孫琳林， 梁紹棟，王莉莉，盧林，劉倫翠

(牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，黑龍江 牡丹江 157011)

方劑研究

補(bǔ)瀉不同配伍補(bǔ)陰方對(duì)衰老大鼠免疫相關(guān)因子含量影響的比較研究

孫琳林， 梁紹棟，王莉莉，盧林，劉倫翠*

(牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，黑龍江 牡丹江 157011)

目的：分析和比較具有補(bǔ)瀉不同配伍特點(diǎn)的兩經(jīng)典補(bǔ)陰方左歸丸和六味地黃丸及兩方共有“三補(bǔ)”藥物組對(duì)D-半乳糖致亞急性衰老大鼠免疫相關(guān)因子的影響。方法：觀察左歸丸、六味地黃丸及兩方共有“三補(bǔ)”藥物組對(duì)D-半乳糖(D-gal)致亞急性衰老模型大鼠血清白介素-1 (IL-1)、白介素-2 (IL-2)、白介素-8 (IL-8)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)含量及腎臟表面生長(zhǎng)因子(EGF)表達(dá)的影響。結(jié)果： 亞急性衰老大鼠血清IL-1、IL-8、TNF-α含量升高，IL-2含量降低，腎臟EGF表達(dá)水平下調(diào)；與模型組相比，三給藥組對(duì)IL-1、TNF-α含量具有降低作用，對(duì)IL-2有明顯的升高作用，對(duì)EGF表達(dá)水平具有上調(diào)作用，對(duì)IL-8含量六味組具有顯著的降低作用，三補(bǔ)組和左歸組均無(wú)顯著降低作用。結(jié)論：左歸丸、六味地黃丸及三補(bǔ)藥物組對(duì)D-半乳糖引起的衰老大鼠血清中的IL-1、TNF-α均有不同程度的抑制作用，對(duì)IL-2和EGF在腎臟的表達(dá)有明顯的升高作用。三組觀察藥物可能是通過(guò)抑制白介素和TNF-α等致炎因子和促進(jìn)IL-2和EGF的保護(hù)作用來(lái)調(diào)整亞急性衰老模型大鼠的免疫機(jī)能，抑制炎癥損傷，從而達(dá)到延緩衰老的效果。兩方存在補(bǔ)瀉配伍方式的不同，相對(duì)來(lái)說(shuō)六味地黃丸的作用更為明顯和穩(wěn)定，說(shuō)明恰當(dāng)?shù)呐湮閷?duì)中藥復(fù)方療效的強(qiáng)度和穩(wěn)定性具有重要作用。

左歸丸；六味地黃丸；三補(bǔ)；免疫；配伍

當(dāng)今，世界人口老齡化趨勢(shì)加快，由此引起老年病發(fā)病比率逐年升高，人們對(duì)抗衰老藥物，尤其是中醫(yī)藥抗衰方劑日益重視。左歸丸和六味地黃丸是公認(rèn)的抗衰經(jīng)典方劑，均具有滋補(bǔ)腎陰的作用，在配伍上兩方均以“三補(bǔ)”為基礎(chǔ)，前者純甘壯水，陽(yáng)中求陰，后者補(bǔ)中寓瀉，補(bǔ)瀉兼顧，目前兩方的抗衰藥理作用的實(shí)驗(yàn)研究較多，但兩方在抗衰作用方面的比較研究還少有報(bào)導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)觀察了左歸丸和六味地黃丸及兩方共有組分“三補(bǔ)”對(duì)D-半乳糖(D-gal)致亞急性衰老大鼠免疫相關(guān)因子的影響，并對(duì)兩方的作用進(jìn)行了分析和比較，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)導(dǎo)如下。

1 材料與方法

1.1 用藥及制備

六味地黃丸(熟地黃24 g，山藥12 g，山萸肉12 g，茯苓9 g，牡丹皮9 g，澤瀉9 g)，左歸丸(熟地黃24 g，山藥12 g，山萸肉12 g，菟絲子12 g，龜板膠12 g，枸杞12 g，牛膝9 g和鹿角膠12 g)及“三補(bǔ)”藥物組(熟地黃24 g，山藥12 g和山萸肉12 g)，中藥飲片購(gòu)自牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院草藥局，水煎后4 ℃冷藏保存，左歸丸煎制后濃度為0.63 g/mL，六味地黃丸煎制后濃度為0.45 g/mL，“三補(bǔ)”藥物組煎制后濃度為0.29 g/mL。

1.2 動(dòng)物及分組

取Wistar大鼠60只(購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)，雌雄各半，體質(zhì)量(300±20)g，體質(zhì)量區(qū)域化后隨機(jī)分為正常組、模型組、六味組、三補(bǔ)組和左歸組，每組12只。

1.3 造模及給藥

根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》，選擇以D-半乳糖致大鼠亞急性衰老為模型[1]。具體造模方法如下：將D-gal 5 000 mg溶于生理鹽水500 mL中，配成10 mg/mL濃度的溶液，按300 mg/(kg·d)劑量給大鼠腹腔注射，正常對(duì)照組大鼠注射等體積生理鹽水，造模周期為8周。各給藥組(即左歸組、六味組和三補(bǔ)組)于造模開(kāi)始的同時(shí)按10 mL/kg每日上午分別給予上述煎煮好的相應(yīng)治療藥物，正常組和模型組給生理鹽水，灌胃給藥，每日1次。各給藥組的給藥劑量分別為左歸組9.45 g/kg、六味組6.75 g/kg、三補(bǔ)組4.32 g/kg，給藥周期為8周。8周后各組大鼠斷頭取血，分離血清，按要求保存待測(cè)。

1.4 指標(biāo)及檢測(cè)

觀察指標(biāo)包括白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、白介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)及腎臟表面生長(zhǎng)因子(EGF)，所需酶聯(lián)免疫測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，指標(biāo)檢測(cè)均按照試劑盒提供的方法及要求進(jìn)行操作，免疫組化采用Motic Med 6.0彩色病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析和計(jì)數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 對(duì)衰老大鼠血清白介素的影響

從表1可以看出：模型組大鼠血清中白介素-1和白介素-8活性均明顯高于正常組，差異具有顯著性(P<0.01或P<0.05)；對(duì)白介素-1的影響，三給藥組與模型組具有顯著性差異(P<0.01或P<0.05);對(duì)白介素-8的影響，六味組有顯著的降低作用(P<0.05)，另兩個(gè)給藥組與模型組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)；對(duì)白介素-2的影響，模型組含量較正常組明顯降低，差異具有顯著性(P<0.01)，各給藥組與模型組相比具有升高的作用，其差異顯著有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表1 對(duì)衰老大鼠血清IL-1、IL-2、IL-8活性的影響

注：與模型組比較,*P<0.05，**P<0.01

2.2 對(duì)衰老大鼠血清腫瘤壞死因子-α含量的影響

從表2可以看出：模型組大鼠血清中的TNF-α活力明顯高于正常組，具有顯著性差異(P<0.01)；各給藥組血清TNF-α的含量明顯降低，與模型組相比具有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)，其中六味組和三補(bǔ)組降低效果較左歸組差異顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 對(duì)衰老大鼠血清腫瘤壞死因子-α含量的影響

注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01

2.3 對(duì)衰老大鼠腎臟表面生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響

從表3可以看出：模型組大鼠腎臟EGF表達(dá)明顯低于正常組，具有顯著性差異(P<0.01)；各治療組大鼠腎臟EGF表達(dá)均有升高，與模型組相比具有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)，其中六味組升高效果較好，與另兩組給藥組相比差異顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) (見(jiàn)圖1)。

表3 對(duì)衰老大鼠EGF表達(dá)的影響

注：與模型組比較,*P<0.05，**P<0.01

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為腎精虧虛是衰老發(fā)生的內(nèi)在的根本性機(jī)制之一，古人常用具有補(bǔ)腎填精作用的中藥延年益壽。本文所選觀察藥物是公認(rèn)的可以通過(guò)其補(bǔ)腎填精作用達(dá)到延緩衰老目的的經(jīng)典補(bǔ)陰方，左歸丸與六味地黃丸均是補(bǔ)腎填精的傳統(tǒng)名方，兩方共有的“三補(bǔ)”藥物組是中醫(yī)臨床補(bǔ)腎填精湯方中的常用藥物配伍[2]?，F(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究亦證明[3-5]補(bǔ)腎填精中藥復(fù)方既可以影響細(xì)胞周期，減緩細(xì)胞衰老，又可以抑制炎癥因子；并且，通過(guò)對(duì)腎藏精與衰老在自由基、免疫功能等方面的研究發(fā)現(xiàn)，在衰老發(fā)生這一過(guò)程中，腎藏精應(yīng)該為物質(zhì)基礎(chǔ)，腎虛漸虧是衰老的病機(jī)核心。

隨著世界人口老齡化的加快，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)衰老的發(fā)生機(jī)制亦有了較為深刻的了解。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，人體衰老過(guò)程中免疫衰老是主要原因之一，衰老引起的最明顯的現(xiàn)象是免疫系統(tǒng)失調(diào)，包括免疫衰退和慢性炎癥[6]；免疫系統(tǒng)功能衰退可以削減機(jī)體的免疫保護(hù)作用，同時(shí)產(chǎn)生慢性炎癥狀態(tài)，從而增加了患自身免疫性疾病的風(fēng)險(xiǎn)[7]。因此，有人稱衰老是一種流行性免疫病[8]。在這一過(guò)程中，衰老的自然殺傷細(xì)胞(NK)殺傷毒力降低，成熟障礙，衰老的NK細(xì)胞一方面分泌保護(hù)因子的含量不足，另一方面又會(huì)分泌較多的致炎因子，如白介素-1 (IL-1)，白介素-8 (IL-8)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等[9]。

圖1 大鼠腎臟表面生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響(400×)

亞急性衰老模型的造模機(jī)制在于當(dāng)體內(nèi)蓄積過(guò)量的D-半乳糖后，D-半乳糖可被醛糖還原酶還原成半乳糖醇，這一過(guò)程可引起活性氧類(reactive oxygen species, ROS)的積聚，造成機(jī)體的氧化應(yīng)激損傷；同時(shí)被激活的ROS又會(huì)誘導(dǎo)TNF-α和白介素家族多種細(xì)胞因子的表達(dá)[10]， TNF-α和白介素家族多種細(xì)胞因子等促炎細(xì)胞因子可加劇炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞衰老和細(xì)胞凋亡[11-13]；在這一損傷過(guò)程中表皮生長(zhǎng)因子(EGF)可通過(guò)與細(xì)胞膜上的EGF受體結(jié)合而廣泛作用于機(jī)體各組織和器官，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增值產(chǎn)生明顯的促進(jìn)作用，有利于炎癥損傷的修復(fù)。研究報(bào)道，在正常的腦老化過(guò)程中和在年齡相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變中，氧化應(yīng)激與炎性反應(yīng)的增加表現(xiàn)尤為突出[14-15]，因此，D-半乳糖致衰老作用可以較好地體現(xiàn)氧化應(yīng)激及免疫炎性反應(yīng)兩個(gè)方面的衰老機(jī)制。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，左歸丸、六味地黃丸及三補(bǔ)藥物組對(duì)D-半乳糖引起的衰老大鼠血清中的IL-1和TNF-α均有不同程度的抑制作用，對(duì)EGF在腎臟的表達(dá)有明顯的上調(diào)作用，對(duì)于炎癥保護(hù)因子IL-2，三給藥組均有顯著升高作用，對(duì)IL-8六味組有顯著的降低作用。三組觀察藥物可能是通過(guò)抑制致炎因子和促進(jìn)保護(hù)作用來(lái)調(diào)整亞急性衰老模型大鼠的免疫機(jī)能，抑制炎癥損傷，從而達(dá)到延緩衰老的效果。中藥的應(yīng)用需講究嚴(yán)謹(jǐn)?shù)呐湮?，左歸丸和六味地黃丸均是配伍嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难a(bǔ)腎名方[16-17]，兩方一則純補(bǔ)無(wú)瀉，一則補(bǔ)瀉兼顧，配伍思想盡管相反，但對(duì)現(xiàn)代臨床中藥的應(yīng)用均有很高的指導(dǎo)價(jià)值。從本研究的結(jié)果分析，似乎補(bǔ)瀉兼顧的六味地黃丸在對(duì)免疫炎癥損傷的抑制作用方面效果更為穩(wěn)定和明顯，筆者分析，這一方面說(shuō)明恰當(dāng)?shù)呐湮閷?duì)中藥復(fù)方療效的強(qiáng)度和穩(wěn)定性具有重要作用，另一方面原因可能與補(bǔ)益藥“滋膩礙胃”的弊端有一定的關(guān)系，因?yàn)檠a(bǔ)瀉兼顧的配伍可以對(duì)補(bǔ)益藥的滋膩之性有一定的抑制作用，純補(bǔ)無(wú)瀉的配伍很可能因?yàn)閷?duì)消化吸收功能產(chǎn)生影響而引起對(duì)免疫功能的提高和炎癥損傷的抑制作用減弱。但在這一點(diǎn)上到底是由于“滋膩之性”引起藥物的吸收不完全的原因?qū)е碌男Ч蝗缌兜攸S丸明顯，還是“滋膩之性”造成了消化吸收功能的負(fù)擔(dān)而加重了氧化應(yīng)激和炎性損傷的原因引起的，很值得我們進(jìn)一步探索和研究。

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ComparativeStudyofRelevantImmuneFactorsinAgingRatsIntervenedbyNourishing-yinFormulawithDifferentCompatibility

SUNLin-lin,LIANGShao-dong,WANGLi-li,LULin,LIULun-cui

(HongqiHospitalAffiliatedtoMudanjiangMedicalCollege,Mudanjiang157011,China)

Objective: To analyze and compare the effect of the two classical formula with action of nourishing yin, Zuogui Pill and Liuwei Dihuang Pill, which have different compatibility characteristics, and to investigate relevant immune factors influenced by “Sanbu”(three medicinal with supplementing function),which is common to both formula, in sub-acute aging rats induced by D-galactose. Methods: The content of IL-1, IL-2, IL-8, TNF-α, and the expression of EGF in sub-acute aging rats were observed after the intervention with Zuogui Pill, Liuwei Dihuang Pill and “Sanbu”. Results: After modeling, the content of IL-1, IL-8 and TNF-α were increased, but the content of IL-2 and the expression of EGF were decreased. Compared to the model group, the levels of IL-1 and TNF-α were degraded, and IL-2 level and EGF expression were raised obviously by the medications; IL-8 content was decreased obviously by Liuwei Dihuang Pill, however, there were no significant reducing effect in the other two groups. Conclusion: There are different inhibition effect on IL-1 and TNF-α, and up-regulation effect on IL-2 and EGF in sub-acute aging rats, when they are treated by Zuogui Pill, Liuwei Dihuang Pill, or “Sanbu”, which may be related to the inhibition of the inflammatory factors and the adjustment of immune protective effect. There are different compatibility pattern in terms of reinforcing and reducing in the two formulas; comparatively, the effect of Liuwei Dihuang Pill is more obvious and stable, which shows appropriate compatibility playing an important role on the strength and stability of Chinese medicine formula.

Zuogui Pill; Liuwei Dihuang Pill; “Sanbu”; Immune; Compatibility

R289.1

A

1002-2392(2017)05-0076-04

2017-01-17

2017-09-15

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(12531738)

孫琳林(1979-)，女，博士，副主任醫(yī)師，副教授，主要從事中西醫(yī)結(jié)合教學(xué)、臨床及科研工作。

*通訊作者：劉倫翠(1955-)，女，主任醫(yī)師，教授，主要從事老年醫(yī)學(xué)的教學(xué)、臨床及科研工作。