張煜涵 ， 劉照琨 ， 畢 磊 ， 關(guān)靖喆 ， 毛貽賢 ， 李 達 ， 馬 靜 ， 路麗群 ， 張思遠 ， 路義鑫

(東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院 動物疾病防控技術(shù)與制劑創(chuàng)制重點實驗室 ， 黑龍江 哈爾濱 150030)

旋毛蟲Serpin基因在不同發(fā)育時期的mRNA表達水平變化及蟲體表達特性

張煜涵 ， 劉照琨 ， 畢 磊 ， 關(guān)靖喆 ， 毛貽賢 ， 李 達 ， 馬 靜 ， 路麗群 ， 張思遠 ， 路義鑫

(東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院 動物疾病防控技術(shù)與制劑創(chuàng)制重點實驗室 ， 黑龍江 哈爾濱 150030)

為研究旋毛蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serpin)，基因在不同發(fā)育時期的mRNA表達水平變化，本研究應用實時熒光定量PCR技術(shù)對不同發(fā)育時期的蟲體的Serpin在mRNA表達水平進行檢測。同時利用鼠抗重組蛋白血清對Serpin在旋毛蟲成蟲、新生幼蟲、成囊前期幼蟲及肌幼蟲中進行定位，以鑒定該Serpin基因的表達特性。研究結(jié)果顯示，在成蟲時期，3 d時表達量明顯高于6 h和5 d的表達量(P﹤0.05)；成囊前期表達量很低，其中18 d時表達量最低(P﹤0.05)；肌幼蟲時期在26 d、38 d和 48 d均有大量表達(P﹤0.05)。免疫熒光染色結(jié)果表明， TsSerpin蛋白在5 d成蟲期的體表表達；在新生幼蟲和14 d成囊前期幼蟲的體內(nèi)體表均有表達；38 d肌幼蟲時期明顯可見表皮及體內(nèi)均有表達。本實驗為探究旋毛蟲在宿主體內(nèi)免疫逃避機制奠定基礎。

旋毛蟲 ； 絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serpin) ； 實時熒光定量PCR ； 免疫熒光定位

旋毛蟲病是由旋毛形線蟲(Trichinellaspiralis)引起的一種危害嚴重的食源性人獸共患寄生蟲病，也是目前世界上傳播分布最廣泛的人獸共患病原體之一[1]。絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serpin)，也叫絲氨酸蛋白酶抑制因子(Serine protease inhibitor，簡稱Serpin)，已被證實其廣泛存在于哺乳動物、植物、原生動物和昆蟲等多種生物體內(nèi)，在宿主的免疫應答和細胞學功能上起重要的調(diào)節(jié)和抑制作用[2]。目前，相應的疫苗和檢測手段主要集中在肌幼蟲排泄分泌抗原(ES)，應用在ELISA法檢測旋毛蟲對人旋毛蟲病的肌幼蟲時期的診斷起到了很好的效果，而此類檢測手段對旋毛蟲感染早期診斷效果很差[3]。本研究針對旋毛蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑在不同發(fā)育時期的表達特性進行探究，為探究旋毛蟲早期診斷及入侵宿主的免疫逃避機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 蟲種和實驗動物 旋毛蟲(Trichinellaspiralis)T1分離株(ISS534)由本實驗室傳代保種。5周齡健康昆明系小鼠，均購自哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物研究中心。

1.2 主要試劑和儀器 TRIZol和SYBR?Premix ExTaqTMII,購自寶生物工程(大連)有限公司；胃蛋白酶、Triton X-100和Hochest 33342,購自Sigma公司；正常山羊血清、Alexa Fluor 484 Goat anti-mouse IgG,購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。ABI7500實時熒光PCR儀為ABI公司產(chǎn)品；熒光顯微鏡Leica DM2000-3000為萊卡公司產(chǎn)品。

1.3 引物設計與合成 參照GenBank上的旋毛蟲Serpin和GAPDH mRNA參考序列，利用Primer5.0軟件設計引物，如表1。

表1 實時熒光定量引物序列

1.4 旋毛蟲不同時期蟲體的收集 取經(jīng)口感染45只成年健康小鼠，感染劑量2 000蚴/小鼠，在小鼠感染旋毛蟲肌幼蟲6 h、3 d、5 d后收集成蟲(Adult worms, AW)[4]，并取適量成蟲體外培養(yǎng)收集新生幼蟲(New born larvae, NBL)[5]；于感染后第14天、18天和22天收集成囊前期幼蟲(Pre-encysted larvae, PEL)[6]；于感染后第26天、38天、和48天收集旋毛蟲肌幼蟲(Muscle larvae, ML)[5]。將收集到的旋毛蟲各時期蟲體用DEPC水洗滌3次，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 Serpin在旋毛蟲不同發(fā)育時期轉(zhuǎn)錄水平的檢測

1.5.1 旋毛蟲總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄 將上述不同時期蟲體按照TRIZol Reagent RNA試劑盒操作說明書，提取旋毛蟲總RNA，測定OD值及RNA濃度，RNA的D260nm/D280nm值應在1.8～2.1之間。并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將陽性引物鑒定完整的cDNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 標準曲線的建立 以旋毛蟲cDNA為模板，PCR擴增TsSerpin和TsGAPDH基因，陽性PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中。提取pMD-18T-Serpin和pMD-18T-Gapdh質(zhì)粒并測量質(zhì)粒濃度，用ddH2O進行10倍倍比稀釋，-20 °C保存。以不同濃度標準品為模板，反應體系和條件參照SYBR?Premix Ex-TaqTMII 說明書。

1.5.3 待測樣品的檢測 將不同時期蟲體RNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA作為模板，分別以表1的引物進行Q-PCR。每個樣品均設置3個重復孔，且進行3次生物學重復。反應條件和反應體系同1.5.3。

1.6 旋毛蟲Serpin蛋白在旋毛蟲不同發(fā)育時期的表達及定位 將不同時期的裸蟲用滅菌的生理鹽水洗凈，分別置于處理過的載玻片上，將載玻片放入液氮中，取出待用，實驗步驟參照已知研究[7]。

1.7 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)以means±SD表示，差異分析運用one-way ANOVA進行分析。其中，P>0.05表示為統(tǒng)計學差異不顯著，P<0.05表示為統(tǒng)計學顯著性差異，P<0.01表示為統(tǒng)計學極顯著性差異。

2結(jié)果

2.1 TsSerpin和TsGAPDH基因片段的擴增 經(jīng)RT-PCR擴增，TsSerpin獲得大小為111 bp的基因片段，與預期目的基因大小相符。TsGAPDH目的片段，大小為92 bp，與預期目的基因大小相符。

2.2 標準曲線的制作 分別以pMD18-T-TsSerpin及pMD18-T-TsGAPDH重組質(zhì)粒的標準品進行Q-PCR。直線回歸方程分別為y=-3.474x+17.944(R2=0.994)和y = -3.209x+12.452 (R2=0.999)。

2.3 不同時期TsSerpin mRNA的表達水平

圖1 不同時期TsSerpin mRNA相對表達量的影響

如圖1所示，可知TsSerpin在AD、NBL、PEL和ML時期均有表達。其中在AD時期，3 d時表達量明顯高于6 h和5 d的表達量(P<0.05)，5 d時較NBL略低；PEL的表達量很低，其中18 d時表達量最低(P<0.05)；ML時期從26 d開始升高，直至48 d均有表達(P<0.05)。

2.4 TsSerpin在不同時期蟲體的免疫熒光定位 免疫熒光染色結(jié)果表明，如中插彩版圖2，TsSerpin蛋白在5 d的體表表達；NBL時期紅色熒光很弱；在14 d的體內(nèi)體表均有表達，整體紅色熒光效果較弱；38 d明顯可見表皮及桿狀細胞均有表達。

3 討論

旋毛蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑首先由Nagano等[8]克隆得到。有研究發(fā)現(xiàn)[1,9]，絲氨酸蛋白酶抑制劑是寄生蟲在侵襲宿主組織時與宿主相互起獨特作用的重要分子，參與了寄生蟲在宿主體內(nèi)的移行過程，使感染的肌細胞發(fā)生變化最終形成包囊，與寄生蟲對宿主的免疫逃避機制作用息息相關(guān)。

本試驗在已有研究的基礎上，對旋毛蟲Serpin基因在旋毛蟲不同發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄水平表達和免疫熒光定位進行了進一步的研究，結(jié)果表明，該基因在旋毛蟲不同發(fā)育時期均有轉(zhuǎn)錄，其中在旋毛蟲成蟲期和肌幼蟲時期各出現(xiàn)一個轉(zhuǎn)錄高峰。成蟲期的轉(zhuǎn)錄高峰發(fā)生在感染后3 d，肌幼蟲期的轉(zhuǎn)錄高峰發(fā)生在感染后的38 d。此結(jié)果與吳秀萍的TsSerpin在轉(zhuǎn)錄水平上成蟲期和肌幼蟲時期的研究結(jié)果基本一致。而與Nagano[8]等人應用半定量RT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)旋毛蟲不同時期總RNA中TsSerpin基因在新生幼蟲和18 d時期的含量較高的結(jié)果不盡相同。在本試驗中從5 d的AD期開始直至22 d的成囊前期幼蟲時期一直保持著較低的轉(zhuǎn)錄水平，其中在18 d的成囊前期幼蟲時期轉(zhuǎn)錄水平最低。究其原因可能是旋毛蟲感染后3 d時，成蟲正處于快速生長時期，該基因大量轉(zhuǎn)錄；感染后的5 d，成蟲狀態(tài)已基本穩(wěn)定，轉(zhuǎn)錄很少；新生幼蟲和成囊前期幼蟲時處于活躍的移行階段，轉(zhuǎn)錄水平也很低；而在感染后的38 d，旋毛蟲肌幼蟲的包囊已經(jīng)完全形成，轉(zhuǎn)錄水平達到另一個高峰。因此推測該基因可能與旋毛蟲在腸道時期的發(fā)育、肌幼蟲時期包囊的形成有關(guān)[1]，而對于新生幼蟲和成囊前期幼蟲的機械性移行作用有限。

免疫熒光定位結(jié)果顯示，在5 d成蟲的體表大量表達，紅色熒光效果明顯；在新生幼蟲和感染后的14 d成囊前期幼蟲的體內(nèi)體表均有表達，整體紅色熒光效果較弱；在感染后的38 d肌幼蟲時期明顯可見表皮及桿狀細胞均有大量表達。與本文實時熒光定量分析結(jié)果相一致。與吳秀萍等發(fā)現(xiàn)旋毛蟲感染的18 d檢測到微弱紅色熒光，28 d可見表皮明顯的紅色熒光，35 d在整個蟲體內(nèi)均可檢測到較強的紅色熒光，但在蟲體外未檢測到明顯的紅色熒光的實驗結(jié)果略有不同?？赡苡捎谘芯繉ο笫遣煌蛐偷慕z氨酸蛋白酶的原因。與Nagano[8]等人發(fā)現(xiàn)該蛋白在18 d蟲體內(nèi)大量表達，但在肌幼蟲時期未見該蛋白分泌的結(jié)果仍存在差異?？赡苁鞘褂昧瞬煌男x分離株和不同的實驗技術(shù)所致，原因有待進一步探討。本試驗為進一步探究旋毛蟲在宿主體內(nèi)免疫逃避機制奠定基礎。

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TheexpressionlevelofSerpinmRNAandexpressioncharacteristicsindifferentdevelopmentalstagesoftheTrichinaspiralis

ZHANG Yu-han , LIU Zhao-kun , BI Lei , GUAN Jing-zhe , MAO Yi-xian ,LI Da , MA Jing , LU Li-qun , ZHANG Si-yuan , LU YI-XIN

(College of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Key Laboratory of Animal Disease Control and Preparation Technology,Harbin 150030,China)

In order to study the change of mRNA expression level of the Serpin gene in different development stages, the Serpin mRNA expression level was analyzed by real-time quantitative PCR. At the same time using anti-TsSerpin serum, the characterization of the TsSerpin expression was examined in adult, newborn larvae, pre-encysted larva, and muscle larvae ofTrichinaspiralis. The results showed that the expression at 6h was higher than that at 5d and 3d in the adult stage (P< 0.05).The expression ofT.spiralispre-encysted larva was very low, and the expression of 18d was the lowest (P< 0.05);the expression in mus -cle larvae at the 26d, 38d and 48d had a significant increase(P< 0.05).The immune-localization revealed that TsSerpin was ubiquitously distributed at allT.spiralisdevelopmental stages. The results showed that TsSerpin protein in the adult stage at 5d was expressed in the surface of adult worm; the TsSerpin protein of newborn larvae and pre-encysted larva was expressed in the body surface and in vivo. TsSerpin protein in muscle larvae at 38d was clearly visible in the skin and in vivo expression.

Trichinellaspiralis; serine protease inhibitor ; real-time quantitative PCR ; immunefluorescence

LU Yi-xin

S855.9+9

A

0529-6005(2017)09-0013-03

2016-11-15

國家自然科學基金(31372427) ; 教育部高等學校博士學科點專項科研基金(20132325110002)

張煜涵(1990-)，女，碩士，主要從事寄生蟲病及其分子生物學研究，E-mail：cookhappy@hotmail.com

路義鑫，E-mail：luyixin@neau.edu.cn