等度洗脫；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；進(jìn)樣量 20 μL。根據(jù)出峰時(shí)間定性,根據(jù)峰面積由外標(biāo)法定量。檢測(cè)信號(hào)由HW- 2000 色譜工作站(南京千譜軟件有限公司)記錄并處理數(shù)據(jù)。

1.5 生化測(cè)定

蚯蚓不同亞細(xì)胞組分中,蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)比色法測(cè)定,通過(guò)測(cè)定595 nm波長(zhǎng)下的吸光度可計(jì)算出蛋白的含量；乙酰膽堿酯酶的活力采用TNB(對(duì)稱(chēng)三硝基苯, Sym-Trinitrobenzene)比色法測(cè)定,在412 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度,酶活性單位以每毫克組織蛋白在37 ℃保溫6分鐘,水解反應(yīng)體系中1 μmol基質(zhì)為1個(gè)活力單位,結(jié)果表示為U/mgprot；谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的活力采用分光光度計(jì)法,在412 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度,通過(guò)催化谷胱甘肽(GSH)與1-氯- 2, 4二硝基苯(CDNB)的結(jié)合來(lái)表征,酶活性單位以每毫克組織蛋白,在37 ℃反應(yīng)1min扣除非酶促反應(yīng),使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 μmol/L為1個(gè)酶活力單位。以上測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 20.0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,用單因素方差分析法(one-way ANOVA)中的Duncan法進(jìn)行不同濃度Cd2+處理樣本間的差異顯著性分析(P< 0.05),采用Pearson相關(guān)性來(lái)分析生化測(cè)定結(jié)果與對(duì)應(yīng)BaP含量的相關(guān)性(P< 0.05),均采用OriginPro 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 鎘對(duì)蚯蚓體內(nèi)苯并(a)芘分配積累的影響

由圖1可得,與空白相比,添加Cd2+的處理下,蚯蚓體內(nèi)的BaP的積累量均顯著降低。且隨著Cd2+濃度的升高,蚯蚓體內(nèi)BaP的濃度呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì),并在0.5 mg/L Cd2+處理中,BaP的濃度達(dá)到最小值。

比較蚯蚓不同亞細(xì)胞組分對(duì)BaP的積累(圖1)可得,相同處理下,BaP主要集中積累于蚯蚓的細(xì)胞碎片組分內(nèi),其次為固體顆粒組分,在細(xì)胞溶質(zhì)組分中的積累量最低。不同濃度Cd2+的添加能夠抑制BaP在細(xì)胞碎片和固體顆粒物中的積累,并在0.5 mg/L Cd2+處理中達(dá)到最小值,但是0.8 mg/L Cd2+處理促進(jìn)了細(xì)胞溶質(zhì)組分中BaP的積累。

圖1 不同濃度Cd2+對(duì)蚯蚓體內(nèi)苯并(a)芘分配積累的影響Fig.1 Effcet of different concentration of Cd2+ on the distribution and accumulation of BaP in the earthworm a. 代表個(gè)體總量，b. 代表不同亞細(xì)胞組分分布

2.2 鎘對(duì)蚯蚓體內(nèi)蛋白含量的影響

由圖2可得,蚯蚓體內(nèi)的總蛋白含量隨著Cd2+濃度的增加呈先上升后下降的趨勢(shì),在0.5 mg/L Cd2+處理下蛋白含量顯著增加。

比較蚯蚓各亞細(xì)胞組分中的蛋白含量(圖2)可知,相同處理下,細(xì)胞碎片組分中的蛋白含量最高,其次為細(xì)胞溶質(zhì)組分,固體顆粒組分中最少。在添加Cd2+的處理下,各組分中的蛋白含量均呈先上升后下降的趨勢(shì),在0.5 mg/L Cd2+處理中顯著增加至最大值,隨后在0.8 mg/L Cd2+處理中又出現(xiàn)不同程度的降低。

圖2 不同濃度Cd2+對(duì)蚯蚓體內(nèi)蛋白濃度的影響Fig.2 Effcet of different concentration of Cd2+ on the concentration of protein in the earthworm

2.3 鎘對(duì)蚯蚓體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活力的影響

由圖3可知,蚯蚓體內(nèi)總乙酰膽堿酯酶活力呈先上升后下降的趨勢(shì),在0.5 mg/L Cd2+處理下顯著增加,達(dá)到最大值,隨后在0.8 mg/L Cd2+處理下顯著降低,達(dá)到最小值。

比較各亞細(xì)胞組分中的乙酰膽堿酯酶活力(圖3)可得,相同處理下,細(xì)胞碎片組分中的乙酰膽堿酯酶活力最高,其次為細(xì)胞溶質(zhì)和固體顆粒組分。在添加Cd2+的處理下,細(xì)胞溶質(zhì)組分中乙酰膽堿酯酶的活力隨著Cd2+濃度的增加呈逐漸降低的趨勢(shì)；而細(xì)胞碎片和固體顆粒組分中乙酰膽堿酯酶的活力呈先上升后下降的趨勢(shì),均在0.5mg/L Cd2+處理下達(dá)到最大值,隨后在0.8 mg/L Cd2+處理下又有所降低。

圖3 不同濃度Cd2+對(duì)蚯蚓體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活力的影響Fig.3 Effcet of different concentration of Cd2+ on the activity of AChE in the earthworm

2.4 鎘對(duì)蚯蚓體內(nèi)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活力的影響

由圖4可知,蚯蚓體內(nèi)總谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活力隨著Cd2+濃度的增加呈先降低后升高的趨勢(shì),在0.5 mg/L Cd2+處理下達(dá)到最小值,隨后在0.8 mg/L Cd2+處理下顯著增加達(dá)到最大值。

比較各亞細(xì)胞組分中的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活力(圖4)可知,細(xì)胞溶質(zhì)與細(xì)胞碎片組分中中谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活力總體相近,而在固體顆粒組分中較低。Cd2+能增加細(xì)胞溶質(zhì)及固體顆粒組分中谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的活性,而抑制細(xì)胞碎片中谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的活性。在添加Cd2+的處理下,細(xì)胞溶質(zhì)和細(xì)胞碎片組分中的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性都呈先下降后上升的趨勢(shì),并在0.5 mg/L Cd2+處理下達(dá)到最小值,隨后又在0.8 mg/L Cd2+處理下顯著增加,而固體顆粒組分中谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性隨著Cd2+濃度的增加在0.8 mg/L Cd2+處理下顯著增加。

圖4 不同濃度Cd2+對(duì)蚯蚓體內(nèi)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活力的影響Fig.4 Effcet of different concentration of Cd2+ on the activity of GST in the earthworm

2.5 相關(guān)性分析

通過(guò)相關(guān)性分析可得,不同濃度Cd2+添加處理下,細(xì)胞溶質(zhì)組分中的蛋白濃度及乙酰膽堿酯酶活力與細(xì)胞溶質(zhì)組分中的BaP積累量呈顯著負(fù)相關(guān)；細(xì)胞碎片組分中的蛋白濃度與細(xì)胞碎片組分中的BaP積累量呈顯著負(fù)相關(guān)(表1)。

表1 不同亞細(xì)胞組分中酶活指標(biāo)與苯并(a)芘濃度之間的相關(guān)性分析

AChE: acetylcholinesterase ;GST: glutathione s-transfer;*表示在 0.05 水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)

3 討論

本研究結(jié)果顯示,不同濃度Cd2+對(duì)BaP的積累有不同程度的抑制作用,蚯蚓體內(nèi)的總BaP濃度在0.5 mg/L Cd2+處理組時(shí)達(dá)到最小值,隨后又有所回升,但均小于不添加Cd2+的處理,且BaP主要集中積累在細(xì)胞碎片組分中,其次為固體顆粒組分,在細(xì)胞溶質(zhì)組分中的積累量最少。這與段曉塵[33]的研究結(jié)果一致,這可能是因?yàn)榧?xì)胞碎片組分中含有細(xì)胞膜等物質(zhì),具有較強(qiáng)的親脂性,易與疏水性的化學(xué)物質(zhì)相結(jié)合,而B(niǎo)aP是一種疏水性有機(jī)污染物,從而B(niǎo)aP在細(xì)胞碎片組分中的積累量增加[22,34]。

BaP處理下,蚯蚓3個(gè)亞細(xì)胞組分中的蛋白濃度均隨外加鎘離子濃度的增加呈先增加后減少的趨勢(shì)。由相關(guān)性分析可得,細(xì)胞溶質(zhì)與細(xì)胞碎片組分中BaP濃度與蛋白濃度呈顯著負(fù)相關(guān),這可能是因?yàn)殡S著Cd2+濃度的增加,促進(jìn)了生物體內(nèi)與金屬解毒、貯藏和體內(nèi)平衡作用有關(guān)的蛋白的合成,例如金屬硫蛋白(Metallothionein, MT)[35-36],多個(gè)研究表明,鎘暴露可以促進(jìn)金屬硫蛋白基因的表達(dá)[33],并通過(guò)金屬硫蛋白對(duì)鎘的吸附,促進(jìn)鎘進(jìn)入蚯蚓體內(nèi)并增加積累[37]。此外,Mosleh等[38]研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)污染物-除草劑異丙隆的暴露也可以促進(jìn)水生顫蚓(Tubifextubifex)中金屬硫蛋白含量的增加。而金屬硫蛋白對(duì)重金屬的高度親和性導(dǎo)致BaP與蛋白的結(jié)合受到Cd2+的競(jìng)爭(zhēng)抑制作用,從而降低了BaP在蚯蚓體內(nèi)的積累量；反之,在高濃度Cd2+濃度下,蚯蚓蛋白表達(dá)受到抑制,從而降低鎘在蚯蚓體內(nèi)的積累,減弱了相互的競(jìng)爭(zhēng),促進(jìn)了BaP在蚯蚓體內(nèi)的積累。

復(fù)合污染下,隨著Cd2+濃度的增加,3個(gè)亞細(xì)胞組分中的乙酰膽堿酯酶活力隨著Cd2+濃度的增加呈先增加后降低的趨勢(shì),同時(shí),高歡歡[39]在Cd脅迫下研究麥長(zhǎng)管蚜體內(nèi)乙酰膽堿酯酶基因表達(dá),以及趙詔[23]在Cd暴露下研究家蠶體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活力變化,均獲得了類(lèi)似的結(jié)果,即鎘對(duì)乙酰膽堿酯酶活力的影響呈低濃度刺激,高濃度抑制的現(xiàn)象。低濃度Cd2+處理下生物體會(huì)表現(xiàn)出毒物興奮效應(yīng),促進(jìn)AChE的表達(dá),會(huì)對(duì)生物體的正常代謝有促進(jìn)作用,反之,高濃度Cd2+處理下會(huì)表現(xiàn)出毒物抑制效應(yīng),抑制了AChE的活性,對(duì)生物體正常的生理代謝過(guò)程產(chǎn)生抑制作用[23,40-41],同時(shí),生物體中生理生化過(guò)程的改變會(huì)影響污染物的代謝轉(zhuǎn)化。本研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞溶質(zhì)組分中的BaP濃度與乙酰膽堿酯酶活力呈顯著負(fù)相關(guān),這可能就是因?yàn)榈蜐舛菴d2+誘導(dǎo)了AChE的表達(dá),促進(jìn)蚯蚓對(duì)BaP的代謝解毒作用,從而導(dǎo)致了BaP濃度的降低,而高濃度Cd2+抑制了AChE的表達(dá),減弱了蚯蚓對(duì)BaP的代謝解毒作用,故BaP濃度呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶在生物體解毒外源污染物過(guò)程中起著重要的作用。谷胱甘肽在分子抗氧化機(jī)理中起著關(guān)鍵作用,它可以通過(guò)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶作用與異生物質(zhì)結(jié)合,生成親水的谷朧甘膚衍生物,通過(guò)排泄的方式排出體外,具有降低化學(xué)反應(yīng)活性的效應(yīng)[42-43]。但由本試驗(yàn)可得,蚯蚓體內(nèi)各組分中BaP的濃度與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活力之間雖然沒(méi)有顯著相關(guān)性,但是隨著Cd2+濃度的增加,谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的活力呈先下降,隨后又上升的趨勢(shì),這與Lei等[44]的研究一致,谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶能夠參與外源污染物的代謝,隨著污染暴露時(shí)間以及濃度存在先抑制后恢復(fù)的過(guò)程。

4 結(jié)論

綜上所述,Cd2+顯著抑制了BaP在蚯蚓體內(nèi)的總積累量,BaP主要集中積累在細(xì)胞碎片組分中,其次為固體顆粒組分,在細(xì)胞溶質(zhì)組分中的積累量最少。Cd2+的加入可以抑制BaP在細(xì)胞碎片和固體顆粒組分中BaP的積累,但高濃度的Cd2+促進(jìn)了細(xì)胞溶質(zhì)組分中BaP的積累。Cd2+可能通過(guò)誘導(dǎo)乙酰膽堿酯酶的表達(dá),促進(jìn)了機(jī)體對(duì)外源污染物的防御能力及代謝作用,從而減弱BaP的積累。

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EffectsofcadmiumonthedistributionandaccumulationofbenzoapyreneinsubcellularfractionsofEiseniafetida

ZHOU Lina, ZHOU Jing, LI Huixin, HU Feng, XU Li*

NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210000,China

This experiment explored the mechanism underlying benzo[a]pyrene (BaP) distribution in different subcellular fractions of the earthwormEiseniafetida(Fraction C: associated with the cytosol; Fractions D: associated with granules; and Fraction E: associated with tissue fragments and cell membranes) under conditions of contamination with both BaP and cadmium ions (Cd2+) at different concentrations. The results showed that Cd2+inhibited the accumulation of BaP in the earthworm, and that BaP was accumulated to the greatest extent in Fraction E, followed by Fraction C and Fraction D. With the addition of Cd2+, BaP concentrations in the three fractions initially decreased, but subsequently increased with the increasing concentration of Cd2+, whereas protein content and acetylcholinesterase (AChE) activity showed the opposite trend. In contrast, glutathione s-transferase (GST) activity initially decreased and then subsequently increased with increasing Cd2+concentration in Fraction C and E, whereas the activity gradually increased in Fraction D. Correlation analysis indicated that protein content showed a significant negative correlation with BaP concentration in Fraction C and E; AChE activity showed a significant negative correlation with BaP concentration in Fraction C; and GST activity showed a non-significant correlation with BaP concentration. Collectively, the results indicate that BaP mainly accumulated in Fraction E, and that the accumulation of BaP in Fraction C and E was correlated with the content of protein and activity of AChE, which was influenced by Cd2+. Furthermore, BaP concentration initially decreased, but subsequently increased, with the increasing concentration of Cd2+.

benzo[a]pyrene; cadmium;Eiseniafetida; subcellular fraction; combined pollution

國(guó)家自然科學(xué)基金(41371469);公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)(201503121);江蘇省優(yōu)勢(shì)學(xué)科項(xiàng)目資助

2016- 07- 07; < class="emphasis_bold">網(wǎng)絡(luò)出版日期

日期:2017- 05- 27

*通訊作者Corresponding author.E-mail: xuli602@njau.edu.cn

10.5846/stxb201607071390

周麗娜,周靜,李輝信,胡鋒,徐莉.鎘對(duì)苯并(a)芘在蚯蚓亞細(xì)胞組分中分配積累的影響.生態(tài)學(xué)報(bào),2017,37(19):6616- 6623.

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