古小莉,李永賢,李惠青,陳潔文,李劉冬
(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510300)
創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體的制備及其特性分析
古小莉,李永賢,李惠青,陳潔文,李劉冬*
(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州510300)
[目的]制備創(chuàng)傷弧菌特異性抗體,為建立免疫學(xué)快速檢測創(chuàng)傷弧菌提供參考依據(jù)。[方法]以創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白作為抗原,將抗原分多次免疫新西蘭大白兔獲得特異性多克隆抗體,采用蛋白G親和層析法純化多克隆抗體,通過間接ELISA和WesternBlot測定創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體的效價(jià)、敏感性和特異性。[結(jié)果]實(shí)驗(yàn)獲得了純度較高的創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體,效價(jià)為1∶64000;抗體對創(chuàng)傷弧菌具有高的特異性,它與多株致病菌均無明顯交叉反應(yīng),其對創(chuàng)傷弧菌檢測靈敏度為103CFU/mL;WesternBlot分析表明,制備的多克隆抗體能識(shí)別創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白,創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白具較強(qiáng)的抗原性。[結(jié)論]創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體具有較高特異性和靈敏性,可應(yīng)用于創(chuàng)傷弧菌的快速、靈敏的免疫學(xué)檢測。[中國漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn),2017,7(5):45-50]
創(chuàng)傷弧菌;外膜蛋白;多克隆抗體;WesternBlot;ELISA
創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌,其廣泛存在于河口、海洋環(huán)境和海產(chǎn)品中,是危害許多海水養(yǎng)殖動(dòng)物的主要病原菌之一,同時(shí)也能夠使人類致病,引起胃腸炎、傷口感染和原發(fā)性敗血癥[1-2]。鑒于創(chuàng)傷弧菌致病的危害性,建立特異、靈敏的檢測方法尤為迫切。目前,創(chuàng)傷弧菌快速檢測方法主要有免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法[3-4],其中免疫學(xué)方法以具有特異性強(qiáng)、敏感性高、檢測時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)受到眾多研究者的青睞[5-6]。研制創(chuàng)傷弧菌高特異性的抗體,是建立免疫學(xué)快速檢測創(chuàng)傷弧菌的重要基礎(chǔ)。
革蘭氏陰性細(xì)菌表面的外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)與細(xì)菌的致病性及免疫保護(hù)性密切相關(guān),外膜蛋白在細(xì)菌表面存在裸露的抗原表位,具有較強(qiáng)免疫原性,能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體及某些細(xì)胞因子[7-9]。目前,國內(nèi)外關(guān)于創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白的研究主要集中在抗原性和免疫刺激復(fù)合物分析[10-12],但以創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白作抗原制備特異抗體的研究較少。李素一等[13]在創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白OmpU的免疫原性研究中,制備的創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白OmpU多克隆抗體驗(yàn)證可以識(shí)別創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白OmpU,但未對抗體的特性作進(jìn)一步的研究。為深入了解創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白抗體的特性,本研究以創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白作為抗原制備多克隆抗體,探討抗創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體的特異性,以期為建立創(chuàng)傷弧菌的快速、靈敏的免疫學(xué)檢測方法提供參考依據(jù)。
1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株
實(shí)驗(yàn)菌株均購自廣東省食品微生物安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心,菌株列表見表1。
表1 菌株列表Tab.1 Strains list
1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
純系新西蘭大白兔購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
1.1.3 主要試劑
弗氏(完全/不完全)佐劑、Tris-HCl、甘氨酸、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購自武漢博士德生物工程有限公司;SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自廣州杰偉特生物科技有限公司;堿性蛋白胨水購自廣州環(huán)凱生物科技有限公司;蛋白G親和層析柱(HiTrap Protein G HP)購自美國GE Healthcare公司;TBST及PMSF購自上海生工生物工程有限公司。
1.2.1 多克隆抗體的制備
1.2.1.1 抗原(外膜蛋白)的制備
參照改進(jìn)的PMSF法[11],將創(chuàng)傷弧菌接種于3% NaCl堿性蛋白胨水,37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)的創(chuàng)傷弧菌菌液于100 ℃水浴滅活5 min,取200 mL于離心管中,4 ℃ 7 043 g離心20 min,棄上清液,收集沉淀。將收集的菌體沉淀加PMSF反復(fù)凍融并進(jìn)行超聲破碎6 min(功率200 W,工作30 s,間隔5 s),將裂解后的菌液4 ℃ 13 805 g離心20 min,收集上清液,并將上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳[14],用Bio-Rad公司Quantity One 4.62軟件計(jì)算分子量。
1.2.1.2 多克隆抗體的制備
將制備的創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白200 μL(蛋白濃度約2.5 mg/mL)與弗氏佐劑1∶1(V/V)混合,振蕩混勻,采用多點(diǎn)(頸部、腳掌和腹股溝)皮下注射免疫新西蘭大白兔,進(jìn)行三次免疫,首次免疫20 d,二次免疫10 d,三次免疫10 d(首次免疫使用弗氏完全佐劑,加強(qiáng)免疫使用弗氏不完全佐劑)。免疫結(jié)束,取免疫新西蘭大白兔血清,將血清于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.1.3多克隆抗體的純化
參照《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊》親和層析法[15],用蛋白G親和層析柱HiTrap Protein G HP純化抗血清,以pH 3.0的0.1 mol/L 甘氨酸-HCl緩沖液洗脫,收集的洗脫液為純化的多克隆抗體,將純化后的抗體進(jìn)行SDS-PAGE電泳。
1.2.2 多克隆抗體特性分析
1.2.2.1 多克隆抗體的效價(jià)測定
采用間接ELISA法[16]測定創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體(免疫血清)效價(jià),酶標(biāo)儀設(shè)定波長為492 nm。
1.2.2.2 敏感性試驗(yàn)
將108CFU/mL創(chuàng)傷弧菌菌懸液,進(jìn)行10倍梯度遞減稀釋至102CFU/mL,將待測血清及陰性血清按1∶4 000稀釋,羊抗兔IgG以1∶1 000稀釋,通過間接ELISA法確定最小抗原檢測濃度。以所產(chǎn)生的P/N值大小作為判斷標(biāo)準(zhǔn),當(dāng)P/N值≥2.1判定為陽性[17]。P/N值=(陽性對照OD492值-空白對照OD492值)/(陰性對照OD492值-空白對照OD492值)。
1.2.2.3 交叉試驗(yàn)
將濃度為107CFU/mL的創(chuàng)傷弧菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌O157、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌于37 ℃水浴包被酶標(biāo)板,陰性血清和陽性血清均采用1∶4 000的稀釋度進(jìn)行間接ELISA檢測,確定交叉反應(yīng)情況。
1.2.2.4 免疫印跡試驗(yàn)(Western Blot)
參照文獻(xiàn)[18],將創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌O157、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌進(jìn)行SDS-PAGE電泳后,取出凝膠,漂洗數(shù)秒,將PVDF膜和濾紙置于轉(zhuǎn)移緩沖液(0.025 mol/L Tris; 0.192 5 mol/L Gly; 20%甲醇)中濕潤5~ 10 min。按照陰極-海綿-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-海綿-陽極的順序安放好三明治的轉(zhuǎn)運(yùn)槽。冰浴轉(zhuǎn)膜250 mA,1 h。轉(zhuǎn)移后的PVDF膜用5%脫脂牛奶37 °C封閉緩慢振蕩2 h;加入1∶1 500稀釋的純化后的多克隆抗體后在37 °C搖床上孵育1 h,TBST漂洗(4次,每次10 min),以正常兔血清作為陰性對照;加入用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶8 000倍稀釋),37 °C緩慢振蕩1 h,室溫TBST漂洗(4次,每次10 min),最后用HRP-ECL發(fā)光法觀察結(jié)果。
創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白SDS-PAGE分析結(jié)果(圖1)可見,創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白主要集中在15~130 kD分子量范圍內(nèi),共可發(fā)現(xiàn)大約有20條蛋白條帶,其中主要條帶有11條,分子量分別約為112、 84、 77、 72、 60、 56、 50、 46、 42、 36和20 kD,其中56、 36和20 kD條帶最清晰,蛋白濃度高。
經(jīng)Protein G親和層析純化后的抗體SDS-PAGE顯示(圖2),抗體經(jīng)純化后得到兩個(gè)蛋白條帶,一條55 kD左右的重鏈,一條28 kD左右的輕鏈,無多余條帶,表明純化后的抗體純度較高。
圖1 創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE of outer membrane proteins of Vibrio vulnificus
圖2 純化創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體SDS-PAGE圖譜1:分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白;2:純化創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體。Fig.2 SDS-PAGE image of purified polyclonal antibody against outer membrane proteins of Vibrio vulnificus1:Marker; 2:Purified polyclonal antibody against outer membrane proteins of Vibrio vulnificus.
用間接ELISA法檢測創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體效價(jià),結(jié)果顯示多克隆抗體效價(jià)為1∶64 000(圖3),制備的創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體獲得了較高的效價(jià)。
圖3 創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體效價(jià)曲線Fig.3 Titer curve of polyclonal antibody against outer membrane proteins of Vibrio vulnificus
用不同濃度的創(chuàng)傷弧菌液(108、 107、 106、 105、 104、 103和102CFU/mL)為抗原,進(jìn)行間接ELISA測定,結(jié)果見表2。由表2可知,當(dāng)菌液濃度為103CFU/mL時(shí),P/N值為2.15,即為陽性反應(yīng),該抗體可檢測最低菌液濃度為103CFU/mL。
通過間接ELISA測定,抗體與創(chuàng)傷弧菌反應(yīng)呈強(qiáng)陽性,與溶藻弧菌和副溶血性弧菌有微弱的交叉反應(yīng),與鼠傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌O157、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌等水產(chǎn)動(dòng)物中常見的病原菌均無交叉反應(yīng)(表3)。
用制備的創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體與創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白及幾種試驗(yàn)菌株的Western Blot見圖4。Western Blot結(jié)果可見,創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白、溶藻弧菌和副溶血性弧菌出現(xiàn)了不同程度的免疫反應(yīng)帶;創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白共有7條明顯的免疫反應(yīng)帶,分子量分別約為72、 60、 50、 36、 35、 34和20 kD;溶藻弧菌和副溶血性弧菌的免疫反應(yīng)帶均較弱,溶藻弧菌有2條反應(yīng)帶,副溶血性弧菌有1條反應(yīng)帶;在分子量約為36 kD處,創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白、溶藻弧菌和副溶血性弧菌均有一條免疫反應(yīng)帶;鼠傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌O157、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和金黃色葡萄球菌均無反應(yīng)帶出現(xiàn)。
表2 多克隆抗體敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 The result of sensitivity assay of polyclonal antibody
注:“-”為陰性(P/N<2.1),“+”為陽性(P/N≥2.1)。
表3 多克隆抗體交叉實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 The result of cross reaction assay of polyclonal antibody
注:“-”~“++++”表示反應(yīng)強(qiáng)度依次增加的5種程度,其中P/N<2.1為“-”,2.1≤P/N<6.1為“+”,6.1≤P/N<10.1為“++”,10.1≤P/N<14.1為 “+++”,P/N>14.1為“++++”。
圖4 Western Blot分析創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體特性1:分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白;2:創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白;3:溶藻弧菌;4:副溶血性弧菌;5:鼠傷寒沙門氏菌;6:大腸埃希氏菌O157; 7:單核細(xì)胞增生李斯特氏菌;8:金黃色葡萄球菌;9:陰性對照。Fig.4 Western Blot analysis on the character of polyclonal antibody against outer membrane proteins of Vibrio vulnificus 1:Marker;2:Outer membrane proteins of Vibrio vulnificus;3:Vibrio alginolyticus;4:Vibrio parahaemolyticus;5:Salmonella typhimurium;6:E.coli O157;7:Listeria monocytogenes;8:Staphylococcus aureus;9:Negative serum.
創(chuàng)傷弧菌的外膜蛋白與細(xì)菌致病性及免疫保護(hù)性密切相關(guān),在決定宿主免疫反應(yīng)的特異上起著重要作用[11,19-21]。有研究報(bào)道創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白有較強(qiáng)的抗原性[11,20],本研究將創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白作為抗原免疫新西蘭大白兔,制備了創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體。
SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白條帶比較密集,其主要蛋白條帶清晰,分布在15~130 kD之間,與田丁等[11]報(bào)道的創(chuàng)傷弧菌主要外膜蛋白帶在14~92 kD之間的結(jié)果不完全一致,只有84、 60和36 kD的蛋白為共同條帶。有研究[22-24]認(rèn)為同種細(xì)菌外膜蛋白的差別可能與細(xì)菌的培養(yǎng)條件、外膜蛋白的制備方法、菌株的致病性和血清型不同有關(guān)。值得注意的是,創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白主要條帶中的36 kD蛋白,已有許多研究證實(shí)其為弧菌外膜蛋白先共有成分[23-26]。
抗體交叉反應(yīng)發(fā)現(xiàn),創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體與創(chuàng)傷弧菌呈現(xiàn)強(qiáng)的陽性反應(yīng),與溶藻弧菌和副溶血性弧菌存在較弱的交叉反應(yīng),與其他試驗(yàn)菌株無交叉反應(yīng),可見試驗(yàn)制備的創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體與創(chuàng)傷弧菌具有較高的特異性。使用該多抗檢測創(chuàng)傷弧菌時(shí),為避免出現(xiàn)假陽性,可對樣品進(jìn)行增菌(增加樣品外膜蛋白豐度)再進(jìn)行檢測。
Western Blot分析顯示,創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體與創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白中的7條蛋白發(fā)生不等程度的反應(yīng),可見制備的多克隆抗體不僅能夠識(shí)別創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白與其發(fā)生免疫反應(yīng),同時(shí)說明創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白具有較強(qiáng)的抗原性。Western Blot結(jié)果中36 kD位置處創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白、溶藻弧菌和副溶血性弧菌都出現(xiàn)了較弱的反應(yīng)帶,交叉試驗(yàn)中同樣具有36 kD外膜蛋白的溶藻弧菌和副溶血性弧菌[23,26]亦與多克隆抗體發(fā)生較弱的交叉反應(yīng),由此可推測出,雖然創(chuàng)傷弧菌36 kD外膜蛋白發(fā)生免疫反應(yīng),但反應(yīng)較弱,不具有強(qiáng)抗原性。其他試驗(yàn)菌株均無免疫反應(yīng)帶,同時(shí)結(jié)合交叉反應(yīng)結(jié)果,表明了研究制備的多克隆抗體具有較高的特異性。此外,創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體與溶藻弧菌、副溶血性弧菌發(fā)生的弱交叉反應(yīng),說明創(chuàng)傷弧菌與溶藻弧菌、副溶血性弧菌之間可能存在相同的抗原決定簇。如何將產(chǎn)生相同的抗原的外膜蛋白分離出以提高抗體特異性,有待進(jìn)一步的研究。
本研究制備的創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體,抗體純度較高,效價(jià)達(dá)1∶64 000,其與水產(chǎn)品中常見的致病菌無明顯的交叉反應(yīng),具有較高的特異性和靈敏性,制備相對容易,可為創(chuàng)傷弧菌快速檢測等應(yīng)用提供參考依據(jù)。
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PreparationandcharacterizationofpolyclonalantibodyagainstoutermembraneproteinsofVibriovulnificus
GU Xiaoli, LI Yongxian, LI Huiqing, CHEN Jiewen, LI Liudong*
(South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China;Key Laboratory of Aquatic Product Processing, Ministry of Agriculture; Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment forAquatic Product on Storage and Preservation, Ministry of Agriculture)
[Objective] This study aimed to prepare high specific antibody againstVibriovulnificus, and provide references for rapidly screeningVibriovulnificusby immunological method. [Methods] The polyclonal antibody was obtained by injecting the antigen, which was the outer membrane proteins ofVibriovulnificus, to New Zealand rabbits in several times with increasing dose, and purified by protein G affinity chromatography. Indirect ELISA and Western Blot assay were conducted to characterize the titer, sensitivity and specificity of polyclonal antibody. [Results]The polyclonal antibody prepared had high purity, which titer was 1∶64 000. Moreover, the antibody had high specificity forVibriovulnificus. It was no obvious cross reaction with other multiple pathogenic bacteria. The minimum threshold detection limit was 103CFU/mL in pure culture ofVibriovulnificus. Western Blot result showed that the polyclonal antibody could specially identify the outer membrane proteins ofVibriovulnificusand the outer membrane proteins should have good antigenicity. [Conclusion]The polyclonal antibody against outer membrane proteins ofVibriovulnificuswas high specificity and sensitivity, which could be used to rapidly screenVibriovulnificus.[Chinese Fishery Quality and Standards, 2017, 7(5):45-50]
Vibriovulnificus; outer membrane protein; polyclonal antibody; Western Blot; ELISA
LI Liudong,168lld@163.com
10.3969/j.issn.2095-1833.2017.05.007
S91
A
2095-1833(2017)05-0045-06
2017-04-14;接收日期2017-07-10
中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助(2015TS18,2009TS02,2015TS15);廣東省水產(chǎn)品質(zhì)量安全專項(xiàng)項(xiàng)目(GDSCZA2015009);國家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估重大專項(xiàng)(GJFP201501003)
古小莉(1982-),女,碩士,助理研究員,研究方向?yàn)樗a(chǎn)品質(zhì)量安全,lilet_ku@163.com
李劉冬,研究員,研究方向?yàn)樗a(chǎn)品質(zhì)量安全,168lld@163.com