戴蓉，徐家根，刁巖忠（1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院藥學(xué)部，南京210004；2.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院藥學(xué)部，南京210008；.南京優(yōu)科生物醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司，南京210009）

改進(jìn)HPLC法測(cè)定雷替曲塞原料藥中的光學(xué)異構(gòu)體

戴蓉1＊，徐家根2#，刁巖忠3（1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院藥學(xué)部，南京210004；2.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院藥學(xué)部，南京210008；3.南京優(yōu)科生物醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司，南京210009）

目的：改進(jìn)高效液相色譜法測(cè)定雷替曲塞原料藥中的光學(xué)異構(gòu)體。方法：對(duì)色譜柱、流動(dòng)相和進(jìn)樣量進(jìn)行改進(jìn)，改進(jìn)后的色譜柱為CHIRALPAK AD-H，流動(dòng)相為正己烷-無(wú)水乙醇-三氟乙酸（70∶30∶0.1，V/V/V），進(jìn)樣量為100 μL，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為226 nm，柱溫為35℃。結(jié)果：光學(xué)異構(gòu)體檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍為99.68～398.7 ng（r＝0.999 9）；定量限為4.945 ng，檢測(cè)限為1.648 ng；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜1.0%；加樣回收率為99.43%～100.14%（RSD＝0.25%，n＝9）。結(jié)論：改進(jìn)后的方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好，可用于測(cè)定雷替曲塞原料藥中的光學(xué)異構(gòu)體。

雷替曲塞原料藥；光學(xué)異構(gòu)體；高效液相色譜法；方法改進(jìn)

雷替曲塞（Raltitrexed）最初是由英國(guó)Zeneca公司和Royal Marsden醫(yī)院合作開(kāi)發(fā)的一種喹唑啉葉酸鹽類似物，于1996年首先在英國(guó)申請(qǐng)獲準(zhǔn)上市，商品名為Tomudex[1]。2009年，我國(guó)原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)南京正大天晴制藥有限公司國(guó)產(chǎn)雷替曲塞制劑上市，商品名為賽維健。雷替曲塞屬于細(xì)胞毒抗腫瘤藥物，直接對(duì)胸苷酸合成酶（TS）起到抑制作用，可用于治療不適合5-氟尿嘧啶脫氧核苷酸與亞葉酸鈣的晚期結(jié)直腸癌患者[2-3]。已有研究表明，雷替曲塞還可用于治療惡性胸膜瘤、胰腺癌、頭頸癌、食管癌、胃癌等實(shí)體瘤，療效顯著，耐受性好[4-5]，具有較好的臨床應(yīng)用前景。

雷替曲塞分子結(jié)構(gòu)中存在一個(gè)手性中心，除雷替曲塞主成分外，只具有一個(gè)手性異構(gòu)體，即光學(xué)異構(gòu)體。大多數(shù)情況下，其中一種光學(xué)異構(gòu)體具有藥理活性，而另一種異構(gòu)體活性很差，甚至有毒副作用，因此對(duì)光學(xué)異構(gòu)體的分析控制極為重要[6]。雷替曲塞原料藥收載于我國(guó)國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)[7-8]中，其采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定其光學(xué)異構(gòu)體，色譜柱填料為α-酸性糖蛋白鍵合硅膠，該填料容易變性失活、發(fā)霉變質(zhì)，使色譜柱耐用性差，從而增加檢驗(yàn)成本；且對(duì)有機(jī)相的種類和濃度選擇均有一定限制，對(duì)使用溫度、壓力及流動(dòng)相中緩沖鹽濃度和pH要求苛刻；同時(shí)，該色譜柱的載樣量小，易受污染和累積殘留，柱效低，導(dǎo)致方法重復(fù)性差，影響了其應(yīng)用及推廣[9-10]。鑒于此，筆者參考文獻(xiàn)[11-18]，改用CHIRALPAK AD-H色譜柱，并對(duì)流動(dòng)相和進(jìn)樣量進(jìn)行了改進(jìn)，建立了以HPLC法測(cè)定雷替曲塞原料藥中光學(xué)異構(gòu)體的方法，以期為該原料藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AB型HPLC儀，包括CBM-20A系統(tǒng)控制器、DGU-20A3真空脫氣機(jī)、SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器、LC-20AB輸液?jiǎn)卧?、SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20AC柱溫箱、LabSolutions色譜工作站（日本Shimadzu公司）；XS205型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；Biosafer SB25-12DTD型超聲波清洗儀（上海諾頂儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

雷替曲塞原料藥（南京優(yōu)科制藥有限公司，批號(hào)：20150101、20150102、20150103）；光學(xué)異構(gòu)體對(duì)照品（南京優(yōu)科制藥有限公司，批號(hào)：20141022，純度：98.6%）；正己烷和無(wú)水乙醇為色譜純，其作試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：CHIRALPAK AD-H（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：正己烷-無(wú)水乙醇-三氟乙酸（70∶30∶0.1，V/V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：226 nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：100 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液取光學(xué)異構(gòu)體對(duì)照品約10 mg，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加甲醇1 mL，超聲（功率：600 W，頻率：40 kHz，下同）處理5 min使溶解，用流動(dòng)相定容，搖勻，精密量取5 mL，置于50 mL量瓶中，用流動(dòng)相定容，搖勻，即得對(duì)照品貯備液；精密量取對(duì)照品貯備液5 mL，置于50 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液取樣品約10 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加甲醇1 mL，超聲處理5 min使溶解，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 系統(tǒng)適用性溶液取樣品約10 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加甲醇1 mL，超聲處理5 min使溶解，再加入“2.2.1”項(xiàng)下的對(duì)照品貯備液1 mL，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液取甲醇1 mL，置于10 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下陰性對(duì)照溶液、系統(tǒng)適用性溶液、對(duì)照品溶液和供試品溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，光學(xué)異構(gòu)體與雷替曲塞主成分峰之間能達(dá)到基線分離，分離度＞2.5；理論板數(shù)以光學(xué)異構(gòu)體峰計(jì)為8 226，保留時(shí)間為24.9 min。結(jié)果表明，其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液適量，分別用流動(dòng)相定量稀釋制成每1 mL中約含光學(xué)異構(gòu)體1.0、1.4、2.0、2.4、3.0、4.0 μg的系列對(duì)照品溶液。精密量取上述系列對(duì)照品溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以光學(xué)異構(gòu)體進(jìn)樣量（x，ng）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得光學(xué)異構(gòu)體回歸方程為y＝1 932.9x－27 462（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，光學(xué)異構(gòu)體檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍為99.68～398.7 ng。

2.5 定量限（LOQ）與檢測(cè)限（LOD）考察

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得LOQ為4.945 ng；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得LOD為1.648 ng。

2.6 精密度試驗(yàn)

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，光學(xué)異構(gòu)體峰面積的RSD＝0.41%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：20150101）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，光學(xué)異構(gòu)體峰面積的RSD＝0.73%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：20150101）適量，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算光學(xué)異構(gòu)體的含量。結(jié)果，光學(xué)異構(gòu)體含量的平均值為0.076‰，RSD＝0.62%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：20150101）約10 mg，精密稱定，共9份，分別置于10 mL量瓶中，各加入低、中、高質(zhì)量的光學(xué)異構(gòu)體對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.10 樣品中光學(xué)異構(gòu)體測(cè)定

取3批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算光學(xué)異構(gòu)體含量，并與國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)收載方法進(jìn)行結(jié)果比較[該標(biāo)準(zhǔn)中色譜柱為α-酸性糖蛋白鍵合硅膠色譜柱，流動(dòng)相為0.05 mol/L磷酸氫二鈉溶液（用稀磷酸調(diào)節(jié)pH為6.5）-異丙醇（98∶2，V/V），進(jìn)樣量為10 μL]，詳見(jiàn)表2（注：“-”為未檢出）。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

表2 樣品中光學(xué)異構(gòu)體測(cè)定結(jié)果（n＝3，%）Tab 2 Results of optical isomers determination in samples（n＝3，%）

3 討論

3.1 色譜柱及流動(dòng)相的選擇

[12-14]，采用CHIRALPAK AD-H手性色譜柱，該色譜柱以表面涂布直鏈淀粉-三（3，5-二甲苯基氨基甲酸酯）的硅膠為填料，對(duì)大多數(shù)消旋體均具有極高的手性識(shí)別能力。因此，選擇上述色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)。

考慮到雷替曲塞化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有2個(gè)羧基，加入一定濃度的有機(jī)酸調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH可以減弱手性固定相與主成分之間的分子間作用力，故加入酸性較強(qiáng)的三氟乙酸，從而可改善峰形，抑制色譜峰拖尾[11]。經(jīng)優(yōu)化，最終選用的流動(dòng)相為正己烷-無(wú)水乙醇-三氟乙酸（70∶30∶0.1，V/V/V）。

3.2 專屬性考察

破壞性試驗(yàn)中用到的酸、堿、強(qiáng)氧化劑等都屬水溶液，含水樣品進(jìn)入正相色譜系統(tǒng)中，對(duì)手性色譜柱填料會(huì)造成不可逆的破壞，故為避免色譜柱受損傷，未進(jìn)行破壞性試驗(yàn)相關(guān)研究。但在預(yù)試驗(yàn)中，筆者將起始物料、各步反應(yīng)中間體、已知工藝雜質(zhì)、降解雜質(zhì)和反應(yīng)粗品（含未知雜質(zhì)）等，與光學(xué)異構(gòu)體對(duì)照品按比例混合，進(jìn)行專屬性試驗(yàn)研究，考察各雜質(zhì)與光學(xué)異構(gòu)體峰之間的分離度是否符合要求。結(jié)果，各雜質(zhì)在光學(xué)異構(gòu)體保留時(shí)間處均未出峰，在二極管陣列檢測(cè)器中顯示，各溶液中光學(xué)異構(gòu)體峰純度指數(shù)均＞0.998。說(shuō)明各有關(guān)物質(zhì)對(duì)光學(xué)異構(gòu)體的檢測(cè)無(wú)干擾，本法專屬性良好。

綜上所述，改進(jìn)后的方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好，可用于測(cè)定雷替曲塞原料藥中的光學(xué)異構(gòu)體。

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Determination of Optical Isomers in Raltitrexed Raw Material by Modified HPLC

DAI Rong1，XU Jiagen2，DIAO Yanzhong3（1.Dept.of Pharmacy，Obstetrics and Gynecology Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Nanjing 210004，China；2.Dept.of Pharmacy，Stomatological Hospital Affiliated to Medical College of Nanjing University，Nanjing 210008，China；3.Nanjing YOKO Pharmaceutical Group Co.，Ltd.，Nanjing 210009，China）

OBJECTIVE：To improve HPLC method for determining optical isomers in raltitrexed raw material.METHODS：After improved，the column was CHIRALPAK AD-H with mobile phase consisted of n-hexane-anhydrous ethanol-trifluoroacetate（70∶30∶0.1，V/V/V）.The sample size was 100 μL.The flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 226 nm，and column temperature was 35℃.RESULTS：The linear range of optical isomers was 99.68-398.7 ng（r＝0.999 9）.The quantitation limit was 4.945 ng，and detection limit was 1.648 ng.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 1.0%；the recoveries ranged 99.43%-100.14%（RSD＝0.25%，n＝9）.CONCLUSIONS：The optimized method is simple，accurate，sensitive and reproducible，which can be used for the determination of optical isomers in raltitrexed raw material.

Raltitrexed raw material；Optical isomers；HPLC；Method improvement

R917

A

1001-0408（2017）30-4295-03

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.30.32

＊副主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)、藥物分析。電話：025-52226272。E-mail：rongdai88@126.com

#通信作者：副主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)、藥物分析。電話：025-83620369。E-mail：Xjg.234@163.com

2017-05-28

2017-07-28）

（編輯：劉柳）