當羊骨片對維甲酸致骨質(zhì)疏松大鼠轉(zhuǎn)化生長因子-β1 mRNA表達的影響

尹 鑫 于海龍 張曉峰 楊 麗 王 偉 李青春

(承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北 承德 067000)

1 航天中心醫(yī)院

當羊骨片對維甲酸致骨質(zhì)疏松大鼠轉(zhuǎn)化生長因子-β1 mRNA表達的影響

尹 鑫 于海龍 張曉峰 楊 麗 王 偉1李青春

(承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北 承德 067000)

目的觀察當羊骨片對維甲酸致骨質(zhì)疏松(OP)大鼠股骨轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1 mRNA表達的影響。方法6月齡SPF級雌性SD大鼠60只，隨機分為正常對照組、維甲酸模型組、仙靈骨葆組(312 mg/kg)和當羊骨片低、中、高劑量組(250，500，1 000 mg/kg)，每組10只,除正常對照組外，其余各組動物每日灌胃給予維甲酸70 mg/kg，連續(xù)14 d。造模的同時，各組給予相應(yīng)藥物干預(yù)，共28 d。檢測子宮質(zhì)量指數(shù)、血清TGF-β1水平、股骨上段TGF-β1 mRNA表達及脛骨上段骨組織形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果與正常對照組比較，維甲酸模型組血清TGF-β1水平、股骨TGF-β1 mRNA表達及子宮質(zhì)量指數(shù)顯著降低(P<0.01),形態(tài)學(xué)檢查可見骨髓腔變大，骨小梁變細變薄，排列稀疏、不規(guī)則等骨質(zhì)疏松表現(xiàn)。與維甲酸模型組比較，當羊骨片高劑量組能顯著升高血清TGF-β1水平、股骨TGF-β1 mRNA表達及子宮質(zhì)量指數(shù)(P<0.01，P<0.05)，當羊骨片中劑量組與仙靈骨葆組能顯著升高股骨TGF-β1 mRNA表達(P<0.01)，而血清TGF-β1水平高于維甲酸模型組，但無顯著差異(P>0.05)。結(jié)論當羊骨片對TGF-β1基因表達有一定的調(diào)控作用，對維甲酸致OP大鼠有一定的防治作用。

骨質(zhì)疏松；維甲酸；當羊骨片；轉(zhuǎn)化生長因子-β1

骨質(zhì)疏松(OP)是以骨結(jié)構(gòu)退化、骨量減少、脆性增加、容易病理性骨折為主要特征，屬于全身性骨骼老化或退化的代謝障礙性疾病〔1〕，屬于中老年退行性疾病，隨著社會老齡化的加劇，其發(fā)病率已躍居多發(fā)病、常見病的第7位，全世界已有超過2億OP患者〔2，3〕。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1是在骨組織中含量最豐富的生長因子，具有抑制破骨細胞生成而拮抗骨吸收，同時具有促進成骨細胞分化增殖而刺激骨形成的雙重作用。本實驗觀察復(fù)方制劑當羊骨片對維甲酸致OP大鼠骨組織TGF-β1基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1動物 SPF級6月齡雌性SD大鼠60只，體質(zhì)量(280±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號:SCXK(京) 2012-0001。動物自由飲食飲水，室溫(24±2)℃,濕度40%～75%。

1.2藥品與試劑 當羊骨片(承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所提供，規(guī)格:0.4 g/片)；仙靈骨葆膠囊(貴州同濟堂制藥有限公司，規(guī)格:0.5 g/粒，國藥準字Z20025337)；維甲酸(北京貝麗萊斯生物化學(xué)有限公司，批號:140601)；RT-PCR試劑盒(批號:M3014)、Marker(批號:K0228)、Taq PCR Master Mix(批號:KT201-02)；PCR擴增引物(美國Invitrogen生命技術(shù)公司，批號:HB1410170019)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海索寶生物科技有限公司,批號:201501)。

1.3儀器與設(shè)備 ZF型紫外透射反射分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)；梯度PCR儀(BIO-RAD)；Multistrike MK3型酶標儀(美國Thermo公司)。

1.4動物分組與造模 60只清潔級SD雌性大鼠按體質(zhì)量隨機分為正常對照組、維甲酸模型組、仙靈骨葆組(312 mg/kg)和當羊骨片低、中、高劑量組(250，500，1 000 mg/kg)，共6組，每組10只。除正常對照組，其余各組動物灌胃維甲酸70 mg/kg，連續(xù)灌胃14 d，建立大鼠OP模型。造模的同時，各給藥組給予相應(yīng)劑量的藥物，正常對照組與維甲酸模型組給予同體積的蒸餾水。造模停止后，繼續(xù)給藥14 d。第29天取材。

1.5子宮質(zhì)量指數(shù)測定 取材前稱取大鼠體質(zhì)量，處死大鼠后取子宮，并輕壓擠出子宮液體，濾紙吸干，稱取質(zhì)量。按公式計算：子宮質(zhì)量指數(shù)=大鼠子宮質(zhì)量/大鼠質(zhì)量。

1.6血清TGF-β1測定 腹主動脈取血10 ml，4℃，離心15 min取上清液，-80℃保存，按照試劑盒所附說明書檢測血清TGF-β1水平。

1.7骨組織TGF-β1 mRNA表達水平測定 采用Trizol法提取總RNA。紫外可見分光光度計測定總RNA純度及濃度后瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性。PCR反應(yīng)條件：93℃×2 min，93℃×30 s,55℃×30 s,72℃×1 min,30個循環(huán)，72℃×7 min。GAPDH(332 bp)上游引物：5′-TCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3′,下游引物：5′-GTGCTGAGTATCGTGGAG-3′。TGF-β1(254 bp) 上游引物：5′-CTTCAGCTCCACAGAGAAGAACTGC-3′,下游引物：5′-CACGATCATGTTGGACAACTGCTCC-3′。PCR產(chǎn)物5 μl進行瓊脂糖凝膠電泳，確定PCR反應(yīng)產(chǎn)物。應(yīng)用Gel pro32凝膠圖像分析軟件進行定量分析，以目的條帶吸光度與GAPDH條帶吸光度比值，作為目的基因mRNA表達的相對水平。

1.8骨組織形態(tài)觀察 大鼠處死后取左側(cè)脛骨，剔除肌肉筋膜組織，稱重，4 %多聚甲醛固定48 h，10 %乙二胺四乙酸二鈉溶液脫鈣6 w，pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)充分沖洗2次，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋組織切片，厚度5 μm，蘇木精-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組子宮質(zhì)量指數(shù)比較 與正常對照組比較，維甲酸模型組子宮質(zhì)量指數(shù)顯著降低(P<0.01)；與維甲酸模型組比較，當羊骨片中、高劑量組子宮質(zhì)量指數(shù)顯著增加(P<0.05，P<0.01)，當羊骨片低劑量組及仙靈骨葆組子宮質(zhì)量指數(shù)均高于維甲酸模型組，但無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

2.2各組血清TGF-β1水平及股骨TGF-β1 mRNA比較 與正常對照組比較，維甲酸模型組血清TGF-β1水平及股骨TGF-β1 mRNA表達均顯著降低(P<0.01)；與維甲酸模型組比較，當羊骨片高劑量組血清TGF-β1水平及股骨TGF-β1 mRNA表達均顯著增加(P<0.05，P<0.01)，仙靈骨葆組與當羊骨片中劑量組股骨TGF-β1 mRNA表達顯著升高(P<0.01)，而血清TGF-β1水平均高于維甲酸模型組，但無顯著差異(P>0.05)。見表1，圖1。

2.3當羊骨片對骨組織形態(tài)的影響 在正常對照組可見骨小梁較密集，均勻分布，骨髓腔規(guī)則分布；而在維甲酸模型組骨小梁變薄、變細、稀疏斷裂不連接，有的成“紐扣”狀，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被破壞，骨髓腔明顯變大呈不規(guī)則分布，成骨細胞減少，破骨細胞增多；仙靈骨葆組及當羊骨片中、高劑量組發(fā)現(xiàn)骨小梁增多、變粗，骨髓腔變小且規(guī)則分布，成骨細胞明顯增多，破骨細胞減少，見圖2。

表1 各組子宮質(zhì)量指數(shù)、血清TGF-β1及股骨TGF-β1 mRNA比較

與正常對照組比較：1)P<0.01;與模型組比較：2)P<0.01，3)P<0.05

1～6：正常對照組、維甲酸模型組、仙靈骨葆組、當羊骨片低劑量組、當羊骨片中劑量組、當羊骨片高劑量組圖1 各組股骨TGF-β1 mRNA表達

圖2 各組骨組織病理切片(HE，×200)

3 討 論

維甲酸為維生素A的衍生物，能刺激破骨細胞并增強其活性，使骨吸收大于骨形成，從而影響骨代謝。維甲酸還可以降低卵巢功能，使雌激素分泌減少。維甲酸致OP大鼠模型在骨組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)、雌激素在骨組織的反應(yīng)及發(fā)病癥狀與人類均有較好的相似性〔4〕，被衛(wèi)生部列為評價OP藥物療效的標準動物模型之一〔5〕。本文中維甲酸誘發(fā)大鼠OP模型成功。

中醫(yī)學(xué)認為，OP屬于 “骨痿”“骨痹”范疇，其發(fā)病與腎虛、肝虛、脾虛、血瘀密切相關(guān)，以虛為本，以淤為標〔6〕，臨證分型多樣。在治療上，主要以補腎為主，補肝健脾、活血為輔。當羊骨片是由淫羊藿、補骨脂、當歸組成的復(fù)方制劑。淫羊藿溫補腎陽、強筋骨；補骨脂補腎填精、補腎溫脾；當歸益氣養(yǎng)血、祛瘀止痛。三藥合用能促進骨組織蛋白合成，提高其抗OP作用，同時三味中藥還通過其他機制發(fā)揮治療OP的作用。淫羊藿能直接調(diào)控下丘腦-垂體-性腺軸，產(chǎn)生類雌激素作用，提高大鼠血清雌激素水平，增強骨密度(BMD)〔7〕。淫羊藿可通過上調(diào)TGF-β1及骨形成蛋白-2的表達來促進骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化作用〔8〕。補骨脂可通過增強成骨細胞OPG的表達，抑制RANKL的表達來抑制破骨細胞的分化和成熟，從而抑制骨吸收，達到防治OP的目的〔9〕。當歸具有類雌激素作用及抗氧化作用，可增強雌激素合成，減少血清卵泡刺激素、黃體生成素及下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)釋放，提高超氧化物歧化酶的活性〔10〕。

TGF-β1是具有多種功能的蛋白多肽，主要存在于骨組織和血小板中。TGF-β1是骨形成和骨吸收之間重要的耦聯(lián)調(diào)節(jié)因子，對骨的修復(fù)和重建有重要作用。TGF-β1能刺激骨細胞DNA的合成與重組，促進成骨細胞增殖，促進骨和軟骨細胞、細胞膠原和基質(zhì)蛋白的合成并刺激基質(zhì)鈣化〔11〕；另外，TGF-β1抑制破骨細胞的增殖分化并誘導(dǎo)其凋亡，從而抑制骨吸收〔12〕。本研究提示當羊骨片可能是通過促進成骨細胞增殖分化，增加骨組織TGF-β1 mRNA表達增加，使得骨形成增強，另一方面降低破骨細胞活性，拮抗骨吸收，從而達到防治OP的作用。

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河北省重大技術(shù)創(chuàng)新項目(No.07276444Z)

張曉峰(1962-),男,教授,博士,碩士生導(dǎo)師，主要從事胃腸道疾病研究及中藥新藥研發(fā)。

尹 鑫(1985-),女,在讀碩士,主要從事中藥藥理研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)20-4988-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.014

〔2016-09-16修回〕

(編輯 曹夢園)